Immunohistochemical evaluation of Ki-67, Cyclin D1 and β-catenin expression in the subtypes of triple negative breast cancer

Full Text

Тройной негативный (ТН) рак молочной железы (РМЖ) выделен в особую подгруппу относительно недавно, и его лечение остаётся одной из самых актуальных проблем современной онкологии. Преимущественно молодой возраст пациенток с ТН РМЖ и биологическая агрессивность данного подтипа РМЖ сочетаются с ограниченностью лечебных подходов в связи с отсутствием таргетных мишеней для противоопухолевой терапии. Из большого набора современных методов системной терапии при данном варианте РМЖ применяют только цитостатическую терапию, а результаты лечения остаются неутешительными. В российской популяции больных РМЖ ТН-фенотип составляет 18,5%, 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость статистически значимо ниже, чем выживаемость сопоставимых по клиническим характеристикам больных других подтипов РМЖ [1].

Предпринимают попытки выделить несколько подтипов этого вида рака, данные исследований противоречивы, но наиболее часто выделяют базальноподобный ТН РМЖ, как особый подтип. Проблема индивидуализации терапии РМЖ в отношении ТН-подтипа на сегодня не решена, а поиск мишеней для применения соответствующих ингибиторов идёт постоянно [2–5].

Большой интерес представляют биомаркёры клеточного цикла, в частности циклины, ассоциированные с ними циклин-зависимые киназы и циклин-зависимые ингибиторы киназ, играющие важнейшую роль в развитии клеточного цикла. Наиболее актуальный биомаркёр — циклин D1. Во многих работах, посвящённых опухолям различного генеза, показано, что повышенный синтез циклина D1 способствует инициации клеточного деления, коррелирует с большей частотой метастазирования опухолей и худшей выживаемостью больных [6–8]. Недавно выявлена роль циклина D1 в индукции клеточной миграции и инвазии, усилении ангиогенеза [9]. Данные об уровне экспрессии циклина D1 и его прогностическом значении в РМЖ немногочисленны и противоречивы [6–8, 10].

В последнее время в области молекулярной онкологии активно изучают путь передачи сигналов Wnt и β-катенин в качестве потенциальных мишеней противоопухолевой терапии [11]. Сигнальный путь Wnt регулирует судьбу клеток, выживание, пролиферацию и дифференцировку на разных стадиях развития и патологии млекопитающих. β-Катенин — многофункциональный цитоплазматический белок, образующий динамический комплекс с E-кадгерином и действующий как ключевой регулятор в сигнальном пути Wnt.

В нескольких исследованиях показано, что аномальная экспрессия и мутации β-катенина присутствуют при широком спектре заболеваний человека и связаны с опухолевой трансформацией [5, 11, 12]. В норме экспрессия β-катенина происходит исключительно на мембране эпителиальных клеток, появление β-катенина в цитоплазме и ядре клеток опухоли свидетельствует об активации ряда таргетных генов, запускающих аберрантные сигнальные пути, что приводит к увеличению миграции, подвижности, инвазии, повышению резистентности и выживаемости клеток опухоли [13].

Таким образом, изучение биомаркёров, способных стать мишенями для таргетной терапии ТН РМЖ, а также имеющих предикторное значение, весьма актуально.

Цель работы — изучить экспрессию β-катенина в подтипах ТН РМЖ с наличием и отсутствием гиперэкспрессии циклина D1.

Материалом для настоящего исследования служил операционный материал 60 пациенток с ТН РМЖ, находившихся на лечении в ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ с 2012 по 2015 гг. Пациентки относились к клинической стадии 2А (T1N1M0 либо T2N0M0). Возраст колебался от 29 лет до 71 года, средний возраст составил 51,3±3,5 года, возраст большинства женщин (66,7%) приходился на промежуток от 41 до 60 лет.

Для суррогатного определения молекуляр­ного подтипа опухолей была использована стандартная панель антител для иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания: к рецепторам эстрогена (РЭ), рецепторам прогестерона (РП), онкобелку Her2/neu и маркёру пролиферативной активности Ki-67. У всех пациенток, вошедших в наше исследование, на основании ИГХ-исследования был выявлен ТН РМЖ (РЭ-/РП-/Her2-негативный) и определён уровень Ki-67.

