Влияние эндокринных дизрапторов бисфенола А и триклозана на качество спермы у мужчин и экспериментальных животных

Аннотация

Ключевые слова

Вопросы охраны здоровья мужчин в России сегодня становятся наиболее актуальными, поскольку здоровье мужчин выступает значимым показателем демографического, трудового и оборонного потенциала нации.

С позиции холистического подхода мужской фактор бесплодия — интегральный показатель нездоровья мужчины репродуктивного возраста и лимитирующий фактор суммарного коэффициента рождаемости в популяции. При этом качество эякулята следует рассматривать как фундаментальный биомаркёр мужского здоровья [1–4].

Известно, что доля мужского фактора бесплодия составляет не менее 50% [5]. В литературе обсуждают следующие возможные причины мужского бесплодия неизвестной этиологии, на долю которого приходится не менее 30%: активные формы кислорода, генетические, эпигенетические факторы и эндокринные дизрапторы [5].

В 1993 г. впервые в литературу был введён термин «эндокринные дизрапторы» (эндокринные дизрегуляторы, гормоноподобные ксенобиотики), к которым были отнесены химические соединения, способные нарушать функции эндокринной системы [6]. На сегодняшний день значение эндокринных дизрапторов в регуляции деятельности систем жизнеобеспечения и размножения изучено не до конца.

К наиболее известным нестойким убиквитарным эндокринным дизрапторам относятся фталаты, бисфенол А и триклозан.

Бисфенол А и триклозан человек широко использует в повседневной жизни, поэтому его обнаруживают в образцах мочи в 100 и 93% случаев соответственно [7].

Бисфенол А входит в состав полимерных материалов, которые применяют для производства широчайшего круга изделий: детских игрушек, пластиковых контейнеров, упаковки для продуктов питания и напитков, материалов для зубных пломб, деталей для автомобилей и др. Загрязнение продуктов питания и питьевой воды происходит за счёт миграции бисфенола А из материалов упаковки, пластиковых бутылок и внутреннего покрытия консерв­-
ных банок.

Источником триклозана становятся средства личной гигиены: дезодоранты, зубная паста, крем для бритья, жидкость для полоскания рта, косметика, мыло для рук, а также бытовые чистящие средства. В организм человека триклозан попадает главным образом через кожу и желудочно-кишечный тракт, его можно обнаружить в различных биологических жидкостях и тканях организма.

Содержание бисфенола А и триклозана главным образом определяют в моче, крови и материнском молоке. Однако, как показали T. Geens и соавт. [8], бисфенол А и триклозан неодинаково накапливаются в тканях организма человека, поэтому мониторинг их концентрации по образцам мочи не может отражать истинного влияния ксенобиотиков на функционирование репродуктивных органов.

Цель исследования — установить связь между концентрацией эндокринных дизрапторов (бисфенола А, триклозана в тканях яичка или семенной жидкости) и качеством спермы у мужчин и экспериментальных животных.

В обсервационном одноцентровом одномоментном (поперечном) исследовании, которое было проведено в ООО «ДНК клинике» (Челябинск) с ноября 2017 г. по июнь 2018 г. приняли участие 53 мужчины (средний возраст 30,8±3,6 года). Пациенты обратились в клинику для выполнения спермиологического анализа в связи с бесплодием в браке, невынашиванием беременности партнёршей, а также планированием беременности или донорством спермы.

При оценке качества 53 образцов эякулята мужчины были разделены на две группы: первая (n=19) — мужчины с нормозооспермией, планирующие беременность в супружеской паре, и доноры спермы; вторая группа (n=34) — мужчины с патозооспермией, идиопатической формой бесплодия сопоставимые по возрасту, индексу массы тела, абстиненции, курению и приёму алкоголя.

Спермиологическое исследование проводили согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ; 2010) с учётом оценки количества сперматозоидов, их подвижности и морфологии, а также индекса фрагментации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) сперматозоидов [9]. Заключение по спермограмме (нормозооспермия или патозооспермия) было основано на критериях, изложенных в тех же рекомендациях ВОЗ (2010) [9].

Для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов использовали метод дисперсии хроматина спермы с помощью набора Gold Cyto DNA Assist Kit (laboratories AG, Германия). Нормативным значением степени фрагментации ДНК сперматозоидов считали 15% и менее (низкий риск нарушения фертильности).

Бисфенол А и триклозан в семенной жидкости определяли на газовом хроматографе с масс-спектрометром Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Corporation, Япония). Данные обрабатывали с помощью программы GCMSsolution 4,3 (Shimadzu Corporation, Япония).

