Цитопротективный эффект неопиатного аналога лей-энкефалина в первичной культуре пульмональных фибробластов в условиях окислительного стресса

Полный текст

Опиоидные пептиды представляют собой часть стресс-лимитирующей системы организма [1]. Агонисты опиатных рецепторов проявляют нейропротективный [2], кардиопротективный [3] и гастропротективный [4] эффекты при различных патологических состояниях, сопровождающихся окислительным стрессом. Однако применение агонистов опиатных рецепторов в клинической практике ограничивается опасностью формирования центральных эффектов и зависимости.

Ранее мы провели экспериментальные исследования in vivo по анализу эффектов неопиатного аналога лей-энкефалина (НАЛЭ). Пептид НАЛЭ не имеет аффинности к опиатным рецепторам, поскольку вместо тирозина содержит в N-концевом положении аминокислотной цепи фенилаланин [5]. Была выявлена высокая эффективность пептида НАЛЭ при последствиях антенатальной гипоксии, сравнимая с эффективностью применения неселективного агониста δ/µ-опиатных рецепторов пептида даларгина [6]. Однако было неясно: обладает пептид НАЛЭ прямым цитопротективным влиянием или эффект пептида НАЛЭ in vivo опосредован регуляторными системами организма.

Целью исследования был анализ прямого цитопротективного влияния пептида НАЛЭ в первичной культуре пульмональных фибро­бластов в условиях окислительного стресса.

Для получения первичной культуры пульмональных фибробластов биоптат левого лёгкого 2-суточной белой крысы линии Вистар механически дезагрегировали и обрабатывали коллагеназой поджелудочной железы краба (Биолот, Россия) в концентрации 500 ед./мл в течение 15 мин в условиях термостата (37 °С). Затем полученную суспензию центрифугировали; осадок пипетировали с раствором ­Хенкса (Биолот, Россия). Процедуру ­отмывки от ­коллагеназы повторяли дважды. Полученный ­материал высевали в культуральные флаконы в среду DMEM (Биолот, Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Sigma, США). Культивирование осуществляли в СО₂-инкубаторе (Sanyo, Япония) в газовой среде с 5% содержанием СО₂. Использовали клетки пятого пассажа.

Инкубацию пульмональных фибробластов с пептидом НАЛЭ (Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg; ООО «Алмабион», Россия) проводили в течение 6 ч при концентрации пептида в культуральной среде 0,1 мкМ. Для моделирования окислительного стресса в культуральную среду на 2 ч добавляли 0,001 мл 3% Н₂О₂ (60 мкМ) [7]. Экспериментальные серии включали: (1) «контроль»; (2) «НАЛЭ» (пептид добавляли в культуральную среду через 44 ч после заключительного пересева); (3) «окислительный стресс» (Н₂О₂ добавляли в культуральную среду через 48 ч после заключительного пересева); (4) «НАЛЭ + окислительный стресс» (пептид добавляли в культуральную среду через 44 ч, Н₂О₂ — через 48 ч после заключительного пересева).

Методом люцигенин-зависимой хемилюминесценции определяли образование радикала супероксид-аниона в культуре фибробластов [8, 9]. Для этого монослой фибробластов снимали с подложки с помощью раствора трипсина-версена (Биолот, Россия) и трижды промывали в растворе Хенкса. Для хемилюминесцентного анализа использовали суспензию клеток: 1×106 клеток в 0,1 мл раствора Хенкса. Количество клеток в суспензии фибробластов подсчитывали в камере Фукса–Розенталя. Регистрацию хемилюминесценции проводили на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER», стандартизацию сигнала осуществляли с помощью программы «Finlab». Люцигенин (Sigma-Aldrich) добавляли в конечной концентрации 5 мкM. Определяли светосумму свечения за 5 мин, показатель выражали в относительных единицах.

Оценку параметров нуклео-­нуклеолярного аппарата клеток проводили на компьютерном анализаторе изображения МЕКОС-Ц. Для ­этого монослои фибробластов окрашивали азотнокислым серебром по методу AgNOR [10]. Параметры нуклеологенеза служат морфологическим отражением активности транскрипции рибосомальных генов [11] и достоверной количественной характеристикой функционального состояния клетки [12]. Проводили морфоцитометрию площади ядер фибробластов, оценку количества ядрышек, суммарной площади ядрышек в ядре. Площади ядер и ядрышек рассчитывали на основании измерения в 50 клетках. Для анализа количества ядрышек просматривали 200 ядер фибробластов в каждом монослое.

Результаты исследования обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0. Для сравнения контрольной и опытной серий использовали t-критерий Стьюдента для независимых выборок, различия между контрольной и опытными сериями считали статистически значимыми при р <0,05. Всего в эксперименте было исследовано 35 монослоёв фибробластов. На проведение исследования было получено разрешение этического комитета Дальневосточного государственного медицинского университета.

В культуре пульмональных фибробластов, подвергнутых 2-часовому воздействию 60 мкМ перекиси водорода (серия 3 — «окислительный стресс»), регистрировали достоверное повышение интенсивности люцигенин-зависимой хемилюминесценции на 64% (табл. 1).

 

Таблица 1. Интенсивность люцигенин-зависимой хемилюминесценции в суспензированной первичной культуре пульмональных фибробластов (M±m)

Показатель	Контроль	НАЛЭ	Окислительный стресс	НАЛЭ + окислительный стресс
Светосумма люцигенин-зависимого свечения, отн.ед.	0,554±0,020	0,507±0,017	0,909±0,023, *р=0,000003	0,723±0,025, *р=0,0004, #p=0,001

Примечание: *по отношению к контролю; # по отношению к группе «окислительный стресс»; НАЛЭ — неопиатный аналог лей-энкефалина.

 

При проведении морфоцитометрии фибробластов этой экспериментальной серии наблюдали уменьшение площади ядер фибробластов на 28,6%, суммарной площади ядрышек — на 39,95%, количества ядрышек в ядрах фибро­бластов — на 9,3% (табл. 2). Снижение показателей ядрышкового аппарата клеток в условиях окислительного стресса обусловлено угнетением синтеза рибосомальной рибонуклеиновой кислоты [12, 13].

 

Таблица 2. Морфометрические параметры нуклео-нуклеолярного аппарата в первичной культуре пульмональных фибробластов исследуемых экспериментальных серий (M±m)

Параметры	Контроль	НАЛЭ	Окислительный стресс	НАЛЭ + окислительный стресс
Площадь ядра	180,28±3,97	160,69±4,89, *р=0,0015	128,25±4,03, *р=0,0002	155,09±4,34, *р=0,0011, #р=0,0035
Суммарная площадь ядрышек	20,80±0,50	14,10±0,47, *р=0,007	12,49±0,37, *р=0,0001	13,97±0,37, *р=0,001, #р=0,02
Количество ядрышек	3,917±0,091	3,705±0,105	3,551±0,070, *р= 0,019	3,846±0,071, # р=0,03

Примечание: *по отношению к контролю; #по отношению к группе «окислительный стресс»; НАЛЭ — неопиатный аналог лей-энкефалина.

 

Предварительная инкубация клеток с пептидом НАЛЭ (0,1 мкМ) существенно уменьшила выраженность индуцированных воздействием перекиси водорода отклонений исследуемых параметров (серия 4). Образование радикала ­супероксид-аниона в образцах культуры серии «НАЛЭ + окислительный стресс», по данным люцигенин-зависимой хемилюминесценции, оставалось достоверно выше контрольного параметра (на 30,5%), однако было достоверно (на 20,5%) ниже аналогичного параметра группы «окислительный стресс» (см. табл. 1). Площадь ядер фибробластов группы «НАЛЭ + окислительный стресс» была достоверно (на 14%) меньше, чем в контроле, но больше, чем в группе «окислительный стресс» (на 20,9%). Суммарная площадь ядрышек фибробластов, подвергнутых воздействию окислительного стресса на фоне влияния НАЛЭ, была также достоверно ниже (на 32,8%) аналогичного показателя в группе контроля, однако на 11,8% выше по сравнению с группой «окислительный стресс». Количество ядрышек не имело отличий от контрольных показателей (см. табл. 2). Следовательно, предварительная инкубация культивируемых клеток с пептидом НАЛЭ существенно ослабляла негативные изменения, индуцированные воздействием перекиси водорода.

Добавление пептида НАЛЭ в культуральную среду в концентрации 0,1 мкМ (группа 2) без воздействия перекиси водорода также приводило к изменению морфометрических показателей: происходили снижение площади ядер фибробластов на 10,9% и уменьшение суммарной площади ядрышек на 32,2% (см. табл. 2). Механизм уменьшения размеров ядер и ядрышек клеток при воздействии пептида требует дальнейшего исследования. Нужно отметить, что выявленные в первичной культуре пульмональных фибробластов эффекты пептида НАЛЭ сходны с описанными нами ранее в этой же экспериментальной модели эффектами неселективного агониста µ/δ-опиатных рецепторов пептида седатина [14].

Результаты проведённого исследования указывают на наличие у НАЛЭ собственного прямого цитопротективного свойства в условиях окислительного стресса. При анализе возможных механизмов реализации эффекта пептида НАЛЭ обращает внимание сходство структуры этого пептида с начальным фрагментом молекулы ноцицептина — лиганда NOP-рецепторов [15]. Известно, что активация NOP-рецепторов приводит к реализации внутриклеточных сигнальных путей, сходных с опосредуемыми опиатными рецепторами: угнетение аденилатциклазы, уменьшение внутриклеточной концентрации ионов кальция [15], что может ­обусловить цитопротективный эффект. Наличие выраженного защитного эффекта, реализуемого как in vivo, так и in vitro, при отсутствии аффинности к опиатным рецепторам определяет перспективу создания на основе пептида НАЛЭ лекарственных препаратов и их доклинического исследования.

Выводы

1. Введение в культуральную среду 60 мкМ Н₂О₂ повышает генерацию радикала супероксид-аниона в первичной культуре пульмональных фибробластов, уменьшает размер ядер фибробластов, снижает количество и суммарную площадь ядрышек.

2. Предварительная инкубация клеток с не­опиатным аналогом лей-энкефалина (Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg, 0,1 мкМ) снижает эффекты негативного воздействия Н2О2: зарегистрированы уменьшение активности генерации радикала супероксид-аниона, существенная коррекция параметров нуклео-нуклеолярного аппарата культивируемых фибробластов.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Елена Николаевна Сазонова

Дальневосточный государственный медицинский университет; Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания - Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства

Автор, ответственный за переписку.
Email: sazen@mail.ru
г. Хабаровск, Россия; г. Хабаровск, Россия

Ольга Антоновна Лебедько

Дальневосточный государственный медицинский университет; Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания - Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства

Email: sazen@mail.ru
г. Хабаровск, Россия; г. Хабаровск, Россия

Галина Александровна Денисюк

Дальневосточный государственный медицинский университет

Email: sazen@mail.ru
г. Хабаровск, Россия

Константин Вячеславович Жмеренецкий

Дальневосточный государственный медицинский университет

Email: sazen@mail.ru
г. Хабаровск, Россия

Вячеслав Анатольевич Добрых

Дальневосточный государственный медицинский университет

Email: sazen@mail.ru
г. Хабаровск, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы