Obtaining resistant hemoglobin crystals from human blood

Abstract

I will not dwell on all the huge literature on this issue, but I will only note that all these works can be divided into two groups: some of them were aimed at obtaining crystal hemoglobin to study its properties, while others were mainly aimed at establishing the differences of blood of different animals by the shape of hemoglobin crystals. It is quite natural that this second group of studies appeared already after the most important morphological properties of crystals had been studied.

Full Text

Более 80 лет прошло с того времени, как была открыта способность гэмоглобина к кристаллизации, но следует сознаться, что и до сих пор мы встречаемся с большими затруднениями при попытках получить стойкие кристаллы этого вещества, а из крови некоторых животных и совсем не можем еще получить таких кристаллов. Между тем с того времени, как Hünefeld¹ впервые описал полученные им между двумя стеклянными пластинками кристаллы высыхающей в экссикаторе крови, появилось немало трудов, посвященных методике получения кристаллов гэмоглобина и описанию их кристаллографических форм.

Я не буду останавливаться на всей огромной литературе этого вопроса, а отмечу только, что все эти работы можно разделить на две группы: одни из них имели целью получение кристаллического гэмоглобина для изучения его свойств, другие же главным образом были направлены на установку отличий крови различных животных по форме кристаллов гэмоглобина. Вполне естественно, что эта вторая группа исследований появилась уже после того, как были изучены важнейшие морфологические свойства кристаллов.

К первой группе исследований надо отнести прежде всего наблюдения Reiсhert’a² над кристалами, найденными им на поверхности последа морской свинки, затем наблюдения Кölliker’a, Leydig’a и Budge, но первым, самостоятельно, а не случайно получившим таковые кристаллы, следует считать Otto Funke³, которому удалось получить, между прочим, и кристаллы гэмоглобина из крови человека, но в очень небольшом количестве, в подсыхающей по краям капле крови.

После того, как Al. Rollett, Lehmann, Hoppe-Seуler, Вötсher, Kühne дали свои методы получения кристаллического гэмоглобина, вопрос о способности последнего к кристаллизации был окончательно разрешен, и разница в форме кристаллов была положена в основу попыток определения вида животного при судебно-медицинском исследовании пятен крови. Вопрос этот был крайне существенен, так как в то время биологическая проба Uhlenhuth’a еще не была известна, определение же вида крови являлось неотложным вопросом судебно-медицинской практики.

Первая работа в этом направлении принадлежала Misuraca⁴, а спустя несколько месяцев после нее появилась небольшая работа по тому же вопросу Мoncton-Copeman⁵. Сводка судебно-медицинских работ по вопросу о получении кристаллов гэмоглобина дана Дворинченко⁶, к труду которого мы и отсылаем всех, желающих ознакомиться с историческим развитием этого вопроса. Здесь же я отмечу только, что и после того, как проба Uhlenhuth’a вполне заслуженна вошла в судебно-медицинскую практику, вопрос о судебно-медицинском значении кристаллов гэмоглобина не остался забытым, и в 1905 году появилась в печати работа Бокариуса⁷, а в 1924 году—работа Amantea⁸, обе посвященные судебно-медицинскому значению кристаллов гэмоглобина.

В настоящее время вопрос о получении кристаллического гэмоглобина вновь приобретает особую важность для судебной медицины в связи с указаниями возможности получения гэмоглобин-преципитинов. Первым получил их Higaschi⁹ в 1923 году, а в 1927 году гэмоглобин-преципитины были получены и в нашей лаборатории¹⁰. Получение гэмоглобин-преципитинов должно повести к полной реформе судебно-медицинского исследования крови, но, к сожалению, до сих пор не было получено стойких кристаллов гэмоглобина из крови человека в количестве достаточном для перекристаллизации их и дальнейшего применения в качестве антигена. Вследствие этого вопрос о получении таковых кристаллов стал неотложным вопросом текущего времени. Настоящая работа именно и посвящается опытам, поставленным в нашей лаборатории с целью выработать такую методику, при помощи которой можно было бы получить достаточное количество стойкого кристаллического гэмоглобина, способного к перекристаллизации.

