Oxidative protein modification of the temporal bone tissue in chronic otitis media

Cover Page

Abstract


Aim. To study the role of oxidative protein modification of bone tissue proteins in the formation of destruction of temporal bone structures in chronic otitis media.

Methods. The study included 139 patients aged 16-75 years with a verified diagnosis of chronic otitis media, who are candidates for surgical treatment. Depending on the method of surgical treatment, patients are divided into four groups (by nosology and complications and reoperations): patients with tubotympanic otitis media and epitympanic antral otitis, without complications and with local or intracranial complications, after reconstructive sanitizing ear surgery. The state of the processes of oxidative modification of proteins was evaluated in the bone tissue of the middle ear cavities, obtained intraoperatively, by the content of carbonyl products with the use of spectrophotometry. The data were processed by descriptive statistics and were presented in the form of a median and a range between quartiles with an estimate of the reliability of the intergroup differences by the Mann-Whitney U-criterion.

Results. A comparison of the indicators characterizing the oxidative modification of bone tissue proteins of the temporal bone in patients with complicated and recurrent forms of chronic otitis media demonstrates a greater degree of free radical destruction of proteins, primarily markers of early stages of protein damage and an increase of aldehyde products, both at the basal level and in response to induction in a complicated course of the disease.

Conclusion. The obtained data allow drawing a conclusion about a high level of oxidative stress in bone tissue in destructive forms of chronic otitis media accompanied by relapses and complications, and about the perspectives of antioxidant pre-operative use taking into account the features of oxidative stress in bone tissue in patients with chronic otitis media.


В настоящее время большой удельный вес в структуре гнойно-воспалительных заболеваний оториноларингологических (ЛОР) органов занимают патологические процессы, протекающие в полостях среднего уха [1, 2]. Большое значение приобретают отогенные осложнения, которые возникают у 3,2% пациентов с хроническим средним отитом (ХСО), тогда как смертность достигает 16,1%. Как правило, к смертельным исходам приводит рецидивирующий гнойно-деструктивный процесс височной кости, который встречается у 24–63% больных ХСО [3, 4].

При достаточно высоком уровне изученности морфологического строения воспалительно-­изменённой слизистой оболочки полостей среднего уха отсутствуют исследования о корреляции результатов гистологического исследования операционно-биопсийного материала с возможностью развития рецидива ХСО [5]. Интенсивно изучают патогенетическую роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе ХСО, где отмечают важную роль окислительной модификации белков (ОМБ) в развитии хронического воспаления. Ряд исследований указывает на ОМБ как на одно из ведущих патохимических звеньев развития деструкции костной ткани в полостях среднего уха [6–9].

Между тем, известно, что именно свободнорадикальное окисление биологических молекул как в воспалительно-изменённой ткани, так и в неизменённой слизистой оболочке, — атрибутивный патохимический признак ХСО [10, 11]. За последние десятилетия были проведены многочисленные исследования различных аспектов хронического воспаления, апробировались новые методы хирургического лечения ХСО, но сохраняются рецидивы отореи, отторжение реконструктивных элементов и прогрессирование тугоухости [12, 13].

Обобщая, можно сделать вывод, что хронический гнойный воспалительный процесс в среднем ухе требует изучения структур костной ткани височной кости для правильного выбора способа лечения, снижения травматического влияния санирующего этапа оперативного вмешательства, в том числе при проведении реконструкции с применением имплантационных материалов. Идентификация характера повреждения белков в костной ткани пациента как триггера формирования хронического деструктивного воспалительного процесса в закрытых полостях среднего уха позволит подобрать максимально эффективную хирургическую тактику по срокам лечения, виду оперативного вмешательства и оптимально подобранной консервативной терапии.

Цель исследования — изучение роли ОМБ костной ткани в формировании деструкции структур височной кости при ХСО.

Обследованы и пролечены 139 пациентов с ХСО в возрасте 16–75 лет (стандартное отклонение 40,4±14,58 года; медиана 43,5 года; 95% доверительный интервал для среднего 36,82; 43,99), подлежащих оперативному лечению, которые подписали добровольное информированное согласие на участие в клиническом исследовании (клиническое исследование одобрено этическим комитетом Челябинской государственной медицинской академии, протокол №2 от 13.10.2006).

