Развитие признаков дистресса у крыс на фоне однократного ультразвукового воздействия

Полный текст

Движение крови по микрососудам капиллярного типа, перемещение интерстициальной жидкости и веществ по межклеточным пространствам, транспорт лимфы по лимфатическим микрососудам обеспечивают необходимую трофику и выведение из тканей продуктов обмена органических веществ.

Гемодинамика в системе микроциркуляции, особенно в её капиллярном звене, определяется как внутренними силами кровообращения, так и метаболическими потребностями тканей [1]. Основная роль при этом принадлежит закономерностям циркуляции крови и лимфы в сосудах диаметром от 2 до 200 мкм, поведению форменных элементов крови (деформация, агрегация, адгезия), динамике процессов свёртывания крови (коагуляция, фибринолиз, тромбообразование, роль тромбоцитов), транс­капиллярному обмену и ультраструктурным особенностям микрососудов, функциональному состоянию эндотелиальных клеток [2].

Нарушения в работе микроциркуляторного русла могут лежать в основе многих патологических процессов и быть не только вторичными, но и являться первопричиной таковых. Локальные изменения микроциркуляции возникают уже на раннем этапе развития различных видов патологии (инфаркта миокарда, стенокардии, артериальной гипертензии) и по мере генерализации патологических процессов приобретают системный характер, поэтому данные, полученные в одной области микроциркуляции, могут дать представление о системе микроциркуляторного русла в целом [3].

Один из физических факторов воздействия современной среды обитания на человека — ультразвук. По своей природе ультразвук представляет собой высокочастотные (свыше 20 кГц) механические колебания, распространяющиеся в упругих средах, физическое воздействие которых зависит не только от частоты и амплитуды ультразвуковых волн, но и от свойств среды, в которой он распространяется. Так, ультразвук при контактном воздействии может вызывать спазмы кровеносных сосудов, особенно капилляров, что становится причиной недостаточности кровообращения тех или иных тканей и органов.

Длительное систематическое действие уль­тразвука, распространяющегося воздушным путём, вызывает изменения функционирования нервной, сердечно-сосудистой и эндокринной систем, слухового и вестибулярного анализаторов. У животных, которые способны воспринимать ультразвуковые волны, этот фактор вызывает психоэмоциональный стресс. В процессах адаптации к действию стрессорных факторов важная роль принадлежит гемостазиологическим параметрам, изменение которых служит чувствительным показателем адаптационного потенциала организма [4].

Цель работы — изучить влияние однократного 24-часового воздействия ультразвуковых волн, распространяющихся в воздушной среде, на состояние микроциркуляторного русла и показатели системы гемостаза у крыс.

Исследования были выполнены на 28 крысах-самцах линии Wistar с массой тела 250±20 г. Животные были разделены на две группы — интактную и экспериментальную, по 14 крыс в каждой.

Группу экспериментальных животных подвергали ультразвуковому воздействию с 24-часовой экспозицией с помощью ультразвуковых отпугивателей мышей «Филин» (НПП «Дон», Россия), установленных с двух сторон от клетки с крысами на расстоянии 10 см. Среднегеометрическая частота колебаний составляла 25 кГц, уровень звукового давления — 84,3 дБ.

После прекращения воздействия исследовали показатели микроциркуляторного русла с использованием метода лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) с анализом амплитудно-частотного спектра колебаний кровотока на аппарате ЛАКК-02 (НПО «Лазма», Россия). Головку оптического зонда фиксировали в основании хвоста животного. Длительность записи ЛДФ-граммы составляла 5 мин. Регистрировались основные параметры микроциркуляции, а также проводился анализ амплитудно-частотного спектра колебаний кровотока в полосе частот от 0,005 до 3 Гц. В этой полосе формировалось четыре неперекрывающихся частотных диапазона, позволяющих оценить состояние «активных» и «пассивных» звеньев регуляции микрокровотока.

Сразу после проведения эксперимента для исследования забирали кровь в объёме 5 мл из печёночного синуса в полистироловый шприц с широкой иглой, содержащий 3,8% раствор натрия цитрата (соотношение крови и цитрата 9:1) под инъекционным наркозом препаратом золетил.

У всех животных исследовали показатели тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, а также антикоагулянтную и фибринолитическую активность плазмы крови с помощью наборов фирмы «Технология-Стандарт» (Россия). Индуцированную агрегацию тромбоцитов проводили по G.V.R. Born (1962) на агрегометре «Биола» (Россия), в качестве индуктора использовали раствор аденозиндифосфата в концентрации 10 мкг/мл. Тромбоэластометрию выполняли на приборе Rotem (Pentapharm GmbH, Германия) с использованием реагента «Natem», в состав которого входит кальция хлорид.