В этом направлении нами неоднократно были испытаны наиболее известные способы получения кристаллического гэмоглобина. Классических способов, приводимых Preуеr’ом¹¹ в его капитальном труде о кристаллах крови, давно уже известно пять, а именно: 1) метод Lehmann’а с растворением эритроцитов водой и последующим насыщением полученного раствора кислородом и углекислотой и добавлением спирта и эфира, 2) метод Rollett’a с замораживанием крови, 3) метод Bottcher’a—ин’екция животному в вену во время хлороформного наркоза холодной воды, 4) метод Kühne и Thiry с растворением эритроцитов при помощи бычачьей желчи и 5) метод Норрe-Seуlеr’а—растворение эритроцитов водой и добавление 25% алкоголя.

Один из этих способов, именно, способ Böttcher’a, был для нас, по вполне понятным соображениям, совершенно непригоден, другой—способ Kühne и Thiry—мы не применяли из-за боязни внести вещество, способное изменить природу гэмоглобина и загрязнить его, остальные же три способа были испробованы, как вполне пригодные для наших целей.

Первым нами был испробован метод Норрe-Seуlеr’а, как наиболее распространенный. Вначале мы его применяли в том существенном видоизменении, которое было выработано Лабораторией биологической химии Казанского Университета¹², кровь же человека мы или брали на судебно-медицинских вскрытиях, или же нами использовались сгустки послеродовой крови, после взятия сыворотки для иммунизации. Сейчас же после взятия сыворотки эритроциты промывались 1°/о раствором NаСl, смесь отстаивалась и центрифугировалась, затем эритроциты вновь промывались тем же способом еще раза 2—3 и процеживались через полотно для отделения фибрина. К промытым эритроцитам добавлялась для получения лакового раствора дестиллированная вода с примесью эфира, затем строма эритроцитов отделялась продолжительным центрифугированием, лаковый раствор сливался в стеклянный сосуд, охлаждался при температуре от —3° до—20°, и к нему осторожно добавлялся охлажденный до той же температуры 95°/о алкоголь. Количество добавляемого алкоголя колебалось в отдельных опытах в пределах от 25 до 50°/о. Ни при одном из опытов,—а их было 15,—кристаллов гэмоглобина получить не удалось.

Классический метод Hoppe Seyler’a с применением одного спирта, без эфира, привел к таким же, совершенно отрицательным результатам. Тогда мы перешли к методу, предложенному Rollett’oм¹³. Rollett, указывая, что добавление различных, растворяющих эритролиты, веществ задерживает кристаллизацию, рекомендует разрушать эритроциты действием холода. Для этого он ставит платиновый тигель, наполненный дефибринированной кровью, в замораживающую смесь, в которой кровь превращается в кусок льда. Через полчаса замерзшая кровь медленно оттаивается, разливается в стеклянки таким образом, что дно последних покрывается слоем крови высотою около 15 миллиметров, и стеклянки эти ставятся в прохладное место с равномерной температурой для кристаллизации, каковая наступает очень скоро („через несколько четвертей часа“). При испытании способа Rollett’a мы применяли кровь, полученную на вскрытиях трупов. Подлинный способ Rollett’a дал нам кристаллы гэмоглобина только через трое суток.

Тогда мы стали применять двухкратное замораживание и оттаивание крови с последующим центрифугированием лакового раствора для отделения стромы. При этом вполне подтвердилось указание Rollett’a, что кристаллизация значительно облегчается некоторым загниванием крови, и мы обычно после центрифугирования оставляли полученный раствор (который все-таки еще содержал много стромы) при комнатной (или несколько выше) температуре до тех пор, пока не начиналось некоторое разжижение и загнивание крови: после того раствор разливался тонким слоем в чашки Petri и ставился в прохладное место. Через 1—2 суток получались кристаллы гэмоглобина во всем разнообразии их форм, но в известной последовательности. Вначале, при микроскопическом исследовании, можно было заметить только одиночные, бледно окрашенные кристаллы, имевшие форму или четырехгранных, или же шестигранных призм, иногда со скошенными концами, образованными двумя наклонными плоскостями. Кроме этих кристаллов вначале еще получались кристаллы, несколько напоминавшие гробовые крышки, но отличные от кристаллов трипельфосфатов; кристаллы эти местами имели более темную окраску и отчасти напоминали кристаллы, описанные проф. Григорьевым¹⁴ под названием „жировых кристаллов“.

При дальнейшем стоянии крови, обработанной по Rollett’y, постепенно получались более типичные кристаллы гэмоглобина—сначала в виде неправильных, расходящихся как бы лучами и перекрещивающихся между собой, очень тонких и длинных пластинок, затем к ним прибавлялись прямоугольные плоские пластинки, длина которых в 2—3 раза превышала ширину, и, наконец, образовывались кристаллы в виде довольно толстых прямоугольников. Сравнительно реже получались кристаллы гэмоглобина, формой своей напоминавшие раскрытую книгу и, очевидно, представлявшие не одиночные кристаллы, а друзы кристаллов. Количество кристаллов гэмоглобина при дальнейшем стоянии крови постепенно увеличивалось, форма их все более и более становилась правильно-прямоугольной, а вместе с тем наростала и величина отдельных кристаллов, так что дней через 5 —6 некоторые из них становились видимыми невооруженным глазом.

Таким образом при применении метода Rollett’a нам удалось получить стойкие кристаллы гэмоглобина в значительном количестве. Но крупным недостатком метода оказалось то, что кристаллы эти находились среди большого количества стромы эритроцитов, которую не удавалось отделить центрифугированием. Необходимо было как-нибудь видоизменить этот способ, чтобы получить возможность полного отделения стромы и выделения чистых кристаллов. Для этого прежде всего казалось необходимым добавить к крови какой-нибудь жидкости, так как лаковая кровь, полученная по способу Rollett’a, была настолько вязка, что даже продолжительное центрифугирование оказывалось недостаточным для отделения стромы.

С этой целью мы изменили методику таким образом: после обычной обработки трупной крови отделением сыворотки, промыванием 1°/о раствором NаСl, процеживанием через полотно и замораживанием, к полученному лаковому раствору добавлялся малыми порциями охлажденный алкоголь (95%) в количестве, соответствующем 30 частям спирта на 100 частей крови. Затем смесь охлаждалась в снегу с солью. Через 2 часа кристаллов не было. Через 12 часов вся смесь получала вид кашицы, почти сплошь состоявшей из кристаллов гэмоглобина трех видов: 1) веретенообразной формы (наибольшее количество), 2) пластинчатых, с расщепленными концами, и 3) правильных прямоугольников. Все эти кристаллы были нестойки и, при комнатной температуре, при микроскопическом исследовании сначала становились как бы зернистыми, а минут через 5 расплывались и совершенно исчезали.

Попытка центрифугирования этик кристаллов в охлажденной центрифуге оказалась безрезультатной,—кристаллы располагались по прежнему во всех слоях, и осадить их не удавалось. Тогда к 12 куб. сант. кристаллической кашицы было добавлено 9 к. с. дестиллированной воды, и раствор центрифугировался для отделения стромы. Попытки нового получения кристаллов, тем же способом, из этого раствора, однако, опять не удались. Ряд дальнейших подобных же опытов не дал лучших результатов,—перекристаллизация не удалась ни разу.

Невольно возникала мысль, не оказала-ли здесь какого-нибудь влияния продолжительная обработка крови, напр., в смысле изменения содержания кислорода в красящем веществе крови. Еще Moncton-Copeman отметил тот факт, что кристаллы, полученные из крови человека и обезьяны, состоят из восстановленного гэмоглобина. Дворинченко указывает, что в то время, как из крови животных можно получить и кристаллы восстановленного гэмоглобина, и кристаллы оксигэмоглобина, из крови человека всегда получаются кристаллы только первого. То же подтверждает и Bonnel¹⁵.

В виду этого мы произвели спектральное исследование раствора полученной нами кристаллической кашицы после ее центрифугирования. Оказалось, что раствор дает спектр метгемоглобина, а Григорьев давно уже указал, что получить кристаллы последнего можно только из крови животных, и они никогда не получаются из крови человека. Этим, очевидно, и об’ясняются неудачи наших попыток перекристаллизации гэмоглобина. Тогда нами были произведены попытки восстановления образующегося метгэмоглобина вначале небольшим количеством сернистого аммония. Получение кристаллов из восстановленного таким образом раствора не удалось. Пришлось думать о добавлении к крови какого-либо другого вещества, которое действовало бы в качестве восстановителя и препятствовало бы переходу гэмоглобина в метгэмоглобин во время обработки крови.

Вначале, по аналогии с получением гэмохромогена, нами был испробован пиридин. После обычного отделения эритроцитов плацентарной крови, кашица их была поставлена в закрытом сосуде на 12 часов при температуре около 17° R, а затем произведено разрушение эритроцитов замораживанием и центрифугированием, причем стромы отделить не удалось. Вся кашица была разделена на две части—первая около 20 куб. сант., вторая—10 куб. сант. К первой порции был добавлен спирт в количестве 6 куб. сант. и 1 куб. сант. эфира, а ко второй порции 3 куб. сант. спирта с 1°/о пиридина. Через 2¹/₂ часа (в смеси с пиридином несколько раньше) получились кристаллы гэмоглобина, причем в пробирке с пиридином все они были одной и той же формы—в виде вытянутых шестиугольников, а в смеси с эфиром—кроме таких же кристаллов были и игольчатые кристаллы гэмоглобина. Кристаллы эти оказались довольно стойкими и только через трое суток (при хранении их при комнатной температуре) расплывались. В смеси с пиридином стромы оказалось значительно меньше, чем в смеси с эфиром. Попытка перекристализации по тому же способу с применением спирта в смеси с пиридином опять оказалась неудачной.

Следующий опыт был поставлен таким образом, что эритроциты, выделенные из трупной крови обычным способом, были разрушены двукратным замораживанием, и вся масса их разделена на две части, причем к одной было прибавлено небольшое количество (на кончике ножа) сапонина, как это рекомендует Amanteа. Под микроскопом было видно, что после добавления сапонина уцелевшие эритроциты быстро растворяются. Эта порция с сапонином была поставлена на холод. Через 10 часов в ней найдена смесь шестиугольных кристаллов гэмоглобина с игольчатыми п прямоугольными формами. После центрифугирования в охлажденной центрифуге смесь удалось разделить на 2 части,—в верхней половине находилась смесь игольчатых и прямоугольных кристаллов со стромою, в нижней же—исключительно шестиугольные кристаллы без примеси стромы.

Другая порция той же крови была обработана, как это рекомендует Кочкин¹⁶ углекислотой втечение 15 минут, после чего верхние слои раствора (все-таки еще содержавшие строму) были слиты, и к ним добавлено соответствующее количество спирта с пиридином. Нижний слой центрифугировался для более полного осаждения стромы, и к слитому с осадка стромы раствору тоже добавлен спирт с пиридином. В этих растворах только через 3 дня были получены одиночные кристаллы гэмоглобина различной формы. Новый опыт с сапонином дал те же результаты. Перекристаллизация при всех этих опытах совершенно не удалась.

Wedl¹⁷ еще в 1880 году предложил применять для получения кристаллов гэмоглобина пирогалловую кислоту в растворе для получения микроскопических препаратов из капли крови и кристаллическую—для получения больших количеств кристаллов из крови животных. В последнем случае Wedl брал свежую кровь какого-либо позвоночного животного, оставлял ее стоять в закрытом сосуде от 24 до 48 часов, а затем добавлял пирогалловую кислоту; через 24 часа получались многочисленные кристаллы гэмоглобина. Способ Wedl’я большого распространения не получил, и большинство авторов предпочли методику Норрe-Seуlеr’а. Между тем применение пирогалловой кислоты, обладающей сильными восстановляющими свойствами, могло бы оказаться полезным в тех случаях, когда необходимо получение кристаллов восстановленного гэмоглобина, так как можно предполагать, что добавление пирогалловой кислоты будет препятствовать окислению гэмоглобина.

Исходя из такого предположения, мы попытались применить пирогалловую кислоту для получения кристаллического гэмоглобина из крови человека. Для испытания было взято 20 куб. сайт, крови из трупа человека. Промывание эритроцитов 1% раствором NaCl, процеживание через полотно и загнивание крови—как и раньше. Затем к эритроцитам добавлено З¹/2 куб. сант. дестиллированной воды, 1% сапонина и 1 % пирогалловой кислоты, и смесь поставлена при температуре ниже 0°. Через 2 дня--кристаллов нет. Тогда к смеси добавлен алкоголь из расчета 30 на 100. Через несколько часов после того в смеси были обнаружены мелкие кристаллы гэмоглобина неправильной формы в небольшом количестве.

Следующий опыт был более удачен: взято 30 куб. сант. трупной крови человека, произведены обычное отстаивание и снимание сыворотки, промывание раствором NaCl₂ процеживание и загнивание; затем добавлено спирту с 1°/₀ ас. pyrogallici из расчета 30:100. Уже через 12 часов после этого были получены крупные, видимые невооруженным глазом кристаллы в виде палочек длиною около 3 миллиметров. Кристаллы эти были промыты холодной водой с 1% ас. pyrogallici и спиртом (30 час- лей на 100 частей воды) и высушены на холоду при t°—10° С. Высушенные кристаллы, оказалось, хорошо сохраняются при комнатной температуре. Быстрое высушивание их при температуре около +25⁰ С. тоже дает возможность сохранить полученные кристаллы, невысушенные же кристаллы при комнатной t° быстро расплывались. Попытки высушить кристаллы при комнатной t° в экссикаторе над H₂SO₄ оказались неудачными,—кристаллы при такой обработке быстро расплывались.

Еще удачнее оказались попытки сочетания действия низкой t° и спиртового раствора пирогалловой кислоты. Методика была такова: взято 200 куб. сант. труппой крови человека; сыворотка, после отстаивания, тщательно снята, фибрин отделен процеживанием через полотно, эритроциты промыты 1°/₀ раствором NaCl и поставлены на 18 часов для загнивания при t° несколько выше комнатной; затем применено двукратное замораживание для разрушения эритроцитов, по 15 часов каждое, и добавлен охлажденный спирт (в отношении 30 на 100) с 1% пирогалловой кислоты. Тотчас же после добавления спирта образовалось много кристаллов в обычном разнообразии форм, но преимущественно в виде 4 и 6-угольников. Смесь составлена на холоду для дальнейшей кристаллизации. Через 12 часов получилась густая кашица, сплошь состоящая из кристаллов (игольчатые, прямоугольные и шестиугольные). Полученная кашица кристаллов была разделена на 2 части, одна из которых, меньшая. была промыта на центрифуге холодной водой со спиртом и пирогалловой кислотой и высушена на фильтровальной бумаге. Другая, большая часть кристаллов была растворена в минимальном количестве дестиллированной воды (под контролем микроскопа) при сильном встряхивании. Тотчас же после растворения кристаллов к раствору их был добавлен обычный спиртовый раствор пирогалловой кислоты. Через 5 часов получилась кристаллическая кашица.

Ряд следующих подобных же опытов с трупной кровью человека дал те же результаты. Перекристаллизация при всех этих опытах была так же удачна, как и в предыдущем опыте. Методика была совершенно та же, почему я и считаю лишним приводить протоколы этих опытов.

Кроме опытов с получением кристаллического гэмоглобина из трупной крови человека, нами был поставлен ряд подобных же опытов с плацентарной кровью человека и со сгустками крови, полученными из Кожно-венерической клиники КГУ. Методика получения кристаллов была при этом та же самая, что и раньше, и во всех случаях тоже были получены кристаллы, но эти кристаллы в большинстве случаев отличались тем, что здесь преобладающей формой были вытянутые шестиугольники, прямоугольники же встречались только в некоторых опытах и в небольшом количестве.

Из сравнения результатов этих последних опытов с серией исследований трупной крови получается такое впечатление, что, чем более свежа кровь человека, тем более получается из нее шестиугольных кристаллов гэмоглобина и тем меньше—обычных прямоугольных и недоразвитых форм. Возможно, что именно этим и об’ясняется то обстоятельство, что ни одним из прежних авторов не было получено таких форм, и типичной для крови человека до сих пор считалась исключительно прямоугольная форма кристаллов гемоглобина. Дело в том, что форма эта была изучена почти исключительно па микроскопических препаратах, полученных загниванием и испарением или трупной крови, или же водных вытяжек из пятен крови. В настоящее время мы должны отвергнуть этот взгляд и сказать, что из крови человека получаются и прямоугольные, и шестиугольные кристаллы гэмоглобина, причем как те, так и другие должны считаться одинаково часто встречающимися. Даже и в препаратах из трупной крови нам удалось получить шестиугольные кристаллы, хотя и в значительно меньшем количестве.

Резюмируя все вышеизложенное, мы приходим к следующим выводам:

1. Из крови человека можно получить стойкие кристаллы гэмоглобина не только на микроскопических препаратах, но и в больших количествах.
2. Кристаллы эти путем перекристаллизации можно довести до надлежащей чистоты.
3. Наилучшим методом получения кристаллического гэмоглобина из крови человека является следующий: кровь отстаивается, с нее снимается сыворотка, затем эритроциты тщательно отмываются 1% раствором NaCl, процеживаются через полотно и разрушаются двухкратным, приблизительно 15-часовым замораживанием и оттаиванием; полученный лаковый раствор оставляется при комнатной t° на 18 — 24 часа для загнивания, затем к нему добавляется охлажденный 95% винный спирт с 1% пирогалловой кислоты с таким расчетом, чтобы на 100 частей лакового раствора приходилось 30 частей спирта, и смесь ставится на холод для полной кристаллизации; когда получится кристаллическая кашица, последняя фильтруется через бумажный фильтр, осевшие на фильтре кристаллы тщательно промываются дестиллированной водой в смеси со спиртом (30°/о) и пирогалловой кислотой (1°/₀), затем растворяются в минимальном количестве теплой дестиллированной воды, к раствору вновь добавляется спирт с пирогалловой кислотой, смесь вновь помещается на холод для получения кристаллов, и затем, в случае надобности, вся операция повторяется еще несколько раз до тех пор, пока не будут получены вполне чистые кристаллы гэмоглобина.

На описании этой методики я считаю свою задачу законченной, так как дальнейшая работа по определению чистоты полученных таким методом кристаллов гэмоглобина должна, по моему мнению, быть проделана специалистами биолого-химиками.

В заключение считаю необходимым сказать, что выработанная нами методика позволила нам получить такое количество кристаллов гэмоглобина человека, которого оказалось вполне достаточно для опытов иммунизации кроликов этим гэмоглобином. О результате этих опытов будет, доложено особо, после окончания иммунизации.

¹ Der Chemismus in der tierischen Organisation. Leipzig. 1840.

² Beobachtungen über eine eiweissartige Substanz in Krystallform. Arch. f. Anat., Phys, und Wiss. Med., 1849.

³ Zeit. f. rat. Medicin, N. F., 1, 1851.

⁴ Sulla importanza della ricerca dei cristalli di emoglobini. Riv. Sperim. 1889.

⁵ The medico-legal detection of human blood. Brit. Med. Journ., 1889, juli.

⁶ К вопросу об отличии крови человека от крови млекопитающих животных. Дисс., Харьков, 1893.

⁷ К вопросу о кристаллах гэмоглобина с судебно-медицинской точки зрения. Рус. Мед. Вестник, 1905.

⁸ La cristallizzazione dell emoglobina del sangue dissecato. Zacchia, 1924, № 3—4.

⁹ Реф. b. Zentr. f. gerichtl. Medicin, 1925, Bd. V, H. 2.

¹⁰ Гусев. К вопросу об эритропреципитинах и гэмоглобин-прецитатинах. Каз. Мед. Журнал, 1927, № 8.

¹¹ Die Blutkrystalle. Jena. 1871.

¹² Дмитриев. К методике получения стойких кристаллов гэмоглобина. Каз. Мед. Журнал, 1927, № 4.

¹³ Versuche und Beobachtungen am Blute. Moleschott, Untersuchungen, IX.

¹⁴ Об отличительном распознавании крови человека от крови животных по форме кристаллов метгемоглобина и жировых кристаллов. Русский Врач, 1906, № 33.

¹⁵ A propos de la différenciation du sang humain et du sang animal par les cristaux d’hemoglobin. Paris. 1903.

¹⁶ К вопросам о природе гомолитических антигенов. Дисс. Казань. 1911.

¹⁷ Ueber ein Verfahren zur Darstellung der Hämoglobinkrystalle. Virchоw’s Arch., Bd. 80, 1880.