Экспериментальная часть работы выполнена на белых половозрелых лабораторных крысах-самцах линии Вистар с массой тела 150–193 г (всего 28 животных). Крысы были разделены на три рандомизированные группы (контроль и две испытуемые группы). Крысы первой испытуемой группы (n=10) получали бисфенол А, крысы второй испытуемой группы (n=8) получали триклозан. Контрольную группу составили интактные животные в количестве 10 особей. Подопытные животные в течение 2 мес ежедневно получали с пищей бисфенол А и триклозан со степенью гомогенности >97% (Sigma-Aldrich, США) в количестве 200 мг/кг [10, 11].

Работа с лабораторными животными выполнена в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1977).

После взвешивания семенников зрелые сперматозоиды получали из придатка семенника, разрезая его вдоль в среде дозированного количества 5% раствора декстрозы (глюкозы в объеме 1 мл), предварительно подогретого до 37° С. Затем отрезком отмытой резиновой трубки эпидидимис активно перемещали в течение 2 мин для освобождения от части сперматозоидов. В полученной эпидидимальной суспензии определяли суммарное содержание сперматозоидов в 1 мл [12].

В камере Горяева подсчитывали сперматозоиды с учётом характера их подвижности. Подвижность сперматозоидов определяли по общепринятой методике 4-балльной оценки сперматозоидов по характеру подвижности [13]:
0) неподвижные;
1) «дергающиеся» (колебательное местное движение, когда есть движение хвоста, но не происходит перемещения сперматозоидов, либо движение по круговой траектории);
2) слабо подвижные (медленное прямолинейное движение);
3) прогрессивно подвижные (поступательное движение со спиральным вращением вокруг своей оси) сперматозоиды.

Для оценки патологических форм сперматозоидов смешивали часть полученной суспензии с 1% раствором эозина Y в соотношении 1:10. Затем через 30 мин готовили мазки, которые после просушивания на воздухе фиксировали метиловым спиртом и подвергали микроскопии [14]. Подсчитывали на 200 клеток процентное содержание сперматозоидов с дефектами головки, шейки, тела и хвоста.

Для оценки концентрации исследуемых эндокринных дизрапторов в тканях яичек левое яичко было полностью гомогенизировано в стеклянно-тефлоновом гомогенизаторе, а затем подвергнуто центрифугированию при 700 g в течение 10 мин при температуре 4° С, чтобы удалить детрит и ядра. Образовавшаяся в результате надосадочная жидкость была использована для определения концентрации бисфенола А и триклозана методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией.

Исследование одобрено 21.11.2017 локальным комитетом по этике Южно-Уральского государственного медицинского университета (г. Челябинск), выписка из протокола №9.

Размер выборок предварительно не рассчитывали.

Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью программы IBM SPSS Statistics v. 21 (IBM Corp., Armonk, NY, США). Проверка нормальности распределения переменных проведена с учётом объёма выборки с использованием критерия Колмогорова–Смирнова или Шапиро–Уилка. Результаты исследования представлены как медиана с интерквартильным размахом Me (Q₁; Q₃) или как средняя величина со стандартным отклонением (M±σ) при нормальном распределении. Для определения статистически значимых различий между группами использовали U-критерий Манна–Уитни. Для установления связи между показателями вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Различия между группами считали статистически значимыми при р <0,05.

Характеристика пациентов, вошедших в исследование, была следующей: средний возраст (±σ) составил 30,8±3,6 года, средний индекс массы тела (±σ) — 25,4±2,9 кг/м². При этом 42% мужчин были с избыточной массой тела (индекс массы тела 25–30 кг/м²), 11% — с ожирением I степени (индекс массы тела >30 кг/м²).

Группы сравнительного анализа были сопоставимы по возрасту, периоду воздержания от семяизвержений, индексу массы тела, курению и приёму алкоголя (табл. 1).

Таблица 1. Сопоставление групп по возрасту, индексу массы тела, периоду воздержания, статусу курения и употребления алкоголя

При этом частота патозооспермии среди курящих и употребляющих алкоголь составила 53,8 и 55,6%, среди некурящих и не употребляющих алкоголь — 56,0 и 55,6% соответственно (см. табл. 1)

В 100 и 84,9% образцов эякулята были обнаружены бисфенол А и триклозан со средней концентрацией 0,15 (0,06–0,31) нг/мл и 0,13 (0,05–0,22) нг/мл соответственно. Группа мужчин с патозооспермией (64%) была представлена следующим образом: частота тератозооспермии — 30% (n=16), астенотератозооспермии — 22,5% (n=12), олиготератозооспермии — 7,5% (n=4), олигоастенотератозооспермии — 4% (n=2).

Группы пациентов, включённых в исследование, статистически значимо различались по концентрации бисфенола А и триклозана в семенной жидкости (р <0,001; р=0,045 соответственно), а также индексу фрагментации ДНК сперматозоидов (р=0,001; р=0,004 соответственно). Так, у мужчин с нормозооспермией концентрации бисфенола А и ­триклозана в семенной жидкости оказались меньше — 0,05 (0,04–0,08) нг/мл и 0,09 (­0,0–0,19) нг/мл, чем у мужчин с патозооспермией — 0,21 (0,14–0,47) нг/мл и 0,20 (0,11–0,36) нг/мл соответственно. То же самое было справедливо и в отношении индекса фрагментации ДНК сперматозоидов — 14,0 (8,5–17,0)% против 19,0 (16,0–25,0)% (рис. 1–3).

Рис. 1. Сравнение групп по концентрации бисфенола А (ВРА) в семенной жидкости

Рис. 2. Сравнение групп по концентрации триклозана (TCS) в семенной жидкости

Рис. 3. Сравнение групп по степени фрагментации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) сперматозоидов, %

Используя коэффициент ранговой корреляции Спирмена, между концентрацией бисфенола А, триклозаном в семенной жидкости и параметрами эякулята были обнаружены определенные корреляционные связи (табл. 2).

В экспериментальной части работы было выявлено, что различия между группами сравнения (опыт 1, опыт 2 и интактная) по концентрации бисфенола А и триклозана в тканях яичек были статистически значимыми (р <0,001). Полученные результаты убедительно свидетельствуют о снижении абсолютной массы яичка во второй испытуемой группе, подвергшейся воздействию триклозана, по сравнению с группой контроля, тогда как в первой группе, подвергшейся воздействию бисфенола А, снижение массы яичка не имело статистической значимости (р=0,001 и р=0,051 ­соответственно).

Первая испытуемая группа крыс, подвергшихся воздействию бисфенола А, продемонстрировала снижение концентрации сперматозоидов со снижением доли прогрессивно подвижных и увеличением доли слабо подвижных сперматозоидов на фоне увеличения доли их атипичных форм по сравнению с группой интактных животных (табл. 3).

Вторая опытная группа крыс, подвергшихся воздействию триклозана, показала снижение доли прогрессивно подвижных сперматозоидов и увеличение доли слабо подвижных сперматозоидов по сравнению с группой интактных животных (см. табл. 3).

При использовании коэффициента ранговой корреляции Спирмена между концентрацией бисфенола А, триклозана в тканях яичка и параметрами спермы были обнаружены определённые корреляционные связи (табл. 4).

Вместе с этим установлено, что исследуемые эндокринные дизрапторы имеют склонность накапливаться в тканях яичка. Так, у испытуемых животных концентрация бисфенола А в среднем в 28 раз, а триклозана в 4,5 раза превышала таковую по сравнению с интактными.

Кроме того, следует отметить тот факт, что концентрации бисфенола А и триклозана в яичке животных и человека были тождественны как в контрольных группах, так и в группах исследования.

При сопоставлении полученных результатов влияния исследуемых эндокринных дизрапторов на параметры спермы в клинике и эксперименте было обнаружено ухудшение всех параметров спермы (количества, подвижности и морфологии сперматозоидов) при воздействии бисфенола А как у мужчин, так и у экспериментальных животных. Влияние триклозана на сперматогенез было неодинаковым и ограничивалось нарушением только морфологии сперматозоидов у мужчин или их подвижности у экспериментальных животных.

Выводы

1. Бисфенол А и триклозан могут вызывать нарушение сперматогенеза у мужчин и крыс, что подтверждено снижением параметров спермы в клинике и эксперименте.

2. Бисфенол А и триклозан следует рассматривать как возможные причинные факторы идиопатической инфертильности/субфертильности у мужчин.

3. Бисфенол А в сравнении с триклозаном продемонстрировал бóльшую степень накопления в тканях яичка, что показано в эксперименте.

4. Бисфенол А ухудшал все параметры спермы (количество, подвижность и морфологию сперматозоидов) как у мужчин, так и у экспериментальных животных.

5. Триклозан влиял на сперматогенез по-разному и ограничивался нарушением только морфологии сперматозоидов у мужчин или их подвижности у экспериментальных животных.

6. Исследуемые эндокринные дизрапторы могут оказывать негативное влияние на фрагментацию дезоксирибонуклеиновой кислоты сперматозоидов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в представленной статье.