Использование крыс в экспериментах осуществлялось в соответствии требованиями Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей» (Страсбург, 1986) и Директивами 86/609/EEC. Обезболивание и умерщвление животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Полученные в ходе исследования данные представлены в виде (m [25–75%]), где m — медиана в выборочной совокупности; [25–75%] — 25-й и 75-й перцентили. Статистический анализ проведён на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft, США). Статистическую значимость различий оценивали при помощи непараметрического U-критерия Манна–Уитни, так как признаки не подчинялись нормальному распределению. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости p <0,05. Уровень статистической значимости различий при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

Показатели микроциркуляции исследовали сразу после 24-часового воздействия ультразвука на животных (табл. 1). Однократное воздействие ультразвука вызывало у экспериментальных крыс достоверное снижение исследуемых активных и пассивных факторов модуляции кровотока по сравнению с интактными животными: показателя микро­циркуляции — на 67%, показателя флакса — на 68%, амплитуды эндотелиальных колебаний — на 75%, амплитуды вазомоторных колебаний — на 78%, амплитуды дыхательных волн — на 69%, амплитуды пульсовых волн — на 75%.

 

Таблица 1. Изменение показателей микроциркуляции экспериментальных и интактных крыс

Показатели	Интактные крысы (n=14)	Экспериментальные крысы (n=14)	р
ПМ, пф.ед.	7,5 [5, 8–8, 7]	2,5 [1, 8–5, 9]	р=0,002 (∆ –67%)
СКО (σ), пф.ед.	4,1 [3, 3–4, 6]	1,3 [0, 9–1, 8]	р=0,0001 (∆ –68%)
Эндотелиальные волны (VLF), пф.ед.	8,8 [5, 9–11, 8]	2,2 [1, 6–5, 2]	р=0,001 (∆ –75%)
Вазомоторные волны (LF), пф.ед.	9,8 [6, 1–11, 6]	2,1 [1, 5–3, 8]	р=0,0001 (∆ –78%)
Дыхательные волны (HF1), пф.ед.	4,9 [2, 4–6, 9]	1,5 [1, 3–1, 6]	р=0,0001 (∆ –69%)
Пульсовые волны (CF1), пф.ед.	2,4 [1, 5–3, 2]	0,6 [0, 45–0, 62]	р=0,0001 (∆ –75%)

Примечание: результаты представлены в виде (m [25–75%]), где m — медиана в выборочной совокупности; [­25–75%] — 25-й и 75-й перцентили; ∆ — статистически значимая разница экспериментальной группы с интактными животными при p <0,05; р — уровень статистической значимости различий экспериментальной группы с интактными животными; ПМ — показатель микроциркуляции; пф.ед. — перфузионные единицы; СКО (σ) — флакс, среднеквадратичное отклонение амплитуд колебаний кровотока; n — количество животных в исследуемой группе.

 

Активные факторы непосредственно воздействуют на сосуды микроциркуляторного русла, модулируют поток крови со стороны сосудистой стенки и реализуются через её мышечную составляющую, поэтому их называют тонус-формирующими [5]. Снижение амплитуды этих звеньев свидетельствует об ослаблении модуляции кровотока со стороны данного механизма регуляции и расценивается как повышение тонуса, снижение дилатационного резерва и функциональных возможностей эндотелия.

Увеличение тонуса и развитие спазма сосудов обусловлены возросшей симпатической импульсацией, вызванной активацией стресс-реакции, что приводит к увеличению напряжения в гладкомышечных клетках сосудистой стенки. Об уменьшении притока крови в микроциркуляторное русло и снижении модуляции кровотока свидетельствуют и данные о снижении показателя микроциркуляции и показателя флакса, характеризующего миогенный компонент.

Развитие вазоконстрикции подтверждается также снижением амплитуды эндотелиальных волн, обусловленным, по всей вероятности, сокращением содержания эндотелиального оксида азота. Такого рода данные могут свидетельствовать о развитии эндотелиальной дисфункции [6], так как в условиях постоянно повышенного пристеночного напряжения сдвига функциональный резерв эндотелия истощается.

Зарегистрированное в нашем эксперименте снижение показателя флакса обычно свидетельствует об угнетении активных вазомоторных механизмов модуляции тканевого кровотока или преобладании в регуляции тонических симпатических влияний [7]. При прекращении активной вазомоции в той части капиллярного русла, в которой сопротивление кровотоку выше, объёмный кровоток сокращается, и в ней появляются признаки стаза. В этом случае кровоток шунтируется, и бо́льшая часть крови, поступающей в микроциркуляторное русло, движется по меньшей части капилляров, тем самым нарушая метаболизм тканей. Нутритивное же звено микроциркуляторного русла в условиях стаза, характеризующегося полной блокадой кровотока, оказывается наиболее ранимым [8].

К пассивным механизмам регуляции относят внешние факторы, находящиеся вне ­микроциркуляторного русла: пульсовые ­волны, приходящие со стороны терминальных артерий (кардиальный ритм на входе в микроциркуляторное русло), и дыхательные волны со стороны вен (венулярный ритм на выходе из микроциркуляторного русла). Уменьшение амплитуды и сглаживание вершины пульсовой волны происходят при повышении тонуса резистивных сосудов (мелких артерий и ­артериол). Несмотря на то обстоятельство, что местом локализации дыхательных ритмов в системе микроциркуляции являются венулы, эти волны напрямую не характеризуют кровоток венозных отделов, но непосредственно связаны с его модуляцией. Дыхательные осцилляции отражают распределение перфузии и давления вне капилляров в более крупных микрососудах — венулах. Снижение амплитуды дыхательных волн указывает на повышение градиента артериовенозного давления [9].

В норме в результате чередования сокращения и расслабления гладкомышечного аппарата сосудистой стенки (активные факторы) происходит модулирование периодически изменяющегося объёма крови (пассивные факторы), что в конечном счете и формирует оптимальные гемодинамические параметры для транскапиллярного обмена [5]. И напротив, сформировавшийся спазм приводит к обеднению нутритивного кровотока, развитию ишемии и снижению показателя перфузии.

На основании наших данных, можно сказать, что первичное нарушение микроциркуляции, способствующее увеличению сопротивления току крови вследствие вазоспазма, становится причиной вторичных нарушений в системе гемостаза. Вазоспазм, ишемические явления стимулируют выброс в кровоток провоспалительных цитокинов, обладающих мощным прокоагулянтным действием [10]. Кроме этого, выделению проагрегантов и прокоагулянтов способствует турбулентный ток крови, обусловленный тем, что артериоловенулярные шунты впадают в венулы под значительным углом, создавая условия для соударения форменных элементов между собой и со стенкой сосуда [3]. К тому же возникновение острой ишемии находится в зависимости от состояния нейрогуморальной регуляции сосудистого тонуса и реологических свойств крови, во многом определяемых системой гемостаза.

Полученные в нашем исследовании данные по изменениям гемостазиологических параметров подтвердили развитие стресс-реакции у крыс в ответ на 24-часовое воздействие ультразвука, зафиксированное в ходе изучения ­микроциркуляторного русла.

По этой причине на следующем этапе эксперимента после забора крови исследовали параметры, характеризующие сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз, а также состояние антикоагулянтного и фибринолитического звеньев коагуляционного гемостаза с помощью методов коагулометрии и тромбоэластографии (табл. 2).

 

Таблица 2. Изменение показателей гемостаза экспериментальных и интактных крыс

Показатели	Интактные крысы (n=14)	Экспериментальные крысы (n=14)	р
АДФ-индуцированная агрегация, отн.ед.	25,4 [23, 6–27, 6]	21,7 [16, 82–30, 55]	р=0,6
Активированное парциальное тромбопластиновое время, с	14,9 [14, 2–15, 6]	16,3 [14, 9–19, 0]	р=0,18
Протромбиновое время, с	22,4 [21, 7–23, 2]	18,2 [15, 2–19, 5]	р=0,024 (∆ –18,7%)
Тромбиновое время, с	41,1 [38, 17–42, 72]	26,6 [24, 75–27, 65]	р=0,001 (∆ –35,28%)
Время полимеризации фибрин-мономерных комплексов, с	63,3 [58, 6–65, 9]	39,5 [35, 0–43, 0]	р=0,004 (∆ –37,60%)
Гепарин-тромбиновое время, с	82,6 [79, 8–84, 9]	52,2 [49, 5–52, 4]	р=0,033 (∆ –36,80%)
Фибриноген, г/л	2,9 [2, 77–2, 92]	2,7 [2, 1–3, 0]	р=0,5
Растворимые фибрин-мономерные комплексы, мг/100 мл	3,0 [3, 0–3, 0]	3,0 [3, 0–3, 0]	р=0,5
Антитромбин III, %	95,0 [92, 6–98, 7]	51,5 [40, 25–58, 55]	р=0,0003 (∆ –45,79%)
Спонтанный эуглобулиновый фибринолиз, мин	600,0 [570, 0–630, 0]	495,0 [426, 25–710, 0]	р=0,4
Время коагуляции, с	180,5 [165, 75–202, 25]	204,5 [171, 5–225, 25]	р=0,3
Время формирования сгустка, с	76,0 [63, 25–106, 5]	133,0 [91, 5–159, 75]	р=0,009 (∆ +75%)
Угол α, градус	72,0 [68, 25–76, 5]	66,5 [63, 0–71, 5]	р=0,013 (∆ –7,64%)
Максимальная твёрдость сгустка, мм	68,0 [62, 0–69, 5]	69,0 [66, 25–70, 75]	р=0,28
Максимальный лизис,%	4,0 [1–7, 5]	0,0 [0–0]	р=0,007 (∆ –100%)
Плотность сгустка через 10 мин, мм	39,5 [12, 75–49, 5]	58,0 [52, 5–61, 75]	р=0,002 (∆ +46,84%)

Примечание: результаты представлены в виде (m [25–75%]), где m — медиана в выборочной совокупности; [25–75%] — 25-й и 75-й перцентили; ∆ — статистически значимая разница экспериментальной группы с интактными животными при p <0,05; р — уровень статистической значимости различий экспериментальной группы с интактными животными; АДФ — аденозиндифосфат.

