Biogenic stress in plants

Abstract

The picture of the pathogens and plant interaction is presented. That is: recognition; the influence of different hydrolases produced by pathogens on plant biopolimers and lipids; elicitors and phytoalexins formation; pathogen-induced proteins synthesis in plants; induction of supersensitivity in cells, surrounding the pathogen infection area; the influence of plant enzymes and toxins on pathogens and finally — working out plant tissues resistance against pathogens (viruses, bacteria and fungi).

Full Text

Обязательным компонентом экологических систем являются растительноядные животные — в том числе; насекомые, микроорганизмы (бактерии, грибы и вирусы), инфицирующие растения. Результатом их деятельности может быть изменение численности и соотношения (а в крайних случаях — набора) различных видов в фитоценозах. Очевидная практическая значимость проблемы устойчивости растений к повреждениям и патогенам давно привлекает к себе' внимание исследователей. В последние десятилетия началась интенсивная разработка молекулярных основ взаимоотношений патогенов и растения-хозяина. Биогенный стресс — ответная реакция растений на механическое повреждение и на действие патогенных микроорганизмов — является существенной частью этих взаимоотношений. Так же, как и стресс, вызванный действием неблагоприятных климатических (засуха и др.) или антропогенных (преимущественно химических) неблагоприятных факторов, биогенный стресс включает совокупность неспецифических ответных реакций, отражающих структурно функциональную перестройку растительного организма, попавшего в экстремальные условия. Обнаруживаются и специфические черты ответа, зависящие от вида стрессора, но по мере усиления меры его действия на первый план во все большей степени начинают выступать неспецифические * изменения. Впервые на этот феномен обратили внимание при изучении животных организмов отечественные исследователи Н. С. Введенский, Д. С. Насонов и В. Я. Александров и др. [1]. Всеобщее внимание к нему было привлечено благодаря работам Г. Селье — не только выдающегося ученого, но и талантливого популяризатора. Предложенное им понятие стресса как совокупности неспецифических ответных реакций, определенным образом развертывающихся во времени после приложения неблагоприятного фактора (стрессора) оказалось применимым и к растительным объектам [32]. Автор настоящей статьи 30 лет тому назад обратил внимание на некоторые неспецифические реакции растений в ответ на действие почвенной и атмосферной засухи или их составляющих — обезвоживания и высокой температуры [32]. Особенно заметно это проявлялось при действии различных стрессоров (в том числе патогенных микроорганизмов) на образование продуктов фотосинтетической фиксации ¹⁴СО₂.

К числу наиболее значительных неспецифических изменений можно отнести следующие [7]: фазность в развертывании во времени ответа на действие стрессора; усиление катаболизма липидов и биополимеров; изменение проницаемости мембран клеток для ионов; повышение в цитоплазме содержания ионов кальция; подкисление цитоплазмы; снижение общей интенсивности синтеза биополимеров и липидов; синтез стрессовых (шоковых) белков; интенсификация синтеза компонентов клеточных стенок — лигнина, суберина, кутина, каллозы, богатого оксипролином белка; накопление пролина (автор был одним из первых исследователей, обративших внимание на сильное накопление пролина в тканях растений пшеницы под влиянием засухи и связавший это с его свойствами осморегулятора [7, 8]; накопление органических полиаминов; повышение содержания фитогормонов — абсцизовой и жасмоновой кислот; продукция этилена; торможение фотосинтеза; усиление дыхания; перераспределение углерода из СО₂, усвоенного в процессе фотосинтеза, среди различных соединении — уменьшение включения метки в высокопол и мерные соединения (белки, крахмал) и сахарозу и усиление (чаще относительное — в % от усвоенного углерода) — в аланин, малат, аспартат; повышение содержания свободных радикалов и др.

Развертывание стресса, вызванного патогенными микроорганизмами, имеет определенные особенности. После контакта с растением патоген начинает выделять токсические вещества (ослабляющие защитную реакцию растений) и ферменты (в основном гидролазы), действующие на полимеры и липиды хозяина. Продукты гидролиза обеспечивают развитие патогена (его питание и энергетический режим). Важная функция промежуточных продуктов деградации биополимеров и липидов — сигнальная [9]. Одни соединения направляются в клетки патогенов, приводя к активизации реакций, обеспечивающих усиление атаки патогена на ткани растения. Другие сигналы (элиситоры) используются для усиления защитных свойств хозяина, его сопротивляемости патогенам. Эти сигнальные молекулы выступают в роли эффекторов экспрессии генов, кодирующих белки- ферменты, катализирующие образование защитных веществ — антибиотиков (фитоалексинов) или соединений, укрепляющих клеточные стенки растений, нейтрализующих токсины патогена и т. д.

