Method for the determination of phosphabenzide in biological fluids

D. A. Valimukhametova; Валимухаметова Д. А.; V. I. Pogoreltsev; Погорельцев В. И.; S. Yu. Harmonov; Гармонов С. Ю.; G. G. Trubnikova; Трубникова Г. Г.; D. B. Bagautdinova; Багаутдинова Д. Б.; G. K. Budnikov; Будников Г. К.; M. I. Evgeniev; Евгеньев М. И.

doi:10.17816/kazmj100990

Method for the determination of phosphabenzide in biological fluids

Authors: Valimukhametova D.A.¹^,2, Pogoreltsev V.I.¹^,2, Harmonov S.Y.¹^,2, Trubnikova G.G.¹^,2, Bagautdinova D.B.¹^,2, Budnikov G.K.¹^,2, Evgeniev M.I.¹^,2
Affiliations:
1. Kazan Medical University
2. Kazan Technological University
Issue: Vol 76, No 3 (1995)
Pages: 263-265
Section: New methods and rationalization proposals
URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/100990
DOI: https://doi.org/10.17816/kazmj100990
ID: 100990

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Individual pharmacokinetic characteristics of drugs in most cases are due to differences in their absorption, distribution, metabolism and excretion. In some cases, the conclusion about the inefficiency of the drug is a consequence of the inadequacy of the dosing regimen, which is due, in turn, to the lack of a method for the quantitative determination of the drug in biological media of the whole organism.

Keywords

Kazan Medical archive

Full Text

Индивидуальные фармакокинетические особенности лекарственных средств в большинстве случаев обусловлены различиями в их всасывании, распределении, метаболизме и экскреции. В ряде случаев заключение о неэффективности препарата является следствием неадекватности схемы его дозирования, что обусловлено, в свою очередь, отсутствием метода количественного определения лекарственного препарата в биологических средах целостного организма.

Фосфабензид (гидразид дифенилфосфинилуксусной кислоты) является представителем класса гидразидов фосфорилированных карбоновых кислот и был предложен как нейротропное средство для лечения алкоголизма, височной эпилепсии и гипоталамических расстройств различного генеза, как транквилизатор при некоторых психических заболеваниях и как средство премедикации в стоматологии [3, 7]. Препарат разрешен Фармакологическим комитетом МЗ СССР для клинического применения при лечении алкоголизма. Однако фармакокинетика фосфабензида (ФБ) не изучена, хотя такие исследования необходимы для оценки его эффективности и оптимизации использования в клинике. Описанные в литературе методы определения содержания фосфабензида в лекарственных формах [6], основанные на получении окрашенных производных с п-диметиламинобензальдегидом и по собственному поглощению ФБ в области УФ-спектра, не селективны при анализе биологических жидкостей.

В задачи исследования входили разработка метода определения содержания фосфабензида в биологических жидкостях, а также изучение процесса связывания препарата биологическими субстратами.

Для большинства препаратов показана более тесная связь между фармакологическим эффектом и концентрацией, чем между эффектом и дозой [8]. Важное значение для изучения механизма действия фосфабензида имеет рассмотрение всех звеньев его терапевтического эффекта: доза→концентрация в плазме крови→концентрация в месте действия→взаимодействтие с фармакорецептором→эффект на уровне ткани→наблюдаемый фармакологический эффект→терапевтический эффект.

Определение концентрации препарата в плазме крови и конечного эффекта позволяет установить активную концентрацию для обеспечения фармакологического и терапевтического эффектов.

Для определения содержания фосфабензида в крови и моче в качестве реагента использован 4-хлор-5,7-динитробензофуразан (БФЗ). Он является реакционноспособным и высококонтрастные реагентом для обнаружения соединений гидразина методом спектрофотометрии [1, 2]. Избирательное спектрофотометрическое выявление гидразидов кислот в виде их динитробензофуразановых производных при этом возможно в присутствии алкиламинов, алкилгидразинов, аминокислот, других органических веществ. Некоторые из них могут быть потенциальными метаболитами фосфабензида.

При взаимодействии ФБ с ацетонитрильным раствором БФЗ (20-кратный избыток) образуется продукт аналитической реакции, окрашенный в красный цвет. Линейная зависимость оптической плотности раствора от концентрации ФБ соблюдается в интервале 10⁻⁴—2×10⁻⁶ моль/л, что составляет всю область фармакокинетических концентраций лекарственного вещества. Остаточное влияние эндогенных азотистых низкомолекулярных органических веществ, присутствующих в крови и моче, которые также образуют окрашенные продукты с БФЗ, незначительно. Подобное влияние можно устранить при использовании раствора сравнения — центрифугата анализируемого образца, в котором ФБ количественно разрушается перекисью водорода, что не приводит к искажению состава других компонентов матрицы. Метод апробирован на плазме, сыворотке, цельной крови (образцы предоставлены Республиканской станцией переливания крови) и моче. Результаты определений приведены в таблице.

