Окислительная модификация белков ткани височной кости при хронических средних отитах

Полный текст

В настоящее время большой удельный вес в структуре гнойно-воспалительных заболеваний оториноларингологических (ЛОР) органов занимают патологические процессы, протекающие в полостях среднего уха [1, 2]. Большое значение приобретают отогенные осложнения, которые возникают у 3,2% пациентов с хроническим средним отитом (ХСО), тогда как смертность достигает 16,1%. Как правило, к смертельным исходам приводит рецидивирующий гнойно-деструктивный процесс височной кости, который встречается у 24–63% больных ХСО [3, 4].

При достаточно высоком уровне изученности морфологического строения воспалительно-­изменённой слизистой оболочки полостей среднего уха отсутствуют исследования о корреляции результатов гистологического исследования операционно-биопсийного материала с возможностью развития рецидива ХСО [5]. Интенсивно изучают патогенетическую роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе ХСО, где отмечают важную роль окислительной модификации белков (ОМБ) в развитии хронического воспаления. Ряд исследований указывает на ОМБ как на одно из ведущих патохимических звеньев развития деструкции костной ткани в полостях среднего уха [6–9].

Между тем, известно, что именно свободнорадикальное окисление биологических молекул как в воспалительно-изменённой ткани, так и в неизменённой слизистой оболочке, — атрибутивный патохимический признак ХСО [10, 11]. За последние десятилетия были проведены многочисленные исследования различных аспектов хронического воспаления, апробировались новые методы хирургического лечения ХСО, но сохраняются рецидивы отореи, отторжение реконструктивных элементов и прогрессирование тугоухости [12, 13].

Обобщая, можно сделать вывод, что хронический гнойный воспалительный процесс в среднем ухе требует изучения структур костной ткани височной кости для правильного выбора способа лечения, снижения травматического влияния санирующего этапа оперативного вмешательства, в том числе при проведении реконструкции с применением имплантационных материалов. Идентификация характера повреждения белков в костной ткани пациента как триггера формирования хронического деструктивного воспалительного процесса в закрытых полостях среднего уха позволит подобрать максимально эффективную хирургическую тактику по срокам лечения, виду оперативного вмешательства и оптимально подобранной консервативной терапии.

Цель исследования — изучение роли ОМБ костной ткани в формировании деструкции структур височной кости при ХСО.

Обследованы и пролечены 139 пациентов с ХСО в возрасте 16–75 лет (стандартное отклонение 40,4±14,58 года; медиана 43,5 года; 95% доверительный интервал для среднего 36,82; 43,99), подлежащих оперативному лечению, которые подписали добровольное информированное согласие на участие в клиническом исследовании (клиническое исследование одобрено этическим комитетом Челябинской государственной медицинской академии, протокол №2 от 13.10.2006).

В соответствии с Международной статистической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем, 10-го пересмотра (1992) были диагностированы следующие клинические формы ХСО: хронический туботимпанальный гнойный средний отит (Н66.1) и хронический эпитимпано-антральный гнойный средний отит (Н66.2).

В зависимости от способа хирургического лечения пациенты были распределены на четыре группы соответственно:
1) пациенты с туботимпанальным средним отитом, без осложнений, после однократной реконструктивно-санирующей отохирургии (n=53);
2) пациенты с эпитимпано-антральным средним отитом, без осложнений, после однократной реконструктивно-санирующей отохирургии (n=28);
3) пациенты с туботимпанальным средним отитом, локальными или внутричерепными осложнениями или повторными операциями в анамнезе (n=32);
4) пациенты с эпитимпано-антральным средним отитом, локальными или внутричерепными осложнениями или повторными операциями в анамнезе (n=26).

Всем пациентам была выполнена реконструктивно-санирующая отохирургическая операция [согласно приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 28 марта 2007 г. №212 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным туботимпанальным гнойным средним отитом и хроническим эпитимпано-антральным гнойным средним отитом (при оказании специализированной помощи)»].

Показанием для оперативного вмешательства стали жалобы, предъявляемые пациентами, результаты анамнеза, инструментального исследования ЛОР-органов с применением отоэндомикроскопии, бактериологического исследования, данные спиральной компьютерной томографии височных костей и аудиологического исследования слуховой функции. По показаниям санирующий этап операции представлен вариантами аттикоантромастоидотомии, включающей санацию среднего уха с удалением гнойно-расплавленной, узурированной костной ткани из тимпанальной и мастоидальной полостей с элементами облитерации неополостей и реконструкцией структур среднего уха. Образцы костной ткани из полостей среднего уха были получены во время операции у всех пациентов с ХСО [5].

Фрагменты костной ткани непосредственно после их получения освобождали от мукопериоста, тщательно промывали в 0,9% растворе натрия хлорида, предварительно охлаждённом до 2–4 °C, высушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали. Далее образцы костной ткани измельчали в ступке, добавляли 1,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида, тщательно перемешивали (вортекс V-1, Biosan, Латвия) для удаления крови, центрифугировали при 800 g (центрифуга Eppendorf 5415R c ротором F-45-24-11, Германия) в течение 10 мин при 4 °C. Супернатант удаляли, к осадку, содержащему отмытую костную ткань, добавляли 0,5 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера с рН=7,4 и гомогенизировали в фарфоровой ступке при температуре 2–4 °C. Полученные гомогенаты вновь центрифугировали при 4500 g. Супернатант собирали, хранили при –86 °C до исследования (морозильная камера Thermo Forma 905, Thermo Fisher Scientific, США).

Состояние процессов ОМБ оценивали по содержанию карбонильных продуктов, по их реакции с 2,4-динитрофенилгидразином с последующей спектрофотометрической регистрацией продуктов взаимодействия — динитрофенилгидразонов, анализом площади под кривой спектра поглощения динитрофенилгидразонов — дериватов карбонильных производных белков [14]. Для этих целей использовали спектрофотометр СФ-2000 (ОКБ «Спектр», Россия), регистрируя оптическую плотность в ультрафиолетовой части спектра при длинах волн 230, 254, 270, 280 и 356 нм для выявления альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ), 363 и 370 нм для выявления кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ), в области видимого света — 428 и 430 нм для АДНФГ и 434, 524, 530, 535 нм для КДНФГ.

Использованный методический подход позволяет не только оценить общий уровень ОМБ, определить количество АДНФГ и ­КДНФГ основного и нейтрального характера, но и сопоставить первичные и вторичные маркёры ОМБ, а в результате выявить путь нарушения нативной конформации белков. Уровень ОМБ регистрировали на базальном уровне и при индукции (металл-катализируемое окисление белков) [14].

Статистический анализ выполнен с использованием пакета прикладных компьютерных программ Statistica 8.0 for Windows. Данные обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде медианы (Me) и диапазона между нижним (LQ, 25-й процентиль) и верхним (UQ, 75-й процентиль) квартилями. О достоверности межгрупповых различий судили по U-критерию Манна–Уитни. Проверка статистических гипотез выполнялась при критическом уровне значимости р=0,05.

У пациентов второй группы по сравнению с пациентами первой группы отмечено усиление базального уровня ОМБ при ­статистически незначимой тенденции к меньшему содержанию белка в костной ткани височной кости. Преобладание среди продуктов ОМБ веществ альдегидной природы АДНФГ нейтрального характера свидетельствует о большей выраженности процессов фрагментации белков и соответствует относительно ранним этапам развития окислительного стресса (табл. 1).

 

Таблица 1. Окислительная модификация белков костной ткани височной кости у больных с хроническим средним отитом

Показатели	Первая группа (n=53)	Вторая группа (n=28)	Третья группа (n=32)	Четвёртая группа (n=26)
Общий белок, мг/г	4,056 [2, 419–4, 291]	2,572 [2, 022–3, 617]	2,347 [1, 665–3, 234]	1,11*,** [0, 86–1, 338]
S АДНФГ uv, ед./г белка	8,641 [3, 997–12, 32]	28,072* [23, 112–29, 901]	18,586** [13, 034–23, 505]	29,013* [19, 352–35, 377]
S АДНФГ vs, ед./г белка	1,052 [0, 456–1, 365]	1,755 [1, 298–2, 146]	1,811 [1, 335–2, 084]	6,565*,** [2, 33–8, 432]
S КДНФГ vs, ед./г белка	0,18 [0, 07–0, 28]	0,255 [0, 093–0, 311]	0,317 [0, 211–0, 398]	0,899*,** [0, 44–0, 709]
S общ., ед./г белка	11,056 [5, 083–18, 597]	31,885* [29, 422–33, 842]	22,738** [15, 595–29, 883]	42,522* [29, 188–49, 946]
S АДНФГ, ед./г белка	9,693 [4, 453–15, 029]	29,826* [25, 988–31, 726]	20,397** [14, 146–26, 199]	35,578* [27, 73–41, 029]
АДНФГ, %	87,742 [87, 602–89, 001]	93,945* [91, 01–97, 812]	89,916 [87, 52–92, 592]	86,979 [85, 655–92, 505]
КДНФГ, %	12,258 [10, 999–12, 398]	6,055* [2, 188–8, 99]	10,084 [7, 408–12, 48]	13,021 [7, 495–14, 345]
S АДНФГ uv МКО, ед./г белка	14,229 [4, 907–19, 142]	34,11* [28, 928–40, 02]	27,473 [18, 461–35, 172]	52,032* [34, 734–65, 045]
S АДНФГ vs МКО, ед./г белка	5,362 [2, 091–6, 509]	8,867 [5, 366–8, 972]	10,864 [8, 323–12, 444]	22,029*,** [10, 225–32, 916]
S КДНФГ vs МКО, ед./г белка	0,509 [0, 203–0, 445]	0,696 [0, 271–0, 794]	0,878 [0, 678–1, 039]	3,976*,** [0, 929–2, 59]
S общ. МКО, ед./г белка	23,132 [8, 267–29, 609]	48,154 [40, 06–47, 45]	45,046 [29, 869–55, 126]	87,267*,** [52, 137–125, 548]
S АДНФГ МКО, ед./г белка	19,591 [6, 94–25, 65]	42,976 [36, 96–46, 595]	38,337** [26, 14–47, 468]	74,061* [46, 832–97, 961]
РАП, %	50,454 [37, 193–59, 295]	32,174 [29, 709–35, 458]	45,308 [36, 676–53, 491]	50,404** [40, 965–60, 217]