Для выделения группы базальноподобного (БП) рака использовали ИГХ-маркёры к цитокератинам 5/6 (CK5/6) и рецептору эпидермального фактора роста 1-го типа (EGFR — от англ. epidermal growth factor receptor). БП ТН РМЖ считали опухоли, в клетках которых выявлена экспрессия CK5/6 и/или EGFR, остальные отнесли к неклассифицированным ТН РМЖ. CK5/6+ считали опухоли, в которых было позитивно более 10% клеток. Экспрессию EGFR оценивали в баллах (0, 1+, 2+, 3+), считая результат позитивным, если присутствовало любое окрашивание. В опухолях также определяли экспрессию циклина D1 и β-катенина.

Для ИГХ-исследования с парафиновых блоков операционного материала готовили срезы толщиной 3–4 мкм и проводили окрашивание в иммуногистостейнере BenchMark ULTRA Ventana. Использовали антитела: РЭ (клон SP1) Thermo Scientific, 1:300; РП (клон SP2) Cell Marque, 1:200; Ki-67 (клон SP6) Spring Bioscience, 1:200; HER2/neu (клон 4B5) Ventana Medical Systems, RTU; циклин D1 (клон EP12) Dako, 1:200; β-катенин (клон 14) Ventana Medical Systems, RTU; CK5/6 (клон D5/6BH) Dako, 1:200; EGFR (клон E30) Dako, 1:50.

Для характеристики экспрессии Ki-67 и ци­клина D1 вычисляли долю клеток с окрашенными ядрами (процент общего количества опухолевых клеток). Подсчёт проводили полуколичественным методом не менее чем в 10 случайных полях зрения при увеличении ×200.

Экспрессию β-катенина оценивали отдельно по её локализации (мембрана, цитоплазма, ядро) при увеличении ×200 (не менее 10 полей зрения). Полное мембранное окрашивание считали нормой. Подсчитывали клетки с отсутствием окрашивания на мембране, выражая долю клеток в процентах общего числа опухолевых клеток. Также в процентах общего количества опухолевых клеток регистрировали цитоплазматическое окрашивание. Ядерную экспрессию β-катенина считали положительной при окрашивании хотя бы одной опухолевой клетки в поле зрения при увеличении ×200 [2].

Для статистической обработки результатов использовали параметрические методы статистики для показателей вариационного ряда: среднее арифметическое (М), ошибка среднего (m), медиана (Me), коэффициент вариации (C.V.). Достоверность разницы между двумя средними определяли по значению t-критерия Стьюдента для несвязанных совокупностей.

На основании результатов ИГХ-исследования с антителами к CK5/6 и EGFR все ТН РМЖ распределились следующим образом: базальные характеристики были выявлены в 37 (61,7%) опухолях и отсутствовали в 23 (38,3%), последние мы отнесли к неклассифицированным (табл. 1).

 

Таблица 1. Соотношение подтипов тройного негативного рака молочной железы в изучаемой группе и экспрессия в них Ki-67

Подтип, абс. (%)	Уровень экспрессии Ki-67
	М±m, %	Ме	C.V.
Всего, n=60 (100)	76,4±2,2	80	20,4
Базальноподобный, n=37 (61,7)	81,9±3,1●	85	18,1
Неклассифициро­ванный, n=23 (38,3)	70,8±3,1●	75	21,1

Примечание: М±m — среднее арифметическое и ошибка среднего; C.V. — коэффициент вариации; Ме — медиана; разница показателей, помеченных символом ●, статистически значима (p <0,05).

 

Известно, что для ТН РМЖ характерен высокий уровень пролиферативной активности, что мы наблюдали и по результатам наших исследований (см. табл. 1).

Средний уровень экспрессии Ki-67 в целом в исследованных ТН РМЖ составил 76,4±2,2% (Ме=80, C.V.=20,4). Причём средний уровень Ki-67 в БП ТН РМЖ был достоверно выше (p <0,05), чем в неклассифицированном ТН РМЖ — 81,9±3,1% (Ме=85, C.V.=18,1) и 70,8±3,1% (Ме=75, C.V.=21,1) соответственно. В обоих подтипах ТН РМЖ разброс данных по этому показателю был незначительный, на что указывали коэффициенты вариации менее 30.

При высоком уровне и относительной однородности показателей Ki-67 в обоих подтипах ТН РМЖ обращал на себя внимание разброс данных экспрессии циклина D1 — от 1% клеток до практически всей популяции опухолевых клеток. За пороговое значение, определяющее гиперэкспрессию циклина D1, мы приняли показатель 30%, так как, с одной стороны, встречали подобное ранжирование в работах других авторов, а с другой — оказалось, что доля окрашенных клеток находится в интервале либо от 1 до 30%, либо от 50 до 100% [6].