Элиситоры могут действовать на генетический аппарат растительных клеток непосредственно или опосредованно — через систему вторичных мессенджеров. В последнем случае в ответную реакцию клеток на элиситоры вовлечены специальные рецепторы клеточной мембраны (плазма- леммы).

Первым звеном во взаимодействии патогена и растения-хозяина являются узнавание и «слипание» (адгезия) их поверхностей. Может осуществляться взаимодействие между остатками галактуроновой кислоты пектинов клеточных стенок ткани хозяина и некоторыми углеводными компонентами клеточной стенки патогена. Доказано также, что в узнавании и связывании поверхности патогена большую роль играют белки — лектины растения-хозяина [25]. Отмечена специфичность многих лектинов по отношению к N-ацетилглюкозаминовым остаткам и олигомерам хитина, являющегося главным компонентом клеточных стенок грибов. Интересно, что олигомерные фрагменты хитина подавляли связывание лектина с патогенными бактериями [25].

В ряде случаев определяющим в инфицировании было не столько взаимоузнавание поверхностей патогена и хозяина, сколько активность ферментов-гидролаз, выделяемых патогеном и разрушающих (размягчающих) покровы растения и клеток.

Наружным покровом растений является кутикула, состоящая главным образом из гетерополимера кутина, погруженного в воск. Обнаружено более 20 мономеров, из которых состоит кутин [11, 29]: различной длины насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты и спирты, в том числе гидроксилированные и эпоксидированные, дикарбоксиловые кислоты и т. д. В кутине большинство первичных спиртовых групп участвует в образовании эфирных связей, как и часть вторичных спиртовых групп, обеспечивающих сшивки между цепями и точки ветвления в полимере. Другой «барьерный» полимер кутикулы — суберин — состоит, по-видимому, из фенольных и алифатических доменов, первые из которых близки по своему составу к лигнину, а вторые — к кутину. Отличия алифатического домена в том, что свободные жирные кислоты являются главным компонентом субериновых восков, в то время как в кутине их очень мало. Кроме того, в суберине присутствуют главным образом С₂₂ и С₂4 жирные спирты, в то время как в кутине — С₂₆ и С₂8 [9].

Оказалось, что многие патогенные грибы могут выделять ферменты, гидролизующие кутин и суберин. При гидролизе лигниноподобной фракции суберина образовывались кумаровая и феруловая кислоты, причем большая часть фракции оставалась негидролизованной. Продуктами кутиназной реакции были различные оксигенированные жирные кислоты и спирты.

В спорах грибов кутиназа содержится в очень небольших количествах, и при контакте с кутикулой растений гидролизу подвергается лишь малая часть кутина. Однако образующиеся активные сигнальные молекулы — 10, 16-ди-гидрокси Си кислоты и 9, 10, 18-тригидрокси Сі₈ кислоты— транспортируются в прорастающую спору и индуцируют образование больших количеств дополнительной кутиназы, начинающей интенсивное разложение кутина и облегчающей инфицирование растения. Было обнаружено, что у патогена лагпериод появления кутиназной мРНК после начала действия упомянутых выше ди- и триоксикислот составляет всего 15 двинут, а появления кутиназы — в два раза больший [30]. Ингибирование кутиназы с помощью химических препаратов или антител предотвращало инфекцию.

К важным последствиям может приводить деградация липидов клеточной мембраны (плазмалеммы) под влиянием липаз, выделяемых патогеном или собственных липаз растений, каким-то образом активируемых при взаимодействии растения-хозяина и патогена. Под влиянием липаз из сложных липидов освобождаются жирные кислоты, в том числе ненасыщенные (например, линолевая и линоленовая). Их оксигенирование, катализируемое липоксигеназами, приводит к появлению соответствующих гидропероксидов. Пероксигеназный путь превращения гидропероксидов полиеновых жирных кислот может вызывать образование гидрокси- и эпоксипродуктов, играющих важную роль в защите растений от грибной инфекции [28]. Например, к числу таких антибактериальных соединений относятся 9, 10-эпокси-12-октадецено- вая (коронаровая) и 12, 13-эпокси-9-октадеценовая (верноловая) кислоты. Они обычно обнаруживаются у растений, устойчивых к грибам-патогенам. Очень сильное антимикробное действие наблюдается у 13-гидроперокси- линолената (вплоть до полного подавления некоторых представителей Gibherella, Fusarium и др.). Меньшим действием обладал 13-гидроксилино- ленат.

Интересно, что эпоксиды линолената могут не только подавлять развитие патогенов, но и обладают свойством стимулировать ростовые процессы у растений [37]. В формировании ответной реакции растений на патогены могут принимать участие также полиеновые жирные кислоты самих патогенов.

Л. И. Ильинская и др. [3] обобщили данные об элиситорном действии на растения несвойственных для них липидов (липопротеинов), продуцируемых патогенными грибами. Оказалось, что элиситорным эффектом обладает не белковая часть липопротеинов, а их липидная часть, представляющая собой несвойственные для высших растений арахидоновую (эйкозатетраеновую) и эйкозопентаеновую кислоты. Они вызывали образование фитоалексинов, некротизацию тканей и системную устойчивость растений к различным патогенам. Продукты липоксигеназного превращения в тканях растений упомянутых выше С₂о жирных кислот (гидроперокси-, гидрокси-оксо-, циклические производные, лейкотриены), образующиеся с помощью имеющегося в клетках хозяина ферментного липоксигеназного комплекса (субстратами которого могут быть как Cis, так и С₂о-полиеновые жирные кислоты) оказывали сильнейшее влияние на защитную реакцию растений. Это объясняется, по-видимому, тем, что в неинфицированных растениях нет оксигенированных производных 20-углеродных жирных кислот, и их появление в результате инфицирования приводит к драматическим результатам, например, к гибели клеток и образованию некрозов, что создает барьер для распространения инфекции. Имеются данные, что индуцирование патогеном липоксигеназной активности приводит к формированию ответной реакции растения и в том случае, когда элиситор не содержал С₂₀-жирных кислот и субстратом липоксигеназной активности могли быть только собственные полиеновые кислоты, а продуктами— октадеканоиды, а не эйкозаноиды. Знаменательно, что глюкан и Са²⁺ усиливали влияние арахидоната и эйкозапентаеноата. Так как ЭГТА (специфический лиганд Са²⁺) ингибировал синтез фитоалексинов, то можно сделать предположение, что ионы кальция играют важную роль в регуляции осуществления защитной функции растений [44].

Одна из важных мишеней гидролитических ферментов патогенных микроорганизмов — это клеточные стенки тканей хозяина. Выделяемые патогенами эндогликозилазы способны определенным образом «разрезать» участки полисахаридов клеточных стенок, освобождая биологически активные олигосахариды. Олигогликозиды, образующиеся в результате па- тоген-индуцированной эндогликозидазной деградации гемицеллюлоз, пектиновых веществ, хитина и хитозана, могут играть роль элиситоров, индуцирующих экспрессию генов, синтез различных фитоалексинов и т. д. [10, 12]. Образование олигосахаридов в результате гидролиза полисахаридов, а не в ходе синтеза из моносахаридов было показано на примере ксилоглюканового олигосахарида, обладающего антиауксиновым действием [34].

Была расшифрована структура ряда олигосахаридов-элиситоров: разветвленного гептаглюкозида, полученного из клеточных стенок патогенного гриба [10], пента- и гексамеров N- ацетилглюкозамина, образующихся при гидролизе хитина, глюкозамина— при гидролизе хитозана; 2—6-мерных, декамерных, 9—13-мерных олигога- лактуронидов — при гидролизе пектиновых веществ [36]; разветвленных 9—10-мерных ксилоглюкановых фрагментов с формулой [Глю (4)-Кси (3)- Гал (1 или 2)-Фук]—при гидролизе гемицеллюлоз [34, 43]. Обнаружение мембранных белковых рецепторов некоторых олигосахаридов [13] дает основание полагать, что эти элиситоры вызывают ответ растительной клетки, используя сигнальные системы вторичных месседжеров (аденилатциклазную, фосфоинозитольную, фосфатидилглицерольную), функционирующие у растений. Не исключено, что сигнальными веществами являются и продукты деградации белков клеточных стенок, богатых оксипролиновыми остатками и содержащих оли- гогликозильные ответвления.

В последнее время к числу элиситоров стали относить салициловую кислоту (известный компонент растительных тканей). Оказалось, что она может принимать участие в формировании устойчивости к патогенам, отвечая за появление свойства сверхчувствительности. У здоровых растений ее содержание невелико, но увеличивается в десятки раз в зоне сверхчувствительности после инфицирования тканей [41]. Обработка растения экзогенной салициловой кислотой приводила к появлению патоген- индуцированных белков [42].

Было показано, что исходным субстратом для синтеза салициловой кислоты является фенилаланин. При участии фенилаланин-аммиаклиазы (фермента, активируемого при биогенном и абиогенном стрессе) из него образуется коричная кислота, из которой, в свою очередь (за счет реакции, аналогичной бета-окислению жирных кислот),—бензойная кислота. Гидроксилирование кольца бензойной кислоты в орта-положении приводи; к появлению салициловой кислоты [41]. Инактивация салициловой кислоты после того, как она выполнит свое предназначение, осуществляется за счет дальнейшего гидроксилирования ненасыщенного кольца или за счет коньюгирования с глюкозой с образованием бета-0-D-глюкозилсали- циловой кислоты. Кстати, быстрое начальное повышение содержания салициловой кислоты в тканях растений в ответ на действие патогена может объясняться, в первую очередь, не активацией синтеза предшественника салицилата — бензойной кислоты, а ее освобождением из «связанного»» состояния. Оказалось, что, например, в здоровых тканях табака до 0,01% от сырого веса составляет коньюгированная форма бензоата, которая после получения клеткой «сигнала» от патогена гидролизуется с образованием свободной бензойной кислоты, превращающейся затем в салициловую [41].

Исследования молекулярных взаимодействий между патогенами и растениями-хозяевами приводит ко все большему расширению круга элиситоров. Эти соединения индуцируют образование генетическим аппаратом растительных клеток так называемых патоген-индуцированных белков (которые или отсутствуют в клетках не-: инфицированных растений или их содержание невелико). Большинство из них — это ферменты, катализирующие реакции, приводящие к подавлению патогена и (или) к повышению устойчивости растений.

Эти белки можно подразделить на ряд групп.

1. Собственно патоген-индуцированные белки, представляющие собой группу щелочных и кислых белков с относительно небольшой молекулярной массой (10 — 20 кД), функции которых в большинстве случаев не выяснены [38].
2. Хитиназы и ß-глюканазы [23, 27, 38, 39], подавляющие развитие грибов и бактерий. Так как хитиназы и эндо- глюканазы локализуются в основном в вакуоле клеток растений, а в случае грибов инфекция начинается или преимущественно сосредотачивается в межклеточном пространстве, то это значит, что для достижения своей мишени ферменты должны быть выведены из вакуоли на поверхность ’клетки. Еще один вариант ингибирующего действия вакуолярных гидролаз на патоген — это отмирание клеток растения, подвергшегося инфекции, освобождение ранее арестованных в вакуолях гидролаз и деградация с их помощью компонентов клеточных стенок патогена. Хитиназы из зерна пшеницы, ячменя и других растений обладали свойствами эндохитиназ, в то время как бактериальные ферменты проявляли экзохитиназную активность.

Хитин (поли-N-ацетилглюкозамин) является компонентом клеточных стенок грибов и членистоногих. В них содержатся и хитиназы, которые наряду с хитин-синтетазными комплексами определяют особенности структуры хитинсодержащих клеточных стенок. Однако хитиназа обнаруживается и у организмов, не содержащих хитина,—у почвенных бактерий (экзохитиназа, отщепляющая по очереди концевые N-ацетилглюкозные остатки) как инструмент добывания пищи и у растений (эндохитиназа) как инструмент защиты от грибной инфекции и от некоторых насекомых. Интересно, что хитиназа растений как индивидуальный белок обладает также свойствами лизоцима [15]. Основными продуктами деградации хитина были хитобиоза, хитотриоза и хитотетраоза.

«Антигрибные» хитиназы, по-видимому, широко распространены в царстве растений, в стеблях и листьях, индуцируясь этиленом или атакой патогенов [15], а в семенах запасаясь как средство повышения устойчивости к грибам почвы. Хитиназы растений действуют прямо на растущие кончики гифов гриба, может быть, вместе, с другими гидролазами, подавляя рост гифов и ограничивая инфицирование растений.

Специальные исследования показали, что при взаимодействии бактерий и тканей хозяина различные деградирующие ферменты появляются неодновременно. Например, пектилметил- эстераза присутствовала и в неино- кулированных бактериями тканях клубней картофеля [35], тогда как полигалактуроназная, пектатлиазная, целлюлазная, протеазная и ксиланазная активности появлялись соответственно через 10, 14, 16, 19 и 22 часа после инокуляции.

3. Ингибиторы протеиназ, вырабатываемые в результате как механического повреждения тканей (например, листогрызущими насекомыми), так и инфицирования патогенами. Их синтез вызван главным образом фрагментами пектиновых веществ клеточных стенок [24, 40]. Интересно, что индукция ингибиторов протеиназ сопровождалась фосфорилированием белков плазмалеммы клеток хозяина [22].
4. Серусодержащие белки — тионины, высокотоксичные для грибов.
5. Белки, ингибирующие работу рибосом патогена, в результате чего затрудняется синтез в них белков и их развитие.
6. Оксипролиновые белки клеточных стенок растений. Важную роль в защите от патогенов играют ферменты — пероксидазы, от активности которых зависят последние этапы синтеза лигнина, в значительной степени определяющего барьерную функцию клеточных стенок.
7. Ферменты, участвующие в синтезе фитоалексинов. К фитоалексинам причисляют более 200 низкомолекулярных антибиотических веществ различной химической природы — сеск- витерпеноиды, фенилпропаноиды, изофлавоноиды, фуранотерпеноиды, дитерпены, нафтальдегиды, полиацетилены, фенантрены, фуранополиацетилены и т. д. [4 — 6]. Их названия чаще всего отражают родовую или даже сортовую принадлежность растения-хозяина.

Фитоалексины, образуясь в здоровых клетках под влиянием элиситоров, транспортируются в место инфекции и вызывают гибель окружающих патоген клеток, у которых вследствие действия элиситоров возникает свойство сверхчувствительности. Это приводит к появлению некротического барьера вокруг патогена, не позволяющего инфекции распространяться по тканям растений. Так как новообразование различных элиситоров, гидролаз, фитоалексинов, токсинов, ингибиторов ферментов и других защитных соединений связано с активацией имеющихся в клетках или с синтезом новых ферментов, то факты индукции экспрессии патогеном большого количества генов не были неожиданными [17, 18, 20, 21, 31].

Реакция растений на действие вирусов, как и на патогенные грибы и бактерии, может варьировать между иммунностью и восприимчивостью [33]. Большинство растений устойчивы к вирусной инфекции благодаря природной селекции в ходе эволюции. Интересно, что свойство устойчивости распространяется из инфицированных в непораженные клетки и ткани. Вирус-реплицирующая способность растений может быть усилена некоторыми фитогормонами (кинетином, ИУК), полианионами (дрожжевой РНК, поли-И, поли-Ц, сополимером этиленмалеинового альдегида, полиакриловой кислотой). Устойчивость развивалась градуально и была чувствительна к актиномицину D.

В настоящее время ставится задача получения трансгенных растений с внедренными генами устойчивости к патогенам. Недавно был опубликован обзор работ в этой области [16]. Удалось выделить ген устойчивости растений кукурузы к грибу Helminto- sporium carbonum [26], отвечающий за экспрессию НАДФН-зависимой редуктазы, способной осуществлять нейтрализацию выделяемого грибом токсического для растений циклического тетрапептида. Выделен также ген аyr 9 гриба Cladosporium fulvum, отвечающий за образование сравнительно небольших пептидов, состоящих из 28 аминокислот, которые вызывают реакцию сверхчувствительности клеток растений [19].

Интересно, что в растениях, как и в животных организмах, может осуществляться индукция иммунности к вирулентной форме патогена в ходе предшествующего воздействия авирулентной формы или убитых, или инактивированных бактерий [14].

Статья открывалась перечнем неспецифических ответных реакций растительных клеток, проявляющихся при действии самых разнообразных стрессоров, в том числе патогенов. К специфическим реакциям, характерным для ответа только на атаку патогенов, относится образование некоторых элиситоров, фитоалексинов, патогениндуцированиых белков. Действительно, часть этих соединений специфична и не образуется при действии эколого-климатических или антропогенных экстремальных факторов. Можно говорить даже о видо- или расоспецифических чертах ответа растерний. Однако многие из них, например некоторые патогениндуцированные белки, синтезируются также при действии абиогенных стрессоров. Правомерен вывод, что в ходе эволюции растение выработало механизм формирования неспецифической устойчивости к патогенам, вызванной предшествующим действием самых различных неблагоприятных факторов. Это объясняется тем, что различные абиотические стрессоры открывают дорогу инфекции непосредственно (например, при механическом повреждении листьев нарушаются защитные покровы и обнажается поверхность клеток внутренних тканей) или опосредованно (за счет нарушения энергетики клеток и т. д.).

Хотелось бы обратить внимание на важность не только теоретических, но и прикладных аспектов проблемы молекулярных взаимоотношений патогенов и растения-хозяина. Это касается и переноса в растения генов устойчивости, и химической наработки природных антибиотических веществ, и обработки ими растений и направленного изменения обмена веществ растений, повышающего сопротивляемость патогенам.