В соответствии с Международной статистической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем, 10-го пересмотра (1992) были диагностированы следующие клинические формы ХСО: хронический туботимпанальный гнойный средний отит (Н66.1) и хронический эпитимпано-антральный гнойный средний отит (Н66.2).

В зависимости от способа хирургического лечения пациенты были распределены на четыре группы соответственно:
1) пациенты с туботимпанальным средним отитом, без осложнений, после однократной реконструктивно-санирующей отохирургии (n=53);
2) пациенты с эпитимпано-антральным средним отитом, без осложнений, после однократной реконструктивно-санирующей отохирургии (n=28);
3) пациенты с туботимпанальным средним отитом, локальными или внутричерепными осложнениями или повторными операциями в анамнезе (n=32);
4) пациенты с эпитимпано-антральным средним отитом, локальными или внутричерепными осложнениями или повторными операциями в анамнезе (n=26).

Всем пациентам была выполнена реконструктивно-санирующая отохирургическая операция [согласно приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 28 марта 2007 г. №212 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным туботимпанальным гнойным средним отитом и хроническим эпитимпано-антральным гнойным средним отитом (при оказании специализированной помощи)»].

Показанием для оперативного вмешательства стали жалобы, предъявляемые пациентами, результаты анамнеза, инструментального исследования ЛОР-органов с применением отоэндомикроскопии, бактериологического исследования, данные спиральной компьютерной томографии височных костей и аудиологического исследования слуховой функции. По показаниям санирующий этап операции представлен вариантами аттикоантромастоидотомии, включающей санацию среднего уха с удалением гнойно-расплавленной, узурированной костной ткани из тимпанальной и мастоидальной полостей с элементами облитерации неополостей и реконструкцией структур среднего уха. Образцы костной ткани из полостей среднего уха были получены во время операции у всех пациентов с ХСО [5].

Фрагменты костной ткани непосредственно после их получения освобождали от мукопериоста, тщательно промывали в 0,9% растворе натрия хлорида, предварительно охлаждённом до 2–4 °C, высушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали. Далее образцы костной ткани измельчали в ступке, добавляли 1,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида, тщательно перемешивали (вортекс V-1, Biosan, Латвия) для удаления крови, центрифугировали при 800 g (центрифуга Eppendorf 5415R c ротором F-45-24-11, Германия) в течение 10 мин при 4 °C. Супернатант удаляли, к осадку, содержащему отмытую костную ткань, добавляли 0,5 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера с рН=7,4 и гомогенизировали в фарфоровой ступке при температуре 2–4 °C. Полученные гомогенаты вновь центрифугировали при 4500 g. Супернатант собирали, хранили при –86 °C до исследования (морозильная камера Thermo Forma 905, Thermo Fisher Scientific, США).

Состояние процессов ОМБ оценивали по содержанию карбонильных продуктов, по их реакции с 2,4-динитрофенилгидразином с последующей спектрофотометрической регистрацией продуктов взаимодействия — динитрофенилгидразонов, анализом площади под кривой спектра поглощения динитрофенилгидразонов — дериватов карбонильных производных белков [14]. Для этих целей использовали спектрофотометр СФ-2000 (ОКБ «Спектр», Россия), регистрируя оптическую плотность в ультрафиолетовой части спектра при длинах волн 230, 254, 270, 280 и 356 нм для выявления альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ), 363 и 370 нм для выявления кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ), в области видимого света — 428 и 430 нм для АДНФГ и 434, 524, 530, 535 нм для КДНФГ.

Использованный методический подход позволяет не только оценить общий уровень ОМБ, определить количество АДНФГ и ­КДНФГ основного и нейтрального характера, но и сопоставить первичные и вторичные маркёры ОМБ, а в результате выявить путь нарушения нативной конформации белков. Уровень ОМБ регистрировали на базальном уровне и при индукции (металл-катализируемое окисление белков) [14].

Статистический анализ выполнен с использованием пакета прикладных компьютерных программ Statistica 8.0 for Windows. Данные обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде медианы (Me) и диапазона между нижним (LQ, 25-й процентиль) и верхним (UQ, 75-й процентиль) квартилями. О достоверности межгрупповых различий судили по U-критерию Манна–Уитни. Проверка статистических гипотез выполнялась при критическом уровне значимости р=0,05.

У пациентов второй группы по сравнению с пациентами первой группы отмечено усиление базального уровня ОМБ при ­статистически незначимой тенденции к меньшему содержанию белка в костной ткани височной кости. Преобладание среди продуктов ОМБ веществ альдегидной природы АДНФГ нейтрального характера свидетельствует о большей выраженности процессов фрагментации белков и соответствует относительно ранним этапам развития окислительного стресса (табл. 1).

 

Таблица 1. Окислительная модификация белков костной ткани височной кости у больных с хроническим средним отитом

Показатели

Первая группа (n=53)

Вторая группа (n=28)

Третья группа (n=32)

Четвёртая группа (n=26)

Общий белок, мг/г

4,056

[2,419–4,291]

2,572

[2,022–3,617]

2,347

[1,665–3,234]

1,11*,**

[0,86–1,338]

S АДНФГ uv, ед./г белка

8,641

[3,997–12,32]

28,072*

[23,112–29,901]

18,586**

[13,034–23,505]

29,013*

[19,352–35,377]

S АДНФГ vs, ед./г белка

1,052

[0,456–1,365]

1,755

[1,298–2,146]

1,811

[1,335–2,084]

6,565*,**

[2,33–8,432]

S КДНФГ vs, ед./г белка

0,18

[0,07–0,28]

0,255

[0,093–0,311]

0,317

[0,211–0,398]

0,899*,**

[0,44–0,709]

S общ., ед./г белка

11,056

[5,083–18,597]

31,885*

[29,422–33,842]

22,738**

[15,595–29,883]

42,522*

[29,188–49,946]

S АДНФГ, ед./г белка

9,693

[4,453–15,029]

29,826*

[25,988–31,726]

20,397**

[14,146–26,199]

35,578*

[27,73–41,029]

АДНФГ, %

87,742

[87,602–89,001]

93,945*

[91,01–97,812]

89,916

[87,52–92,592]

86,979

[85,655–92,505]

КДНФГ, %

12,258

[10,999–12,398]

6,055*

[2,188–8,99]

10,084

[7,408–12,48]

13,021

[7,495–14,345]

S АДНФГ uv МКО, ед./г белка

14,229

[4,907–19,142]

34,11*

[28,928–40,02]

27,473

[18,461–35,172]

52,032*

[34,734–65,045]

S АДНФГ vs МКО, ед./г белка

5,362

[2,091–6,509]

8,867

[5,366–8,972]

10,864

[8,323–12,444]

22,029*,**

[10,225–32,916]

S КДНФГ vs МКО, ед./г белка

0,509

[0,203–0,445]

0,696

[0,271–0,794]

0,878

[0,678–1,039]

3,976*,**

[0,929–2,59]

S общ. МКО, ед./г белка

23,132

[8,267–29,609]

48,154

[40,06–47,45]

45,046

[29,869–55,126]

87,267*,**

[52,137–125,548]

S АДНФГ МКО, ед./г белка

19,591

[6,94–25,65]

42,976

[36,96–46,595]

38,337**

[26,14–47,468]

74,061*

[46,832–97,961]

РАП, %

50,454

[37,193–59,295]

32,174

[29,709–35,458]

45,308

[36,676–53,491]

50,404**

[40,965–60,217]

Примечание: S — суммарное содержание; АДНФГ — альдегид-динитрофенилгидразоны; uv — ультрафиолетовая область спектра; vs — видимая область спектра; КДНФГ — кетон-динитрофенилгидразоны; МКО — металл-катализируемое окисление; РАП — резервно-адаптационный потенциал; *статистически значимые различия между показателями групп 1 и 3, 2 и 4; **статистически значимые различия между показателями групп 1 и 2, 3 и 4.

 

Сопоставление показателей, характеризующих ОМБ в костной ткани височной кости у пациентов с осложнённым и неосложнённым туботимпанальным средним отитом, демонстрирует большую выраженность свободнорадикальной деструкции белков при осложнённом течении заболевания.

Полученные данные свидетельствуют о накоплении в исследованном материале преимущественно маркёров ранних этапов повреждения белков (у пациентов группы с осложнённым течением туботимпанального среднего отита в сравнении с показателями группы с неосложнённым течением выявлено повышение содержания продуктов альдегидной природы как на базальном уровне, так и в ответ на индукцию).

Осложнённые формы хронического эпитимпано-антрального среднего отита сопровождаются выраженными и глубокими повреждениями белков ткани височной кости, о чём свидетельствуют статистически значимо более высокие уровни всех исследованных категорий продуктов как на базальном уровне, так и при исследовании металл-катализируемой ОМБ, в том числе и КДНФГ, накопление которых свидетельствует об агрегации повреждённых белков. Данная группа пациентов характеризуется также наименьшим содержанием белка.

В третьей и четвёртой группах пациентов с осложнённым течением заболевания выявлено повышение общего содержания белка в костной ткани полостей среднего уха, и существенно повышалось содержание КДНФГ и металл-катализируемой ОМБ, что указывает на большую выраженность окислительной деструкции костной ткани, сопровождающейся фрагментацией и агрегацией белков (см. табл. 1).

Полученные данные позволяют сделать заключение о высоком уровне окислительного стресса в костной ткани как о факторе, характеризующем тяжесть воспалительного процесса и деструкции височной кости при ХСО. Учитывая, что важнейший механизм защиты от накопления и токсического действия продуктов ОМБ — их протеолитическая деградация [15], усиление ОМБ неизбежно влечёт за собой активацию протеолиза в костной ткани, что объясняет снижение общего содержания белка по мере прогрессирования хронического воспалительного процесса в полостях среднего уха.

Таким образом, развитие деструктивных форм ХСО сопровождается чрезмерной активацией ОМБ, что с высокой степенью вероятности, может оказать негативное влияние как на стабильность минеральной фазы и органического матрикса [16], так и на функции и дифференцировку клеточных элементов костной ткани [17–20], приводя к нарушениям процессов ремоделирования костной ткани и, как следствие, к её деструкции. Считаем также логичным предположение о поддержании воспалительных процессов в костной ткани за счёт кумуляции продуктов свободнорадикального окисления.

Вывод

Полученные результаты позволяют сделать выводы о перспективности разработки новых подходов к лечению и профилактики осложнений хронического среднего отита, предусматривающих применение антиоксидантов в предоперационном периоде с учётом особенностей окислительного стресса в костной ткани.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

I D Dubinets

South Ural State Medical University

Author for correspondence.
Email: 89124728166@mail.ru
Chelyabinsk, Russia

A I Sinitsky

South Ural State Medical University

Email: 89124728166@mail.ru
Chelyabinsk, Russia

M Yu Korkmazov

South Ural State Medical University

Email: 89124728166@mail.ru
Chelyabinsk, Russia

E I Chernykh

South Ural State Medical University

Email: 89124728166@mail.ru
Chelyabinsk, Russia

S Yu Kukhtik

South Ural State Medical University

Email: 89124728166@mail.ru
Chelyabinsk, Russia

  1. Daykhes N.A., Yanov Yu.K. Khronicheskiy gnoynyy sredniy otit. Klinicheskie rekomendatsii. (­Chronic suppurative otitis media. Clinical practice guidelines.) M. 2016; 32 p. http://glav-otolar.ru/assets/images/docs/clinical-recomendations/KR320%20HGSO.pdf (access date: 19.01.2017). (In Russ.)
  2. Yeh С.F., Wu C.S., Huang C.Y. et al. Chronic otitis media surgery and re-operation risk factor analysis: A nationwide retrospective cohort study of 18 895 patients. Acta Oto-Laryngologica. 2016; 136 (3): 259–265. doi: 10.3109/00016489.2015.1115550.
  3. Kryukov A.I., Garov E.V. The classification of operations in chronic suppurative otitis media. Rossiiskaya otorinolaringologiya. 2016; (3): 181–182. (In Russ.)
  4. Patyakina O.K., Kryukov A.I., Garov E.V. The classification of chronic suppurative otitis media. Rossiiskaya otorinolaringologiya. 2016; (3): 207–208. (In Russ.)
  5. Dubinets I.D., Korkmazov M.Yu., Tyukhay M.V. The role of structural changes in bone tissue in the performance of va­rious types of reconstructive and sanitizing interventions in chronic inflammation of ENT organs. Vestnik otorinolaringologii. 2016; (S5): 15–16. (In Russ.)
  6. Sinha A.K., Kumar A., Raushan E.A., Kumar G. Bone resorption in chronic otitis media. Intern. J. Sci. Study. 2014; 2: 82–85.
  7. Ralston S.H. Bone structure and metabolism. Medicine. 2017; 45 (9): 560–564. doi: 10.1016/j.mpmed.2017.06.008.
  8. Kamilov F.Kh., Farshatova E.R., Enikeev D.A. Cellular-molecular mechanisms of bone tissue remodeling and its regulation. Fundamental’nye issledovaniya. 2014; 4 (7): 36–842. (In Russ.)
  9. Wang J., Chen B., Xu M. et al. Etiological factors associated with chronic suppurative otitis media in a population of Han adults in China. Acta Oto-Laryngologica. 2016; 136 (10): 1024–1028. doi: 10.1080/00016489.2016.1183818.
  10. Schimdt M., Grünsfelder P., Hoppe F. Induction of matrix metalloproteinases in keratinocytes by cholesteatoma debris and granulation issue extracts. Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 2000; 257: 425–429. doi: 10.1007/s004050000249.
  11. Young M.F., Kerr J.M., Ibaraki K. et al. Structure, expression, and regulation of the major noncollagenous matrix proteins of bone. Clin. Orthop. Relat. Res. 1992; 281: 275–294. doi: 10.1097/00003086-199208000-00042.
  12. Dubinets I.D., Tyukhay M.V., Sychugov G.V., Uchaev D.A. Structural changes in bone tissue in chronic purulent otitis media studied by light microscopy. Vestnik otorinolaringologii. 2017; (S5): 65–66. (In Russ.)
  13. Dubinets I.D., Korkmazov M.Yu., Korkmazov А.M. et al. Comparative analysis of the nature and dynamics of the surgical treatment of patients with chronic otitis media according to the ENT department of Chelyabinsk. Vestnik otorinolaringologii. 2017; 82 (S5): 64–65. (In Russ.)
  14. Fomina M.A., Abalenikhina Yu.V. Sposob kompleksnoy otsenki soderzhaniya produktov okislitel’noy modifikatsii belkov v tkanyakh i biologicheskikh zhidkostyakh. Metodicheskie rekomendatsii. (A method of complex assessment of the content of oxidative modification products of proteins in tissues and biological fluids. Methodical recommendation.) Ryazan’: RIO RyazGMU. 2014; 60 p. (In Russ.)
  15. Goldberg A.L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 2003; 426: 895–899. doi: 10.1038/nature02263.
  16. Nurgaleev N.V., Farshatova E.R., Agletdinov Eh.F. et al. Metabolism of mandibular bone tissue in case of long-term inflow of copper-zinc pyrite ore elements in the experiment. Meditsinskiy vestnik Bashkortostana. 2012; 7 (5): 78–81. (In Russ.)
  17. Atashi F., Modarressi A., Pepper M.S. The role of reactive oxygen species in mesenchymal stem cell adipogenic and osteogenic differentiation: a review. Stem Cells ­Development. 2015; 24: 1150–1163. doi: 10.1089/scd.
  18. 0484.
  19. Mody N., Parhami F., Sarafian T.A. et al. Oxidative stress modulates osteoblastic differentiation of vascular and bone cells. Free Radical Biol. Med. 2001; 31 (4): 509–519. doi: 10.1016/s0891-5849(01)00610-4.
  20. Basu S., Michaelsson K., Olofsson H. et al. Association between oxidative stress and bone mineral density. Biochem. Biophys. Res. Communications. 2001; 288: 275–279. doi: 10.1006/bbrc.2001.5747.
  21. Shouhed D., Kha H.T., Richardson J.A. et al. Osteogenic oxysterols inhibit the adverse effects of oxidative stress on osteogenic differentiation of marrow stromal cells. J. Cell. Biochem. 2005; 95: 1276–1283. doi: 10.1002/jcb.20497.

Views

Abstract - 186

PDF (Russian) - 147

Cited-By


PlumX


© 2019 Dubinets I.D., Sinitsky A.I., Korkmazov M.Y., Chernykh E.I., Kukhtik S.Y.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-75008 от 1 февраля 2019 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)