 

Установлено, что 24-часовое ультразвуковое воздействие сопровождалось выраженной гиперкоагуляцией по внешнему пути плазменного гемостаза, о чём свидетельствует уменьшение протромбинового времени на 18,7%. Достоверное укорочение тромбинового времени на 35% и времени полимеризации растворимых фибрин-мономерных комплексов на 37% по сравнению с интактными животными расценивается как гиперкоагуляция на конечных этапах свёртывания.

Зафиксированная гиперкоагуляция усугублялась выраженным угнетением антикоагулянтной активности плазмы крови, зафиксированной как по значительному падению уровня антитромбина III (на 45%), так и по уменьшению гепарин-тромбинового времени (на 36,8%), на фоне угнетения фибринолитической активности. Такая совокупность данных свидетельствует о развитии у крыс, подвергшихся 24-часовому ультразвуковому воздействию, состояния дистресса. В то же время данных в пользу развития состояния тромботической готовности и повышенного риска ­тромбообразования у крыс после ультразвукового воздействия в нашей работе не выявлено, так как концентрация растворимых фибрин-­мономерных комплексов в плазме крови экспериментальных животных не повысилась.

Несмотря на тот факт, что дефицит фибриногена по коагулограмме не выявлен, так как время спонтанного эуглобулинового фибринолиза по сравнению с интактной группой не изменялось, по данным тромбоэластографии зарегистрировано уменьшение показателя времени максимального лизиса, что свидетельствует об угнетении фибринолитической активности. Увеличение же времени формирования сгустка в крови экспериментальных животных на 75% (р=0,009) в комплексе со снижением значений угла α (р=0,013) демонстрирует нарушение процесса полимеризации фибрина, одной из причин которого может быть дефицит фибриногена, формирующийся из-за расходования последнего на образование тромба.

Поскольку материалом для исследования гемостазиологических параметров методом тромбоэластографии служит не плазма крови, а цельная кровь, необходимо учитывать, что при высоких показателях пристеночного напряжении сдвига повышается вязкость крови, значение которой зависит от вязкости плазмы, показателя гематокрита и микрореологических свойств эритроцитов, как самого многочисленного пула клеток крови [11]. Подтверждением этого служат данные об ухудшении деформационных свойств эритроцитов, интенсификации агрегатообразования с формированием патологических агрегатов при артериальной гипертензии.

Выводы

1. Однократное 24-часовое воздействие ультразвука вызывает у крыс выраженные изменения в зоне микроциркуляции: угнетение активных и пассивных механизмов модуляции кровотока, спазм мелких артерий и артериол, застойные явления в системе микроциркуляции, эндотелиальную дисфункцию.

2. Нарушения в микроциркуляторном русле сопровождаются значительными сдвигами в системе гемостаза — гиперкоагуляцией по внешнему пути гемокоагуляции и на конечных этапах плазменного гемостаза при угнетении антикоагулянтной и фибринолитической активности плазмы крови.

3. Совокупность данных по изменениям гемостазиологических параметров и нарушениям микроциркуляторного русла ­свидетельствует о развитии состояния дистресса в ответ на 24-часовое воздействие ультразвука.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Марина Николаевна Носова

Алтайский государственный медицинский университет; Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: mn.nosova@gmail.com
г. Барнаул, Россия; г. Новосибирск, Россия

Юлия Алексеевна Бондарчук

Алтайский государственный медицинский университет; Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины

Email: mn.nosova@gmail.com
г. Барнаул, Россия; г. Новосибирск, Россия

Игорь Ильич Шахматов

Алтайский государственный медицинский университет; Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины

Email: mn.nosova@gmail.com
г. Барнаул, Россия; г. Новосибирск, Россия

Александр Владимирович Мацюра

Алтайский государственный университет

Email: mn.nosova@gmail.com
г. Барнаул, Россия

Полина Сергеевна Маршалкина

Алтайский государственный медицинский университет

Email: mn.nosova@gmail.com
г. Барнаул, Россия

Дарья Андреевна Прокопец

Алтайский государственный медицинский университет

Email: mn.nosova@gmail.com
г. Барнаул, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы