Evaluation of the state of tubular epithelium in low birth weight infants with ischemic ­nephropathy

Full Text

Патология маловесных новорождённых занимает немаловажное место среди причин перинатальной заболеваемости и смертности, а комплексное лечение таких детей значительно увеличивает социальные и экономические затраты [1].

Маловесные новорождённые представляют собой весьма важную проблему не только для современной перинатологии, но и для других специальностей, поскольку события, касающиеся внутриутробного развития плода, заявляют о себе через десятки лет. Длительное воздействие различных неблагоприятных факторов во внутриутробном периоде приводит в конечном счёте к суммарному нарушению общего развития плода и новорождённого, в последующем — и к изменению качества всей жизни, а в раннем неонатальном периоде наряду с другими видами патологии — также к нарушению функций почек [2].

Многие патологические факторы, влияющие на ребёнка во внутриутробном периоде, сами по себе или опосредованно нарушают функционирование почек новорождённого. К этим факторам относятся плохой экологический фон, наличие у матери заболеваний почек, тяжёлой эклампсии, угроза прерывания беременности, особенно в I триместре, а факторами риска у маловесного новорождённого, приводящими в конечном счёте к развитию острой почечной патологии, бывают гипотермия, гипоксия, задержка внутриутробного развития, внутриутробная инфекция, тяжёлая степень респираторного дистресс-синдрома, синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания и т.д. Совокупное воздействие этих факторов на фоне как функциональной, так и анатомической незрелости почек недоношенных новорождённых, приводит к нарушению гемодинамики и гипоперфузии почек, что обусловливает раннее развитие ишемической нефропатии (ИН) у этих детей [3].

Однако у новорождённых на 1-е сутки жизни диагностика ИН имеет определённые трудности вследствие неспецифичности признаков нефропатии, завуалированных анатомо-физиологическими особенностями почек и другими патологическими состояниями, часто развивающимися у маловесных новорождённых (тяжёлый респираторный дистресс-синдром, гипоксически-ишемическое поражение центральной нервной системы и т.д.), а известные в настоящее время биомаркёры поражения почек, не могут служить маркёрами повреждения непосредственно почечной ткани, так как они не являются органоспецифичными, и их уровень в крови может повышаться в ответ на патологию и других органов, а используемый многие годы в практике и служащий «золотым стандартом» нарушения функций почек уровень креатинина в крови неинформативен у новорождённых вследствие их малой массы и физиологической незрелости [2].

Таким образом, существующие традиционные методы исследования, обладая низкой информативностью, не отражают характер повреждения почек и затрудняют раннюю диагностику почечной патологии в неонатальном периоде, а при отсутствии своевременной и адекватной терапии способствуют хронизации процесса или же могут приводить к летальному исходу, и поиск новых, более информативных малоинвазивных диагностических маркёров, указывающих на развитие патологических процессов непосредственно в самой почечной ткани на доклинической стадии, — актуальная проблема [3].

KIM-1 (от англ. Kidney Injure Molecule-1) — молекула поражения почки. Этот трансмембранный гликопротеин не определяется в моче при здоровых почках, но синтезируется в очень высокой концентрации эпителиальными клетками проксимальных канальцев после ишемического повреждения, персистируя до полного восстановления функций канальцев. Наличие KIM-1 позволяет эпителиальным клеткам распознавать мёртвые клетки постишемической почки и участвовать в их утилизации. KIM-1 служит фосфатидилсериновым рецептором, распознающим апоптотические клетки, который трансформирует эпителиальные клетки проксимальных канальцев в «полупрофессиональные» фагоциты. Американская и Европейская ассоциации по контролю над медикаментами (FDA и EMEA) включили KIM-1 в ограниченный список маркёров почечного повреждения, используемых в протоколах создания новых лекарств [4].