В БП ТН РМЖ гиперэкспрессия циклина D1 присутствовала в 32,4% опухолей и составила в среднем 89,9±4,7%. В ТН РМЖ без признаков базального эпителия гиперэкспрессия циклина D1 встречалась несколько чаще — 43,5%, однако его среднее значение было достоверно ниже — 66,5±6,6% (p <0,05). Следует отметить, что при обоих подтипах коэффициент вариации был низким, что указывало на небольшой разброс показателей (табл. 2).

 

Таблица 2. Экспрессия циклина D1 в подтипах тройного негативного рака молочной железы

Подтип, абс. (%)		Уровень экспреcсии циклина D1
		Абс. (%)	M±m, %
Всего 60 (100)	Базальноподобный, 37 (61,7)	Высокий, 12 (32,4)	89,9±4,7▲, Ме=92, C.V.=13,8
		Низкий, 25 (67,6)	12,2±2,8, Ме=10, C.V.=89,3
		Всего 37 (100)
	Неклассифицированный, 23 (38,3)	Высокий, 10 (43,5)	66,5±6,6▲, Ме=70, C.V.=29,9
		Низкий, 13 (56,5)	8,6±2,7, Ме=5, C.V.=110,5
		Всего 23 (100)

Примечание: М±m — среднее арифметическое и ошибка среднего; C.V. — коэффициент вариации; Ме — медиана; разница показателей, помеченных символом ▲, статистически значима (p <0,05).

 

В опухолях с низким уровнем экспрессии циклина D1 средние показатели составили: в БП ТН РМЖ — 12,2±2,8%, в неклассифицированном ТН РМЖ — 8,6±2,7%. Разница показателей не имела статистической значимости, данные очень варьировали даже в столь небольшом интервале значений — от 1 до 30%. Медиана была при обоих подтипах гораздо ниже порогового значения: 10 — при БП ТН РМЖ, 5 — при неклассифицированном ТН РМЖ (см. табл. 2).

Экспрессию β-катенина мы оценивали с учётом подтипа ТН РМЖ и наличия или отсутствия гиперэкспрессии циклина D1, данные представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Экспрессия β-катенина в подтипах тройного негативного рака молочной железы с различным уровнем циклина D1

Подтип, абс. (%)		Уровень циклина D1, абс. (%)	Экспрессия β-катенина
			Утрата мембранной экспрессии, М±m, %	Локализация в цитоплазме, М±m, %	Локализация в ядре, абс. (%)
Всего 60 (100)	Базальноподобный, 37 (61,7)	Низкий, 25 (67,6)	29,6±6,1●, Ме=20, C.V.=71,5	33,4±5,4▲, Ме=20, C.V.=78,9	3 (12)
		Высокий, 12 (32,4)	58±7,4●○, Ме=70, C.V.=38,4	63,3±7,2▲, Ме=60, C.V.=37,7	4 (33,3)
		Всего 37 (100)
	Неклассифицированный, 23 (38,3)	Низкий, 13 (56,5)	17,6±3,8*, Ме=10, C.V.=90,5	23,7±6,3♦, Ме=20, C.V.=92,2	Отсутствует
		Высокий, 10 (43,5)	33,3±4,3*○, Ме=30, C.V.=43,1	49,5±8,2♦, Ме=50, C.V.=49,6
		Всего 23 (100)

Примечание: М±m — среднее арифметическое и ошибка среднего; C.V. — коэффициент вариации; Ме — медиана; разница показателей, помеченных одинаковыми символами (*▲♦●○), статистически значима (p <0,05).

 

При обоих подтипах ТН РМЖ отмечена достоверная разница для всех показателей, характеризующих экспрессию β-катенина, между опухолями с гиперэкспрессией циклина D1 и его низким уровнем. Из табл. 3 видно, что при обоих подтипах доля клеток, утративших мембранную локализацию, была практически вдвое больше в тех опухолях, где обнаружена гиперэкспрессия циклина D1 (разница показателей статистически значима, p <0,05).

Также стоит отметить, что доля клеток утративших мембранную локализацию β-катенина, была достоверно выше в опухолях БП ТН РМЖ с гиперэкспрессией циклина D1 — по сравнению с таковыми, не имеющими признаков базального эпителия: 58±7,4 и 33,3±4,3% соответственно (p <0,05).