В пробе биологической жидкости (кровь, моча) объемом 4 мл проводят осаждение белков после добавления 1 мл 30% раствора трихлоруксусной кислоты. Из пробы крови предварительно удаляют кровяной сгусток. После отделения белков двукратным центрифугированием (6000 об./мин ) пробы нейтрализуют буферным раствором (pH 5,5; объем — 0,5 мл) и к ним добавляют 0,25 мл ацетонитрильного раствора БФЗ с концентрацией 0,02 моль/л. Через 5 минут анализируемые пробы фотометрируют при 500 нм относительно растворов сравнения. В качестве последних используют анализируемые биологические пробы (4 мл) с тем же содержанием БФЗ, в которых ФБ удален добавлением 0,1 мл 30% пергидроля. Эту операцию проводят в кислой среде до нейтрализации анализируемой пробы буферным раствором.

Фармакологический эффект в организме определяется как характером всасывания и экскреции, так и закономерностями инактивации. Специфическая активность препарата снижается вследствие необратимого химического разрушения либо обратимого связывания с различными биосубстратами, что может отождествляться с депонированием. Как известно, многие препараты связываются с белками сыворотки крови, в основном с альбумином [4].

Процесс связывания ФБ с белками плазмы крови исследовали in vitro методом равновесного диализа [5]. Инкубацию лекарственного вещества проводили при 25°С в течение суток. Снижение концентрации ФБ в диализном мешке контролировали постановкой реакции с БФЗ. Параллельно ставили контрольный опыт с дистиллированной водой. Степень связывания ФБ составила 30±3%.

Основные процессы фармакокинетики и фармакодинамики определяются свободной, а не связанной с белками частью препарата в крови, проходящего через различные гистогематические барьеры, фильтрующегося в почечных клубочках и проникающего к месту действия. Как показывают данные связывания, полученные нами в экспериментах in vitro, фосфабензид слабо связан с белками, и его суммарная концентрация в плазме близка к уровню свободного препарата. Однако точный расчет уровня свободного препарата может быть осложнен при таких патологически измененных условиях связывания, как понижение уровня альбумина в сыворотке, или при возможном вытеснении препарата билирубином из комплекса с белком в случае гипербилирубинемии.

Для многих лекарственных средств конечный терапевтический эффект зависит не столько от их концентрации в месте действия, сколько от экспозиции и, по всей видимости, связывание будет пролонгировать время пребывания препарата в крови и органах. Таким образом, связывание в известной степени предохраняет от разрушения лекарственные вещества с короткими сроками циркуляции в организме. Пролонгированный фармакологический эффект проявляется и в результате десорбции или диссоциации комплекса препарата с биосубстратом, так как часть свободного лекарства элиминирует в результате экскреции или метаболизма, чем поддерживается постоянное соотношение между свободным и связанным препаратом.

$Белок + свободное лекарство ⇌ связанное лекарство$

Важное значение в выяснении активности, эффекта пролонгирования и клеточной проницаемости играет связывание лекарственных веществ с форменными элементами крови, в первую очередь, с эритроцитами, которые составляют около 40% объема крови. Связывание ФБ эритроцитами устанавливали после инкубирования лекарственного вещества (2×10⁻⁴ моль/л) в 50 мл эритроцитарной массы при 25°С в течение суток. Надосадочную жидкость анализировали на содержание ФБ спектрофотометрическим методом в виде динитробензофуразанового производного. Для учета возможных изменений концентрации ФБ за счет возможных химических реакций и гемолиза эритроцитов проводили контрольную инкубацию препарата в тех же условиях. Данные эксперимента показали, что 78±4% ФБ оказалось связанным с эритромассой.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о важной роли связывания с биосубстратами в кинетике препарата — в установлении эффективной концентрации в крови, элиминации из крови, прохождении через плазматическую мембрану и гистогематические барьеры и достижении терапевтической концентрации. Разработанный метод определения концентрации фосфабензида в крови и моче позволяет уточнять концентрацию активного вещества в клинических экспериментах in vivo, изучать его метаболизм и экскрецию.