NGAL (от англ. Neuthrophyl Gelatinase Associated Lipocalin) — ассоциированный с нейтрофильной желатиназой липокалин. Это белок массой 25 кДа, существует в виде мономера (в моче и нейтрофилах), гомо-, и гетеродимера, связан с матриксной металлопротеиназой-9. Экспрессируется в плазму крови многими органами при повреждении, например лёгкими и печенью, но ранний и резкий подъём уровня NGAL в моче и сыворотке крови отмечают при повреждении канальцев, связанном с ишемией, при острой почечной недостаточности за счёт острого тубулярного некроза или тубулоинтерстициальной нефропатии. Синтез NGAL эпителиальными клетками, в том числе и проксимальных канальцев, стимулируется при воспалении. NGAL секретируется в мочу толстой частью восходящей петли Генле и собирательными трубочками, где он выполняет функцию антибактериальной и антиокислительной защиты путём хелатирования железа [5].

Сывороточный цистатин С — эндогенный ингибитор цистеиновой протеиназы с низким молекулярным весом. Сывороточная концентрация цистатина С в отличие от креатинина не зависит от типа вскармливания, массы тела, пола и возраста. Концентрация этого вещества в крови зависит только от скорости клубочковой фильтрации, он не потребляется в метаболических процессах, и обменные процессы не влияют на его синтез. По этой причине как эндогенный биомаркёр почечных функций он ближе к идеалу и показывает лучшие результаты по сравнению с сывороточным креатинином [6].

Целью исследования было изучение диагностической значимости молекул KIM-1 и NGAL в моче и цистатина С в плазме крови у маловесных новорождённых с ИН.

150 новорождённых были разделены на три группы: первая группа — 72 ребёнка, перенёсших перинатальную асфиксию с проявлениями ИН (основная группа), вторая группа — 28 детей, перенёсших перинатальную асфиксию, но без проявлений ИН (группа сравнения), третья группа — 50 здоровых новорождённых (20 доношенных и 30 недоношенных, контрольная группа).

Критерии включения новорождённых в основную группу исследования:
– новорождённые с массой тела менее 2500 г при рождении (соответствующие гестационному возрасту и малые для гестационного возраста);
– новорождённые, перенёсшие анте- и интранальную гипоксию и асфиксию;
– новорождённые с клиническими проявлениями нарушения почечной функции

Критерии исключения из основной группы:
– врождённые пороки развития органов мочевыделительной системы;
– выявление хромосомных аномалий или подозрение на их наличие;
– инфекции органов мочевой системы;
– генерализованная инфекция (сепсис)

Группу сравнения (вторую группу) составили маловесные новорождённые с отягощённым акушерско-гинекологическим анамнезом, экстрагенитальной патологией, патологическим течением беременности и родов у матери, ведущим к развитию антенатальной гипоксии плода, но без поражения почек.

Контрольную группу, сформированную методом случайной выборки, составили 20 соматически здоровых доношенных и 30 условно здоровых недоношенных новорождённых с благоприятным течением анте- и интранатального периодов.

В зависимости от степени тяжести ИН новорождённые основной группы были разделены на три подгруппы согласно классификации ИН по степеням тяжести, предложенной Е.Н. Байбариной в 1999 г.: подгруппа 1А — 36 новорождённых с ИН 1-й степени тяжести, подгруппа 1Б — 20 новорождённых с ИH 2-й степени тяжести, подгруппа 1В — 16 новорождённых с ИН 3-й степени тяжести.

Для оценки состояния канальцевого эпителия мы определяли в моче новорождённых уровень молекул KIM-1 и NGAL, для определения состояния клубочковой фильтрации — содержание цистатина С в плазме крови.

Пробы мочи и крови для определения данных биомаркёров были собраны 2-кратно в 1–3-й и 7–10-й дни жизни. Мочу собирали с 6:00 до 9:00 ч, забор образцов крови проводили в середине данного временного промежутка времени из периферических вен (лучевой, ­локтевой) в количестве 2 мл.

Уровни биомаркёров определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, NGAL — с использованием набора реактивов компании RayBiotech, Inc (США), KIM-1 — с использованием набора реактивов компании Arqutus Medical, Bio Assay Works, а цистатин С в сыворотке крови — с использованием набора реактивов Human Cystatin C ELISA фирмы BioVendor (Чехия).

Статистическая обработка (накопление, корректировка, систематизация и визуализация) полученных результатов осуществлена при помощи стандартных программ математического и статистического анализа Microsoft Excel 2013 и SPSS 20.0 (Armonk, NY: IBM Corp.). Для сравнения полученных данных использовали методы непараметрического анализа с применением U-критерия Манна–Уитни. Полученные значения U-критерия Манна–Уитни сравнивали с табличными данными. В том случае, если рассчитанное значение U-критерия было равно критическому или меньше него, признавали статистическую значимость различий. Резко различающиеся цифры устраняли с использованием теста Fischer. Для изучения корреляционных связей между показателями использован тест ранговой корреляции Спирмена.

Исследование одобрено этическим комитетом Азербайджанского медицинского университета (протокол №7, от 27.07.2019).

Среди новорождённых из подгруппы 1А у 16 (44,4%) детей общее состояние оценено как тяжёлое, у 6 (16,6%) — как крайне тяжёлое. В среднетяжёлом состоянии родились 8 (22,2%), в удовлетворительном — 6 (16,6%) новорождённых. В подгруппе Б в состоянии средней тяжести родились 4 (20%) ребёнка, в тяжёлом и крайне тяжёлом — 12 (60%) и 4 (20%) соответственно. В подгруппе 1В среднетяжёлыми родились 2 (12,5%) новорождённых, тяжёлыми — 8 (50,0%), крайне тяжёлыми — 6 (37,5%) детей. В контрольной группе состояние большинства детей было оценено как удовлетворительное, только у 7 (23,3%) недоношенных новорождённых из подгруппы 2Б состояние было средней тяжести.

В раннем неонатальном периоде у 55 (76,3%) новорождённых основной группы было диагностировано перинатальное поражение центральной нервной системы. Церебральная ишемия 2-й степени тяжести была выявлена у 23 (31,9%) детей, церебральная ишемия 3-й степени — у 8 (11,1%) новорождённых основной группы. Интравентрикулярные кровоизлияния обнаружены у 15 (21,0%) новорождённых, из них 1-й степени — у 9 (12,5%) детей, у 5 (55,5%) из них они были двусторонними. Интравентрикулярные кровоизлияния 2-й степени диагностированы у 6 (8,3%) новорождённых. Токсико-метаболическое поражение центральной нервной системы установлено у 6 (8,3%) детей данной группы в виде билирубиновой энцефалопатии, у 3 (4,2%) детей выявлены внутричерепное кровоизлияние и церебральная ишемия сочетанно.

Геморрагическая болезнь новорождённого диагностирована у 2 (5,5%) детей подгруппы 1А, 2 (10,0%) — подгруппы 1Б, 1 (6,25%) — подгруппы 1В. Патология проявлялась в виде желудочно-кишечного кровотечения.

Анемия выявлена у 11 (30,3%) детей в подгруппе 1А, 7 (35,0%) — в подгруппе 1Б, 6 (37,5%) — в подгруппе 1В. Из них гипохромная анемия лёгкой степени установлена у 10 (13,8%), средней степени тяжести — у 7 (9,7%) новорождённых основной группы.

Синдром мекониальной аспирации присутствовал у 10 (13,8%) новорождённых основной группы.

С респираторным дистресс-синдромом родились 33 (45,8%) ребёнка основной группы.

Клинические проявления ИН у новорождённых основной группы включали отёчный синдром, олиго- и анурию, повышение концентрации креатинина и мочевины в крови, протеинурию и микрогематурию.

В подгруппе 1А ИН на 1-й неделе жизни проявлялась отёчным синдром 1-й степени, зарегистрированным у 23 (63,8%) новорождённых, незначительным снижением диуреза (1,36±0,06 мл/кг в сутки) при нормальных значениях креатинина (0,72±0,02 мг/дл) и мочевины на 1-е сутки жизни и достоверно высоких в динамике раннего неонатального периода (1,20±0,02 и 30,4±2,02 мг/дл соответственно, p <0,01). Протеинурия выявлялась с первых дней жизни (0,21±0,03 г/л) и регистрировалась у 14 (36,8%), а микрогематурия — у 10 (27,5%) новорождённых подгруппы 1А. Скорость клубочковой фильтрации была снижена на 37,7% по сравнению с контрольной группой (p <0,05).

У новорождённых с ИН 2-й степени также отмечено снижение диуреза, но эта разница не имела статистической значимости (1,28±0,06 мл/кг в сутки), показатели креатинина были в пределах нормальных значений в 1-е сутки (0,86±0,03 мг/дл) и достоверно высокими на 7–10-е сутки (1,94±0,05 мг/дл, p <0,01), а показатели мочевины — высокими как в 1-е сутки жизни, так и в динамике (16,8±1,77 и 42,0±2,05 мг/дл соответственно). Отёчный синдром 1–2-й степени присутствовал с 1-х суток жизни и усиливался в динамике. У 8 (40,0%) детей была выявлена протеинурия (0,30±0,02 г/л), у 7 (35,0%) — микрогематурия. Скорость клубочковой фильтрации была снижена на 56,6% по отношению к контрольной группе (p <0,005).

В подгруппе 1В основной группы ИН 3-й степени характеризовалась достоверно низким диурезом как на 1–3-и (1,09±0,05 мл/кг в сутки, p <0,01), так и 7–10-е сутки (3,86±0,17 мл/кг в сутки, p <0,01), отёчным синдромом 2–3-й степени, который нарастал на высоте олигурии, высокими уровнями креатинина на 7–10-е сутки жизни (2,64±0,06 мг/дл, p <0,01) и мочевины в крови с 1-х суток жизни и в динамике (17,4±2,12 и 54,0±2,44 мг/дл соответственно, p <0,01), протеинурией (0,34±0,03 г/л) и микрогематурией, низкой скоростью клубочковой фильтрации (сниженной на 71,4%, p <0,005).

У новорождённых подгруппы 1А с ИН 1-й степени тяжести на 1–3-й день жизни средний уровень KIM-1 в моче составлял 1,06±0,08 нг/дл (р <0,001), во 2-й подгруппе — 1,12±0,04 нг/дл (р <0,001), а с ИН 3-й степени тяжести (подгруппы 1В) — 1,18±0,10 нг/дл (р <0,001), что достоверно отличалось от значения данного показателя у здоровых детей (контрольной группы) и новорождённых группы сравнения.

В последующие дни жизни (7–10-й день) уровень KIM-1 в моче в подгруппе 1А несколько снизился до 0,98±0,09 нг/дл, что было в 4 раза выше, чем в группе контроля. На 7–10-й день жизни уровень KIM-1 в моче у детей с ИН 2-й и 3-й степеней тяжести (подгруппы 1Б и 1В) в отличие от подгруппы 1А повысился и составил соответственно 1,24±0,10 и 1,36±0,12 нг/дл (р <0,001) — по сравнению со значениями данного показателя здоровых детей (контрольной группы) и группы сравнения.

Некоторое снижение в динамике уровня KIM-1 в моче у новорождённых подгруппы 1А указывает на возможный транзиторный характер ишемического повреждения канальцев почек у детей с лёгкой степенью ИН, а достоверное повышение его концентрации у детей подгрупп 1Б и 1В позволяет судить о тяжести и глубине поражения канальцевого эпителия у детей со средней и тяжёлой степенями ИН (табл. 1).

Содержание молекул NGAL в моче на 1–3-й день жизни у новорождённых с ИН 1-й степени тяжести (подгруппа 1А) составило 154±14,6 нг/мл (р <0,001), с ИН 2-й степени (подгруппа 1Б) — 176±15,0 нг/мл (р <0,001), с ИН 3-й степени тяжести (подгруппа 1В) — 190±18,4 нг/мл (р <0,001), что достоверно отличалось от значения данного показателя у здоровых детей (90,3±9,4 нг/мл) и новорождённых группы сравнения (86,4±6,8 нг/мл).

Кроме того, у новорождённых с тяжёлой степенью ИН в 1-е сутки жизни уровень мочевой концентрации NGAL был достоверно выше по сравнению с детьми с лёгкой степенью поражения почек (р=0,018), что свидетельствует о его высокой диагностической и прогностической ценности как раннего биомаркёра для определения степени ишемического повреждения почек у новорождённых. Это совпадает с исследованиями, проведёнными M.Y. Oncel и соавт. [7], а также Sarafidis и соавт. [8], которые наблюдали достоверное повышения содержания NGAL в моче у новорождённых, перенёсших перинатальную асфиксию в 1-е сутки жизни, — по сравнению с контрольной группой.

На 7–10-й день жизни среднее содержание NGAL в моче у детей с ИН 1-й степени тяжести снизилось до 142±10,2 нг/мл (р <0,001), с ИН 2-й степени — до 164±12,6 нг/мл (р <0,001), с ИН 3-й степени тяжести — до 170±15,0 нг/мл (р <0,001), оставаясь достоверно высоким по сравнению со значением NGAL у здоровых детей и детей группы сравнения (табл. 2).

При изучении корреляционных связей между вышеизложенными биомаркёрами и степенью тяжести ИН было установлено, что у обследованных новорождённых всех трёх подгрупп основной группы на 1–3-и сутки жизни уровень NGAL в моче находился в прямой корреляционной связи со степенью тяжести ИН (r=0,288; p=0,014). В отличие от NGAL, несмотря на достоверное повышение концентрации KIM-1 в моче, на 1–3-и сутки между показателями KIM-1 и степенью тяжести ИН достоверной корреляционной связи не отмечено (r=0,068; p=0,573). Однако в динамике на 7–10-е сутки жизни, несмотря на то обстоятельство что, в моче новорождённых подгруппы 1А концентрация KIM-1 имеет тенденцию к снижению, между показателями как KIM-1 (r=0,620; p=0,000), так и NGAL (r=0,399; p=0,001) в моче и степенями тяжести ИН была прямая корреляционная связь.

Таким образом, у маловесных новорождённых с ИН различных степеней тяжести концентрации NGAL и KIM-1 повышаются на 1-е сутки жизни (p=0,001) что свидетельствует о повреждении эпителия канальцев почек уже в первые часы после ишемии, так как ни NGAL, ни KIM-1 не экспрессируются в мочу при нормальных почках, а высокие их концентрации в динамике (p=0,001) на 7–10-е сутки указывают на степень тяжести и продолжительность ишемического повреждения почек. Наши исследования совпадают с недавними исследованиями, проведёнными Hongzhu Lu и соавт., которые проверяли уровни этих биомаркёров в моче у недоношенных новорождённых с острым повреждением почек и также наблюдали резкий и ранний подъём уровня KIM-1 и NGAL в моче при нормальной концентрации креатинина в плазме крови [9].

При анализе содержания цистатина C в подгруппах с различной степенью ИН (табл. 3) выявлено его увеличение в подгруппе 1В относительно как 1А (р <0,001), так и 1Б (р=0,002), в первые дни после рождения, что указывает на выраженное снижение фильтрационных возможностей почечных клубочков у данной категории новорождённых. Хотя в подгруппе 1Б уровень цистатина С и превышал значения этого показателя в подгруппе 1А, статистической значимости эта разница не имела (р=0,901). При сравнении этих показателей с данными группы сравнения и контрольной группы достоверное различие обнаружено лишь по отношению к новорождённым подгруппы 1В (р <0,001). Достоверных отличий уровня цистатина C при сравнении показателей контрольной группы и группы сравнения с таковым в подгруппах 1А и 1Б не обнаружено (р >0,05; см. табл. 3).

В динамике неонатального периода концентрация данного вещества снижается в изучаемых группах, за исключением новорождённых, входящих в подгруппу 1Б. При этом ­наиболее высокие значения этого вещества ­сохраняются в группе детей с тяжёлой степенью нефропатии, достоверно отличаясь от показателей новорождённых с 1-й степенью ИН и детей группы сравнения (р=0,001 по отношению к подгруппе 1А, р=0,002 по отношению к группе ­сравнения).

Результаты наших исследований позволяют предположить, что поражение тубулярного аппарата имеет выраженный характер при всех степенях ИН, в то время как снижение фильтрационных способностей клубочкового аппарата происходит лишь при тяжёлой степени поражения. Это совпадает с мнением T.M. El-Gammacy и соавт. [10], которые наблюдали статистически значимое повышение концентрации цистатина C в плазме крови у недоношенных новорождённых лишь с тяжёлой степенью респираторного дистресс синдрома.

Другой же автор (M.A. El-Gamasy) в более ранней работе отмечает подъём уровня цистатина C в плазме крови у доношенных новорождённых с острым повреждением почек как в 1-е сутки, так и в динамике, и предлагает использовать данный биомаркёр как ранний предиктор неонатального острого повреждения почек у новорождённых в условиях отделения реанимации и интенсивной терапии [11].

Результаты нашей работы не позволяют согласиться с этим мнением, так как статистически значимое повышение по сравнению с контролем (р <0,05) на 1-е сутки жизни было выявлено только у новорождённых с тяжёлой степенью ИН, что противоречит мнению о высокой диагностической и прогностической ценности цистатина C как раннего маркёра почечного повреждения.

Несмотря на существующие мнения о том, что канальцевый аппарат почек новорождённых лучше защищён от повреждающего действия гипоксии и фактически только фильтрацией отвечает на любые изменения гемодинамики и гипоксию, наши исследования выявили значительную уязвимость канальцевого эпителия, что совпадает с утверждениями В.Л. Зеленцевой о превалировании канальцевых нарушений, приводящих к снижению фильтрации лишь в конечной стадии на фоне некроза тубулярного эпителия [12, 13].

Таким образом, у маловесных новорождённых с ИН в патологическом процессе повреждается гломерулярный и канальцевый аппарат почек. При этом в отличие от клубочковой фильтрации поражение канальцевого эпителия имеет более выраженный и пролонгированный характер. По-видимому, низкая масса тела, меньшая зрелость при рождении и более интенсивный характер развития в раннем постнатальном периоде способствуют большей подверженности канальцевого эпителия гипоксии. Высокий уровень в моче молекул KIM-1 и NGAL с первых дней постнатального периода, сохраняющийся до 10-х суток жизни, указывает на стойкость поражения тубулярного аппарата маловесных новорождённых, перенёсших перинатальную гипоксию [13].

Основываясь на результатах статистического сравнительного анализа, наличии корреляционных связей между уровнями NGAL и KIM-1 в моче и степенями тяжести ИН, достоверно высокой концентрации NGAL на 1-е сутки жизни и в динамике в подгруппах маловесных новорождённых с поражением почек, можно предположить, что NGAL служит наиболее чувствительным и ранним маркёром ишемического повреждения почек у маловесных новорождённых, перенёсших перинатальную гипоксию. Кроме того, достоверное повышение уровня KIM-1 на 1-е сутки и его персистирование в высоких титрах к концу раннего неонатального периода при тяжёлых степенях ИН указывают на высокую диагностическую ценность KIM-1 при определении степени ИН.

Однако, в отличие от NGAL и KIM-1, цистатин C не может служить ранним предиктором поражения почек у маловесных новорождённых с ИН, так как его уровень в крови достоверно повышается лишь при тяжёлой стадии повреждения, при поражении уже непосредственно клубочкового аппарата и нарушении фильтрационной способности почек.

Полученные результаты позволяют предположить, что использование биомаркёров повреждения почек NGAL и KIM-1 целесо­образно для выявления поражения почек на ранней, доклинической стадии ИН у маловесных новорождённых, перенёсших перинатальную асфиксию, и даёт возможность предотвратить дальнейшее развитие процесса, наладив комплекс лечебно-профилактических мер: адекватную и своевременную инфузионную терапию с целью улучшения перфузии почек, ограничение использования нефротоксических препаратов. Всё это в конечном счёте поможет снизить заболеваемость и смертность маловесных новорождённых в раннем неонатальном периоде, предотвратить переход ИН новорождённых в хроническую форму заболевания в последующие годы жизни.

Выводы

1. Молекулы NGAL служат наиболее чувствительным и ранним биомаркёром ишемического повреждения почек у маловесных новорождённых, перенёсших перинатальную гипоксию.

2. Высокий уровень молекул KIM-1 в моче у маловесных новорождённых с ишемической нефропатией на 1-е сутки жизни и его персистирование в высоких титрах к концу раннего неонатального периода при тяжёлой степени заболевания указывают на высокую диагностическую ценность содержания KIM-1 для определения степени ишемической нефропатии.

3. Цистатин C не может служить ранним предиктором поражения почек у маловесных новорождённых с ишемической нефропатией, так как его уровень в крови достоверно повышается только при тяжёлой стадии повреждения.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

A A Akhundova

Author for correspondence.
Email: nauchnayastatya@yandex.ru
Azerbaijan, Baku, Azerbaijan

References

Supplementary files