“Global” assays of hemostasis in modern obstetrical practice

Full Text

Беременность — физиологическое состояние гиперкоагуляции с увеличением коагулянтного потенциала крови соответственно сроку беременности [1–3]. Однако если беременность осложняется различными гипертензионными состояниями, например преэклампсией, в системе гемостаза возникает дисбаланс: на фоне увеличения активности коагуляционного звена происходит истощение факторов противосвёртывающей системы с дисфункцией фибринолитической системы. Все эти изменения создают патогенетическую основу для возникновения тяжёлых тромбогеморрагических осложнений, смертельно опасных не только для матери, но и для плода [4–6]. В свете этого своевременное выявление данных нарушений — важная задача современного акушерства.

В исследовании системы гемостаза сформированы следующие принципы. На первом этапе применяют скрининговые методы диагностики: определяют время кровотечения, количество тромбоцитов, активированное частичное тромбопластиновое время, тромбиновое время, концентрацию фибриногена, D-димера. На втором этапе обследования проводят уточняющие тесты для более детального исследования: исследование агрегации тромбоцитов с различными индукторами (аденозиндифосфатом, коллагеном, ристомицином), активности фактора Виллебранда, активности факторов свёртывающей, противосвёртывающей и фибринолитической систем, выявление волчаночного антикоагулянта и многие другие тесты [7, 8].

Информативность любого гемостазиологического теста зависит от правильности соблюдения преаналитического этапа. Быстрый забор крови шприцем приводит к вспениванию, что способствует активации тромбоцитов и факторов коагуляционного звена. Медленный забор крови, особенно с длительной компрессией жгутом, способствует чрезмерной активации системы фибринолиза с одной стороны, а с другой — необратимой активации факторов свёртывания [8, 9].

К сожалению, даже при правильном соблюдении преаналитического этапа используемые скрининговые тесты диагностики состояния системы гемостаза в реалии дают крайне ограниченную информацию о её функционировании по целому ряду причин:
– тесты не чувствительны к явлениям гиперкоагуляции, а также к умеренной гипокоагуляции;
– исследования не позволяют в полной мере оценить динамику процесса коагуляции для каждого конкретного пациента в режиме реального времени;
– отсутствие стандартизации результатов тестов делает порой невозможной интерпретацию результатов одноимённых тестов при выполнении их с реактивами различных фирм.

Кроме того, в качестве активатора используют вещества, концентрации которых превышают таковые в организме человека в десятки раз [9–11].

По этим причинам в последнее время возрос интерес к так называемым «глобальным» методам изучения состояния системы гемостаза, потому что возник дисбаланс между пониманием физиологии процесса свёртывания и данными стандартных коагулологических исследований. Наиболее значимые из них — тест генерации тромбина, тромбоэластография (ТЭГ), низкочастотная пьезотромбоэластография (НПТЭГ) и тромбодинамика [11–14].

Тест генерации тромбина впервые был предложен в 1953 г. R. Macfarlane и R. Biggs для оценки состояния системы гемостаза у больных гемофилией, его проводили с цельной кровью. Позже, группа учёных под руководством Н. Hemker в 1990 г. переработала методику проведения теста, автоматизировала учёт ­образования тромбина в нескольких образцах плазмы крови [11, 13, 15, 16].

Принцип теста генерации тромбина заключается в определении количества тромбина (в нмоль), который образуется при рекальцификации цитратной плазмы крови в присутствии фиксированной концентрации тканевого фактора и флюорогенного субстрата. С помощью флюориметра и компьютерной обработки данных за определённый отрезок времени измеряют площадь кривой генерации тромбина, имеющей восходящую часть, участок достижения максимума и нисходящую часть, характеризующую инактивацию этого фермента [15].

В качестве активатора свёртывания используют тканевой фактор человека и отрицательно заряжённые фосфолипиды. После инкубации смеси при температуре +37 °C в лунку вносят буфер, содержащий ионизированный кальций и флюорогенный субстрат (Z-Gly-Gly-Arg-AMC). Образующийся тромбин расщепляет субстрат, в результате чего высвобождается флюорофор. Его излучение регистрируют через равные промежутки времени, причём его интенсивность прямо пропорциональна концентрации образовавшегося тромбина, кривую генерации которого отмечают на графике [15, 17].

В кривой генерации тромбина учитывают следующие показатели [15, 18]:
– lag time (время запаздывания, мин) — время, измеренное от внесения смеси флюорогенного субстрата с ионизированным кальцием в лунку с образцом плазмы крови и активатором до момента значимого отклонения сигнала;
– peak thrombin (пиковая концентрация тромбина, нмоль) — максимальная концентрация тромбина в единицу времени;
– time to peak/ttpeak (время достижения пика тромбина, мин) — время, за которое достигается максимальная концентрация тромбина;
– ETP — endogenus thrombin potential (эндогенный тромбиновый потенциал, нмоль×мин) — площадь под кривой генерации тромбина, учитывающей особенности инактивации этого фермента.

Величина пика активного тромбина оказалась независимым показателем риска рецидива тромбоэмболии у пациентов, отказавшихся от непрямой антикоагулянтной терапии. Вероятность повторного тромбоза в данных работах параллельно оценивали по уровню D-димеров. Определено, что значение активности генерируемого тромбина превосходило по прогностической значимости количественное определение D-димеров [15, 18, 19].

Метод апробирован в акушерской практике с целью оценки состояния системы гемо­стаза при преэклампсии. Обнаружено, что при тяжёлой преэклампсии, особенно с ранним её началом, увеличивается тромботический потенциал по сравнению с нормально протекающей беременностью и беременностью с хронической артериальной гипертензией. Однако значимых различий в показателях теста генерации тромбина в I и II триместрах гестации у пациенток с развившейся в III триместре тяжёлой преэклампсией по сравнению со здоровыми беременными обнаружено не было [20].

Тест генерации тромбина применён для оценки системы гемостаза при неудачах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Выявлена связь между «неудачами» ЭКО и повышенной генерацией тромбина. При этом показатели «стандартной» коагулограммы не отличались от нормальных значений. Следует отметить, что наличие гипертромбинемии определяется ещё до пункции фолликулов [21].

Тест генерации тромбина имеет ряд недостатков, связанных со стандартизацией анализа. В частности, он весьма чувствителен к предварительно-аналитическому этапу подготовки образца, в том числе методу сбора, характеру материала пробирки, использованного антикоагулянта и аналитических показателей (уровня тканевого фактора, концентрации липидов, наличия хилёза). Результаты теста могут различаться даже в условиях одной и той же лаборатории [11, 13, 14].

ТЭГ позволяет провести быструю и надёжную оценку сгустка, используя минимальное количество цельной крови. Впервые метод был апробирован при трансплантации печени, позднее — при сердечной недостаточности, сепсисе, различных травмах, а также для оценки эффективности применения антикоагулянтов. В акушерской практике метод применяли для оценки дефицита факторов системы гемостаза и контроля проводимой инфузионной терапии при кровотечениях [11, 21–24].

В основе метода лежит оценка увеличения вязкости крови по мере образования сгустка с одновременной регистрацией данного процесса [11, 13, 23]. Для проведения анализа необходим образец цитратной крови, взятый из вены. Принцип метода заключается в инкубации 360 мкл цельной крови при 37 °С в нагретой цилиндрической кювете, которая колеблется в течение 10 с под углом 4°45’ в чаше со штифтом, свободно подвешенным и соединённым с проводом [9, 11, 22]. На основе полученных данных производится расчёт ­параметров, ­которые ­оценивают качество, время образования и лизиса сгустка. Процесс образования сгустка с последующим его лизисом регистрируется графически через преобразователь [9, 11, 22].

Существует несколько модификаций ТЭГ, применяемых для более полной оценки состояния системы гемостаза [22].

– INTEM: в качестве активатора свёртывания используют эллагиновую кислоту. Применяют для оценки активности факторов XII, XI, IX, VIII, X, V, II, I и Виллебранда.

– EXTEM: в качестве активатора используют тромбопластин или тканевой фактор, полученный из мозга кролика. Он наиболее чувствителен к фибринолизу. Скрининг-тест для определения активности факторов внешнего пути свёртывания (K-зависимые факторы: II, VII, IX, X).

– FIBTEM: активатор свёртывания тот же, что и при EXTEM. Добавление цитохалазина D способствует ингибированию активности тромбоцитов, позволяя оценить изолированно активацию фибриногена. Параметры образовавшегося сгустка зависят только от количества образовавшегося фибрина.

– HEPTEM: активатор свёртывания тот же, что и при INTEM. Добавление гепариназы способствует инактивации гепарина в образце. Модификацию используют для дифференциации гипокоагуляции, вызванной гепарином.

– APTEM: активатор свёртывания тот же, что и при EXTEM. В данной модификации в образец добавляют апротинин, который ингибирует фибринолиз [22].

Метод апробирован с целью выявления гипокоагуляционных изменений у беременных, получающих низкомолекулярные гепарины, и коррекции их дозы: по данным ТЭГ выявлены гипокоагуляционные изменения, при этом показатели стандартной коагулограммы были в пределах нормальных значений [24].

ТЭГ также применена для оценки и коррекции коагуляционных нарушений при остром жировом гепатозе беременных. При этом по данным стандартной коагулограммы выявлены снижение уровня фибриногена, увеличение международного нормализованного отношения, в общеклиническом анализе крови — тромбоцитопения, что требовало введения криопреципитата, свежезамороженной плазмы и тромбоцитарной массы. Однако по данным ТЭГ выявлена тяжёлая кинетическая и структурная гипокоагуляция с вторичной гипофибриногенемией на фоне дефицита факторов свёртывания, что требует введения концентрата фибриногена и факторов свёртывания [25]. Кроме того, ТЭГ служит оптимальным методом оценки гемостаза при кровотечениях [19].

Метод не лишён ряда недостатков, основной из которых — проблема стандартизации, активно обсуждаемая в литературе. Проведённые недавно исследования продемонстрировали возможность взаимозаменения между реактивами одной и той же фирмы. Тем не менее, остаётся открытым вопрос об оценке надёжности результатов. Чтобы увеличить надёжность результатов, необходимы несколько ежедневных калибровок и обученный персонал [11, 13, 21]. Кроме того, отечественными и зарубежными исследователями выделены и другие недостатки данного метода [11, 13, 21, 24]:
– отсутствие изготовления приборов на территории нашей страны и высокая стоимость зарубежных приборов;
– недостаточная стандартизация исследо­ваний;
– отличный друг от друга спектр данных ТЭГ, используемых различными исследователями (от 4 до 20 показателей);
– недостаточная чувствительность метода при оценке основных звеньев системы гемостаза, особенно в случае функциональной гипоксии, гипокальциемии и гипотермии.

НПТЭГ. Принцип метода основан на регистрации изменения сопротивления исследуемой среды резонансным колебаниям иглы-резонатора, закреплённой на пьезоэлектрическом элементе и опущенной в кювету с кровью пациента [26–28]. Частота колебаний иглы в воздухе и жидкости поддерживается одинаковой автоматически. Объём исследуемой крови (0,6 мл) подобран эмпирически и содержит минимальную, но достаточную (как для качественной, так и для количественной оценки) концентрацию всех факторов, участвующих в изучаемом процессе гемокоагуляции и фибринолиза. По результатам полученной амплитуды строят график агрегантного состояния крови, по которому и оценивают состояние системы гемо­стаза [5, 11, 26–28].

В основу анализа графического изображения НПТЭГ положены изменения относительных значений вязкоупругих свойств крови, происходящие во время коагуляции, за период повреждения сосудистой стенки — достижение максимальной плотности сгустка в процессе его полимеризации и ретракции [26]. Динамика исследуемого процесса — переход крови в ходе коагуляции из жидкого состояния в твёрдо-эластичное — определяется изменениями агрегатного состояния крови и регистрируется в виде интегрированной кривой НПТЭГ, каждая точка которой (Ai) определяется состоянием системы в конкретный момент времени исследования (Тi) [27].

Метод НПТЭГ позволяет без предварительной пробоподготовки провести комплексную оценку всех звеньев гемокоагуляции в цельной крови пациентов. Он активно апробирован в кардиохирургической, травматологической и акушерско-гинекологической практике [27, 29–32].

При исследовании функционирования системы гемостаза методом НПТЭГ у беременных с преэклампсией обнаружена структурная гиперкоагуляция на фоне отсутствия реакции противосвёртывающей системы и системы фибринолиза [29, 32].

Тромбодинамика. Тест тромбодинамики предназначен для исследования in vitro пространственно-временной динамики свёртывания крови, инициированной локализованным активатором свёртывания в условиях, близких к условиям свёртывания крови in vivo. Для его проведения образцы плазмы крови помещают в каналы прозрачной измерительной кюветы, которая находится в водяном термостате. Затем в каналы кюветы вводят специальную вставку (активатор), на торце которой нанесено нанопокрытие с активатором свёртывания (тканевой фактор). Процесс возникновения и роста фибринового сгустка регистрируется цифровой видеокамерой в рассеянном свете. Полученная серия кадров даёт детальную информацию о динамике свёртывания крови во времени и пространстве [33–36].

Диагностические параметры тромбодинамики [33, 37]:
– Tlag (мин), лаг-тайм — время, которое проходит от момента контакта плазмы крови с активирующей поверхностью и до непосредственного начала роста сгустка;
– Cs (мкм) — размер сгустка на 30-й минуте;
– V (мкм/мин) — скорость роста сгустка, характеризует центральную фазу формирования сгустка — распространение свёртывания;
– Vi (мкм/мин), начальная скорость роста сгустка;
– Tsp (мин) — время появления спонтанных сгустков в объёме плазмы крови, характеризует собственный прокоагулянтный потенциал плазмы;
– D (усл. ед.) — плотность и размеры сгустка характеризуют структуру фибринового сгустка, концентрацию фибриногена в плазме крови и процесс роста сгустка в целом.

Тест тромбодинамики апробирован для оценки состояния коагуляционного звена системы гемостаза при беременности, осложнённой преэклампсией. Полученные данные свидетельствуют о том, что у беременных с тяжёлой преэклампсией выявлена наиболее выраженная гиперкоагуляция с увеличением скорости роста сгустка (V), повышением относительной плотности сгустка (D), появлением спонтанных сгустков (Tsp), в то же время отклонений от нормальных показателей стандартной коагулограммы выявлено не было. Вышесказанное позволяет рекомендовать основные показатели теста тромбодинамики в качестве дополнительного критерия показаний к родоразрешению при тяжёлой преэклампсии [38].

Таким образом, для оценки состояния системы гемостаза на первом этапе применяют скрининговые методы диагностики, которые просты в выполнении и служат ориентировочными. На втором этапе обследования используют уточняющие тесты, применяемые для более детального обследования, в том числе «глобальные» [7, 8].

Однако неправомочно говорить о том, что «глобальные» тесты способны заменить скрининговые и наоборот. Использование каждого должно быть по показаниям, диктуемым клинической ситуацией («в нужное время и в нужном месте») [39]. К примеру, с целью коррекции дозы низкомолекулярных гепаринов во время беременности возможно проведение ТЭГ, особенно при нормальных показателях стандартной коагулограммы. ТЭГ также оптимально использовать с целью выявления и коррекции нарушений в системе гемостаза при акушерских кровотечениях, при преэклампсии, особенно тяжёлой её форме. В решении вопроса о родоразрешении дополнительное значение может иметь метод тромбодинамики. Тест генерации тромбина можно использовать для обнаружения повышенной генерации тромбина, часто выявляемой при «неудачах» ЭКО [19, 21, 24, 25, 38].

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

I G Mustafin

Kazan State Medical University

Email: timka_rus@inbox.ru
SPIN-code: 1588-6988
Russian Federation, Kazan, Russia

T E Kurmanbaev

S.M. Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: timka_rus@inbox.ru
SPIN-code: 7818-6181
Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

A A Shmidt

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: timka_rus@inbox.ru
Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

Yu L Timoshkova

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: timka_rus@inbox.ru
Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

K M Atayants

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: timka_rus@inbox.ru
Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

References

Supplementary files