Примечание: S — суммарное содержание; АДНФГ — альдегид-динитрофенилгидразоны; uv — ультрафиолетовая область спектра; vs — видимая область спектра; КДНФГ — кетон-динитрофенилгидразоны; МКО — металл-катализируемое окисление; РАП — резервно-адаптационный потенциал; *статистически значимые различия между показателями групп 1 и 3, 2 и 4; **статистически значимые различия между показателями групп 1 и 2, 3 и 4.

 

Сопоставление показателей, характеризующих ОМБ в костной ткани височной кости у пациентов с осложнённым и неосложнённым туботимпанальным средним отитом, демонстрирует большую выраженность свободнорадикальной деструкции белков при осложнённом течении заболевания.

Полученные данные свидетельствуют о накоплении в исследованном материале преимущественно маркёров ранних этапов повреждения белков (у пациентов группы с осложнённым течением туботимпанального среднего отита в сравнении с показателями группы с неосложнённым течением выявлено повышение содержания продуктов альдегидной природы как на базальном уровне, так и в ответ на индукцию).

Осложнённые формы хронического эпитимпано-антрального среднего отита сопровождаются выраженными и глубокими повреждениями белков ткани височной кости, о чём свидетельствуют статистически значимо более высокие уровни всех исследованных категорий продуктов как на базальном уровне, так и при исследовании металл-катализируемой ОМБ, в том числе и КДНФГ, накопление которых свидетельствует об агрегации повреждённых белков. Данная группа пациентов характеризуется также наименьшим содержанием белка.

В третьей и четвёртой группах пациентов с осложнённым течением заболевания выявлено повышение общего содержания белка в костной ткани полостей среднего уха, и существенно повышалось содержание КДНФГ и металл-катализируемой ОМБ, что указывает на большую выраженность окислительной деструкции костной ткани, сопровождающейся фрагментацией и агрегацией белков (см. табл. 1).

Полученные данные позволяют сделать заключение о высоком уровне окислительного стресса в костной ткани как о факторе, характеризующем тяжесть воспалительного процесса и деструкции височной кости при ХСО. Учитывая, что важнейший механизм защиты от накопления и токсического действия продуктов ОМБ — их протеолитическая деградация [15], усиление ОМБ неизбежно влечёт за собой активацию протеолиза в костной ткани, что объясняет снижение общего содержания белка по мере прогрессирования хронического воспалительного процесса в полостях среднего уха.

Таким образом, развитие деструктивных форм ХСО сопровождается чрезмерной активацией ОМБ, что с высокой степенью вероятности, может оказать негативное влияние как на стабильность минеральной фазы и органического матрикса [16], так и на функции и дифференцировку клеточных элементов костной ткани [17–20], приводя к нарушениям процессов ремоделирования костной ткани и, как следствие, к её деструкции. Считаем также логичным предположение о поддержании воспалительных процессов в костной ткани за счёт кумуляции продуктов свободнорадикального окисления.

Вывод

Полученные результаты позволяют сделать выводы о перспективности разработки новых подходов к лечению и профилактики осложнений хронического среднего отита, предусматривающих применение антиоксидантов в предоперационном периоде с учётом особенностей окислительного стресса в костной ткани.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Ирина Дмитриевна Дубинец

Южно-Уральский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: 89124728166@mail.ru
г. Челябинск, Россия

Антон Иванович Синицкий

Южно-Уральский государственный медицинский университет

Email: 89124728166@mail.ru
г. Челябинск, Россия

Мусос Юсуфович Коркмазов

Южно-Уральский государственный медицинский университет

Email: 89124728166@mail.ru
г. Челябинск, Россия

Екатерина Ивановна Черных

Южно-Уральский государственный медицинский университет

Email: 89124728166@mail.ru
г. Челябинск, Россия

Светлана Юрьевна Кухтик

Южно-Уральский государственный медицинский университет

Email: 89124728166@mail.ru
г. Челябинск, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы