On hemoglobin-precipitins

Abstract

In the August 1927 issue of the "Kazan Medical Journal" I reported the results of my experiments on immunization of rabbits with crystalline horse hemoglobin and then noted the extreme importance of obtaining hemoglobin-precipitin serum for forensic medicine. At that time, I immunized four rabbits with human red blood cell extract and six rabbits with crystalline horse hemoglobin. I will not repeat here the results of immunization, I will only remind you that immunization with an extract of red blood cells did not give a specific serum, while immunization with crystal hemoglobin gave results quite similar to those obtained by Higaschi in 1923.

Full Text

(Сообщение второе).

В августовском номере „Казанского медицинского журнала“ за 1927 год я сообщил результаты своих опытов иммунизации кроликов кристаллическим гэмоглобином лошади и тогда же отметил чрезвычайную важность получения гэмоглобин-преципитиновой сыворотка для целей судебной медицины.

Тогда мною было иммунизировано четыре кролика экстрактом эритроцитов человека и шесть кроликов—кристаллическим гэмоглобином лошади. Я не буду здесь повторять результатов иммунизации, напомню только, что иммунизация экс фактом эритроцитов не дала специфической сыворотки, иммунизация же кристаллическим гэмоглобином дала результаты, вполне сходные с полученными Higaschi в 1923 г.

Из последней группы кроликов одному (№ 5) было произведено две серии инъекций раствора кристаллического гэмоглобина, остальным же (№№ 6—10)—по одной серии из пяти инъекций. Свои опыты я тогда не считал законченными, т. к. практика нашей лаборатории показала, что наиболее высокий титр специфической сыворотки получается лишь после нескольких серий иммунизации, почему в дальнейшем некоторым из кроликов вновь вводился раствор кристаллического гэмоглобина лошади. Приготовление раствора и техника введения его мною указаны в моем первом сообщении, почему здесь я прямо перехожу к изложению полученных результатов.

Кролик № 5, получивший за две первых серии иммунизации всего немного более 0,2861 гэмоглобина, дал тогда сыворотку титра 1:150. Третья иммунизация была произведена в промежуток времени с 28/IV по 14/V того же года, причем кролик получил следующие дозы гэмоглобина лошади: 28/IV—0,0232, 2/V—0,02525, 6/V—0 0315, 10/V—0,03815 и 14/V—0,0404, всего же за третью серию—0,1535.

Испытание титра сыворотки, произведенное 27/V, показало, что даже в растворе кристаллического гэмоглобина 1:1200 через 5 минут получается кольцо мути. Для испытания титра сыворотки был взят раствор кристаллического гэмоглобина, 1 куб. сант., которого содержал 0,0105 гэмоглобина. Следовательно, при растворе 1:1200 положительные результаты были получены даже с количеством гэмоглобина, равным 0,00000792. Безусловно, титр сыворотки настолько высок, что ее вполне можно считать пригодной для практических целей.

Кролик № 6 после второй серии иммунизации, произведенной в то же время и в тех же количествах, что и третья серия у кролика № 5, дал специфическую сыворотку титра 1:800, т. е. положительная реакция препипитации была получена с количеством гэмоглобина, равным’0,0000117.

Кролику № 7 повторная иммунизация была произведена за время с 26/VI по 10/VII 1927 г. в следующих количествах: 26/VI введено 0,02625 гэмоглобина лошади, 30/VI—0,0315, 6/V11—0,03675 и 10/VII— 0,042. Таким образом этому кролику за вторую серию иммунизации было введено 0,1365, а за обе серии—0,4411 гэмоглобина. Для испытания титра сыворотки взят раствор, 1 куб. сант., которого заключал в себе 0,0118 кристаллического гэмоглобина лошади. Положительная реакция через 3 минуты получилась в разведениях до 1: 800, а через 8 минут—и в растворе 1:1000. Следовательно, положительная реакция получилась с количеством гэмоглобина, равным 0,00001062.

У кролика № 8 вторая серия иммунизации в те же сроки и теми же количествами, что и у кролика № 6, дала те же результаты, что и этого последнего.

У кролика № 9 вторая серия иммунизации была произведена в те же сроки и теми же количествами, что и у кролика № 7. Титр сыворотки был тот же, что у последнего, но реакция протекала значительно быстрее и отчетливее.

Кролик № 10 (самка) повторно не иммунизировался вследствие наступившей беременности, а затем кормления кроличат.

Кроме испытания титра сывороток, во всех случаях нами проверялась и их специфичность. Опыты ставились с кровью человека, коровы, сывороткой лошади и физиологическим раствором, применявшимся при опытах. Результаты всех этих опытов во всех случаях были отрицательны.

Таким образом опыты с иммунизацией кроликов кристаллическим гэмоглобином лошади дали вполне удовлетворительные результаты, но практическое значение для судебно-медицинских целей гэмоглобин-преципитиновая проба может прибрести только после того, как будут получены столь же удовлетворительные результаты при иммунизации животных кристаллическим гэмоглобином человека. Между тем в нашем распоряжении не имелось метода, с помощью которого мы могли бы получить кристаллический гэмоглобин человека в количестве, достаточном для имунизации. Попыток получения такого гэмоглобина в больших количествах было немало (литература этого вопроса указана мною в работе „Получение стойких кристаллов гэмоглобина из крови человека“¹, но все эти попытки не приводили к желательным результатам. Поэтому неотложной задачей явилась разработка метода, при помощи которого можно было бы получить достаточное количество стойкого кристаллического гэмоглобина. Зима 1927—28 г. была мною посвящена этим попыткам, и в конце концов мне удалось выработать метод, позволяющий даже при малооборудованной лаборатории получать достаточные количества кристаллического гэмоглобина. Я не буду описывать этот метод, так как он подробно изложен мною в выше цитированной статье, и перехожу прямо к описанию результатов иммунизиции кроликов кристаллическим гэмоглобином человека.

Всего до сих пор мною было иммунизировано этим гэмоглобином шесть кроликов (кролики №№ 11—16), причем всем им было произведено пока лишь по одной серии иммунизации из пяти инъекций.

Раствор гэмоглобина, применявшийся при инъекциях, приготовлялся так же, как и при опытах иммунизации гэмоглобином лошади, с той лишь разницей, что свежеполученный кристаллический гэмоглобин человека оказалсь более легко растворимым, и поэтому для иммунизации применялись более концентрированные его растворы.

Иммунизация производилась в следующие сроки и следующими количествами гэмоглобина: кролику № 11 первая инъекция была сделана 11/ІІ 1928 г., введено 0,0266 кристаллического гэмоглобина человека, вторая инъекция 15/ІІ—0,03325 гэмоглобина, третья 20/ІІ—0,102 гэмоглобина, четвертая 24/ІІ—0,06405 гэмоглобина и пятая 28/ІІ—0,0931 гэмоглобина. Всего за пять инъекций кролик этот получил 0,319 кристаллического гэмоглобина человека.

12/ІІІ было произведено испытание титра и специфичности сыворотки. Для испытания титра взят раствор, заключавший в 1 куб. сант. 0,018 того же гэмоглобина человека. Так как трудно было надеяться после первой же серии иммунизации получить слишком высокий титр сыворотки, то для проверки были взяты лишь растворы до 1 :1000. Во всех пробирках очень быстро появилось кольцо мути, а через 2 минуты—резкое белое кольцо реакции. Таким образом даже 0,0000162 гэмоглобина давало резкую реакцию с сывороткой.

Для испытания специфичности были применены растворы (в тех же концентрациях) гэмоглобина лошади, сыворотки лошади и человека, физиологический раствор, раствор сухой крови коровы и сухой крови человека. Только с последним раствором (кровь человека) были получены положительные результаты, при всех же остальных растворах реакция была отрицательной. Следовательно, полученная сыворотка оказалась строго видо—и органоспецифичной.

Кроликам №№ 12 и 13 инъекции были произведены в те же сроки, что и кролику № 11, но им вводилось несколько меньшее количество гэмоглобина человека, а именно 11/ІІ—0,01995, 15/ІІ — 0,0266, 20/ІІ—0,085, 24/ІІ—0,0549 и 28/ІІ — 0,0798 гэмоглобина. Следовательно, за всю первую серию обоим кроликам было введено по 0,26625 гэмоглобина.

Испытание титра и специфичности сывороток, произведенное 12/ІІІ дало те же результаты, что и у кролика № 11.

Кроликам №№ 14, 15 и 16 была произведена тоже одна серия иммунизации кристаллическим гэмоглобином человека в следующие сроки и следующими количествами (всем трем кроликам инъекции производились в одни и те же дни, и вводилось одно и то же количество гэмоглобина): 29/ІІІ—0,036, 4/IV—0,0431, 9/IV—0,054, 13/IV—0,0612 и 19/IV—0,072 гэмоглобина человека. Всего за пять инъекций кроликам этим было введено по 0,2663 кристаллического гемоглобина.

1/V произведено испытание титра и специфичности сывороток, причем в качестве основного раствора был взят раствор, заключавший в 1 куб. сант. 0,017 кристаллического гэмоглобина человека. Оказалось, что сыворотка кролика № 14 совершенно неспецифична и не дает преципитации ни с одним из примененных для испытания растворов гэмоглобина человека, сыворотка кролика № 15 пределом реакции имеет 0,0000153 гэмоглобина, а сыворотка кролика № 16 тотчас же после добавления дает резкую реакцию с количеством гэмоглобина 0,0000153.

Испытание сывороток кроликов №№ 15 и 16 на их специфичность, поставленное так же, как с сывороткой кролика № 11, дало те же результаты, и сыворотки эти оказались также видо—и органоспецифическими.

Как видно из результатов изложенных опытов, испытание титра полученных сывороток мною до конца не доводилось, и я не пытался установить предела реакции, а довольствовался лишь установлением положительного действия и специфичности сывороток. Несомненно, особенно после повторных серий иммунизации, специфические для гэмоглобина человека преципитирующие сыворотки будут иметь высокий титр, безусловно достаточный для практического применения их,—в этом теперь не может быть никакого сомнения, т. к. даже после первой серии иммунизации были получены сыворотки, реагирующие с минимальными количествами гэмоглобина. Столь же несомненно, что эти гэмоглобин-преципитиновые сыворотки найдут себе широкое применение не только в области судебно-медицинской экспертизы, но и в области практической медицины, например, при диагностике рака и язвы желудка, при которых в настоящее время производится исследование кала на „скрытую“ кровь столь ненадежными реакциями, каковы гваяковая, бензидиновая и др. При применении гэмоглобин-преципитиновой реакции, в виду ее строгой видо—и органоспецифичности, не будет более надобности выдерживать больного на диэте, лишенной мяса, не нужно будет и предварительной «ложной обработки кала, а реакция будет ставиться так же просто, как и с чистыми растворами гэмоглобина, и ex tempore. В этом—большое преимущество гэмоглобин-преципитиновой реакции.

Поставленных нами опытов вполне достаточно для того, чтобы сделать следующие выводы:

1) Иммунизация кроликов растворами кристаллических гэмоглобинов введет к образованию специфических антител.

2) Получаемые при этом сыворотки не только видоспецифичны, но и органоспецифичны.

3) Титр получаемых сывороток достаточно высок для того, чтобы сыворотки эти получили практическое применение.

Безусловно, следует оговориться, что необходимо еще широко подставленное изучение действия на гэмоглобин-преципитиновые сыворотки различных влияний, что должно составить предмет новой и тщательной работы; но я уверен, что это изучение даст нам только ряд новых данных в пользу применения этих сывороток.

¹ Казанский медицинский журнал, 1928, № 7.