Та же закономерность зафиксирована при анализе цитоплазматической локализации β-катенина. В обоих подтипах высокий уровень экспрессии циклина D1 сочетался с достоверно большей долей опухолевых клеток с наличием экспрессии β-катенина в цитоплазме (см. табл. 3).

В БП ТН РМЖ отмечена также транслокация β-катенина в ядро: в 33,3% опухолей с гиперэкспрессией и 12% опухолей с низкой экспрессией циклина D1. В поле зрения присутствовало от 2 до 20 окрашенных клеток. При подтипе ТН РМЖ без признаков базального эпителия ядерная экспрессия β-катенина не выявлена.

В результате проведённого исследования выявлено следующее. Среди ТН РМЖ около двух третей опухолей имели признаки базального эпителия. Экспрессия общего маркёра пролиферации Ki-67 находится на стабильно высоком уровне, и в БП ТН РМЖ этот показатель достоверно выше. В части ТН РМЖ отмечена гиперэкспрессия циклина D1, причём в БП-варианте опухолей этот показатель был достоверно выше. При низком же уровне экспрессии циклина D1 значимых различий между группами не было по причине значительного разброса данных. В ТН РМЖ с ­гиперэкспрессией ­циклина D1 достоверно чаще происходила потеря β-катенина на мембране клеток с аномальным его накоплением в цитоплазме. В некоторых БП ТН РМЖ зарегистрирована транслокация β-катенина в ядра клеток, причём более чем в 2 раза чаще в опухолях с гиперэкспрессией циклина D1.

Существуют исследования, в которых доказано, что при активации сигнального пути Wnt происходит снижение скорости деградации β-катенина и, как следствие, аномальное его накопление в цитоплазме и/или ядре клеток опухолей. Также некоторые исследования показали, что циклин D1 служит важной мишенью для сигнального пути Wnt, и его избыточная экспрессия связана с накоплением β-катенина во многих типах опухолей [12, 13]. Эти данные свидетельствуют о том, что β-катенин необходим для поддержания стволовых клеток рака и особенностей эпителиально-мезенхимальной трансформации, которые также часто связаны с рецидивом опухоли и метастазами [12, 13].

В настоящее время идёт поиск ингибиторов сигнального пути Wnt в качестве противоопухолевых препаратов, предклинические исследования некоторых из них показали наличие терапевтического эффекта в ряде Wnt-зависимых опухолей [11]. В то же время в эксперименте показано, что ингибирование циклин-зависимых киназ приводит к блокированию клеточного цикла. Определены субстанции, ингибирующие циклин-зависимые киназы, что делает эти киназы перспективной мишенью для противо­опухолевой терапии. На сегодняшний день сразу несколько препаратов находится на этапах клинического изучения [14].

Выводы

1. При тройном негативном раке молочной железы в части случаев присутствуют опухоли с гиперэкспрессией циклина D1 (более 30% окрашенных клеток) и аномальной экспрессией β-катенина (потеря на мембране и накопление в цитоплазме и ядре).

2. Гиперэкспрессия циклина D1 при базальноподобном тройном негативном раке молочной железы встречалась реже, чем при небазальноподобном, однако среднее значение этого показателя в первом случае достоверно выше.

3. Аномальная экспрессия β-катенина достоверно чаще присутствовала в опухолях с гиперэкспрессией циклина D1, как при базальноподобном тройном негативном раке молочной железы, так и при опухолях без признаков базального эпителия. Ядерная транслокация β-катенина отмечена только при базальноподобном раке, чаще при гиперэкспрессии циклина D1.

4. Данные биомаркёры можно рассматривать в качестве потенциальных мишеней для таргетной терапии при тройном негативном раке молочной железы.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

L N Vashchenko

Rostov Research Institute of Oncology

Author for correspondence.
Email: tochka63@mail.ru
Rostov-on-Don, Russia

T N Gudtskova

Rostov Research Institute of Oncology

Email: tochka63@mail.ru
Rostov-on-Don, Russia

E M Nepomnyashchaya

Rostov Research Institute of Oncology

Email: tochka63@mail.ru
Rostov-on-Don, Russia

N S Karnaukhov

Rostov Research Institute of Oncology

Email: tochka63@mail.ru
Rostov-on-Don, Russia

M V Kvarchiya

Rostov Research Institute of Oncology

Email: tochka63@mail.ru
Rostov-on-Don, Russia

References

Supplementary files