Mitotic disorders in diphtheria intoxication

Abstract

In the extensive literature on the pathomorphology of diphtheria, we did not find information about the effect of diphtheria toxin on mitosis in the affected tissues. Only in one of the works devoted to the description of the cytotoxic effect of the toxin on tissue culture was the disappearance of mitotic figures in an intoxicated cell culture noted [5].

Full Text

В обширной литературе по патоморфологии дифтерии сведений о влиянии дифтерийного токсина на митоз в поражаемых тканях мы не обнаружили. Лишь в одной из работ, посвященных описанию цитотоксического действия токсина на культуру тканей, отмечено исчезновение фигур митоза в интоксицированной клеточной культуре [5].

В предыдущих исследованиях нами было показано, что дифтерийный токсин является митотическим ядом, и высказано предположение о том, что гибель клеток под его воздействием происходит в состоянии деления. Появлению цитотоксического эффекта предшествует значительное нарастание патологических форм митоза и снижение митотической активности до нуля, при этом цитотоксический эффект развивается по мере вступления клеток в митоз [2а, б].

Целью настоящей работы являлось цитоморфологическое исследование нарушений митоза, возникающих при действии дифтерийного токсина на культуру клеток.

В опытах использовали высокочувствительную к токсину культуру клеток перевиваемого амниотического эпителия линии FL человека. Монослойную культуру клеток в пенициллиновых флаконах с покровными стеклами выращивали общепринятым способом на среде 199 с 10% сыворотки, полученной от крупного рогатого скота и с антибиотиками — пенициллином (100 ЕД./мл) и стрептомицином (50 ЕД./мл). Перед опытом на односуточной монослойной культуре ростовую среду заменяли поддерживающей (среда 199 без сыворотки и антибиотиков).

Модель дифтерийной интоксикации односуточного монослоя клеток линии FL воспроизводили высокоочищенным кристаллическим препаратом дифтерийного токсина высокой биологической активности. В 1 мл препарата содержалось 240 флоккулирующих единиц (Lf) токсина, 14300 смертельных доз для морской свинки и 4*10 цитотоксических доз(ЦТД₅₀) В качестве единицы измерений активности токсина использовали ЦТД₅₀ то есть дозу вызывающую гибель 50% клеток монослоя к 72 ч интоксикации.

Испытавали дозы токсина, равные 0,4, 1, 4, 100 и 1000 ЦТД₅₀. Поставлено 7 опытов с 3—4 — кратным испытанием каждой дозы. Наблюдения вели через 1, 3, 6, 18, 24, 48 и 72ч инкубации клеточной культуры с токсином при 37°, делая выемки препаратов опытных и контрольных культур клеток на покровных стеклах. Препараты фиксировали метанолом или по Карнуа в течение 5 мин и окрашивали гематоксилин-эозином, затем заключали в бальзам.
Для цитоморфологического изучения действия дифтерийного токсина на митоз просмотрено и проапальзировано под микроскопом более 255 тыс. клеток на 138 препаратах культур клеток. Определяли влияние токсина на митотический индекс, соотношение фаз митоза, патологические формы митозов по классификации И. А. Алова (1972) и степень цитотоксического эффекта. Материалы обработаны статистически (Р<0,01 и Р<0,001)
Анализ митотической активности кконтрольных клеток по митотическому индексу показывает, что монослойная клеточная культура FL после смены ростковой среды на поддерживающую за 72 ч проделывает два клеточных (жизненных) цикла. Первый цикл с максимумом митозов на 18 ч заканчивается к 24 ч. Второй незначительный подъем митотического индекса идет до 48 ч, затем митотическая деятельность постепенно снижается, и к 72 ч появляются признаки старения монослоя в виде единичных мертвых клеток. Патологические митозы и погибшие клетки в контрольной культуре к этому сроку не превышают 5—7% от общего числа живых клеток.

Учет нормальных и патологических митозов в опытах с кристалическим диферийным токсином показал, что в начале своего действия токсин резко стимулирует митоза. Об этом свидетельствует быстрое нарастание митотического индекса до максимальных величин превышающих уровень контроля в 2-3 раза при действии больших доз токсина. Преобладание ранних фаз митоза-профазы и метафазы также указывает на усиление митотической деятельности. Токсин как бы подталкивает клетку к давлению. Чем больше дозы токсина, тем сильнее и быстрее проявляется его влияние (рис. 1), регистрируемое как в первом, так во втором жизненных циклах. В процессе предыдущих исследований с нативным дифтерийным токсином меньшей удельной активности и при анализе в основном нормальных форм митоза на поздних сроках наблюдения (позже 6 ч после введения токсина) этот факт был выявлен лишь в отношении малых доз токсина, поскольку под действием больших доз нормальные митозы быстро исчезали. Одновременно с ускорением митозов отмечалось быстрое нарастание патологических форм митозов почти до 100°/о незадолго до гибели всего монослоя (рис. 2).

Рис. 1. Влияние дифтерийного токсина на митоз в культуре перевиваемого амниотического эпителия линии FL человека. Обозначения: тонкая линия — митотический индекс (МИ), прерывистая-патологические митозы (ПМ), утолщенная — цитотоксический эффект (ЦТЭ), столбцы с точками— профазы, со скошенными линиями — метафазы, закрашенные- анафазы, с перекрестными линиями — телофазы.

Каков же механизм антимитотического действия дифтерийного токсина? Известно, что нарушение нормального митотического процесса происходит либо в результате повреждения митотического аппарата, обеспечивающего равномерное расхождение разделившихся хромосом к двум полюсам делящейся клетки, либо вследствие повреждения самих хромосом. Соответственно различают две основные группы патологических форм митозов: формы повреждения митотического веретена и формы повреждения хромосом. Данные изучения патологических форм митозов, вызванных токсином, свидетельствуют о повреждении хромосом. На ранних сроках интоксикации обнаруживаются преимущественно набухание и склеивание хромосом в поздней профазе и метафазе с образованием бесформенных комочков или метафазы-шара, с отставанием набухших отечных хромосом в метакинезе, иногда с формированием трехгрупповой метафазы. Затем происходят агрегация и распад скомковавшихся хромосом или их уплотнение в одну массу и пикнотизация (см. рис. 2). Такую картину можно видеть на препаратах с массовой гибелью клеток под действием токсина (рис. 3). Следует отметить, что интерфазные клетки на всем протяжении интоксикации морфологически оставались интактными.

Рис. 2. Патологические формы митозов к исходу дифтерийной интоксикации клеток линии FL при разных дозах токсина. Обозначения: столбцы со скошенными линиями — набухание и слипание хромосом, с точками — отставание хромосом, с перекрестными линиями — распад скомковавшихся хромосом (кариорексис).

Рис. 3. Патологические формы митозов при дифтерийной интоксикации культуры клеток FL (40 ЦТД50, 3 ч). Окраска гематоксилин-эозином. Х 1440. Обозначения: А — метафаза с набуханием, склеиванием и отставанием хромосом; Б — ранняя анафаза с распадом склеившихся набухших хромосом формированием микро ядра; В — фрагментация хромосом- в метафазе; Г — кариорексис- и пикнотизация в телофазе.

В опытных клеточных культурах заметно чаще встречались отставание хромосом, трехгрупповая метафаза и хромосомные (или хроматидные) мосты в ана- и телофазах, что также, по-видимому, связано с набуханием и слипанием хромосом и их неспособностью к нормальному расхождению к полюсам в анафазе.

В отличие от хромосом аппарат деления клетки при дифтерийной интоксикации, очевидно, не страдает, поскольку при этом встречаются все фазы митоза, то есть переход делящейся клетки из одной фазы в другую не нарушается. Кроме того, практически отсутствуют патологические формы митоза, характерные для повреждения веретена деления. Вероятно, в дифтерийной патологии митоза существенной роли не играет и блокада синтеза клеточного белка, наступающая, как известно, в первые часы интоксикации [3, 4, 6]. Если бы митоз нарушался вследствие блокады синтеза белков, участвующих в митотическом процессе, то затруднялось бы само вступление клеток в митоз. Здесь же, наоборот, наблюдалось своеобразное подстегивание митоза и гибель только делящихся клеток с сохранением интерфазных.

При этом гибель делящихся клеток наступала либо па фоне агрегации набухших хромосом и распада поврежденных, либо при их пикпбтизации. По мере увеличения действующей дозы токсина в порядке 0,4 — 1 —100—1000 ЦТД₅₀ процент пикнотизированных клеток возрастал соответственно: 7,7—21,6 — 37,3 — 40,8 при 2,2 в контроле к 72 ч.

Таким образом, в основе цитотоксического эффекта дифтерийного токсина лежит его антимитотическая активность, которая является одним из основных элементов патогенеза дифтерийной интоксикации наряду с известным блокирующим влиянием токсина на синтез клеточного белка. Специфика цитотоксического действия токсина (продолжительность лаг-периода, постепенное развитие цитотоксического эффекта с неодновременным охватом клеток, отсутствие гибели интерфазных клеток) обусловлена особенностями антимитотического действия- токсина. Выявление антимитотического действия дифтерийного токсина свидетельствует о необходимости изучения цитотоксического эффекта и других бактерийных токсинов и микробных факторов.

ВЫВОДЫ

1. Дифтерийный токсин является митотическим дом, убивающим делящиеся клетки.
2. В начале своего действия дифтерийный ток- ин стимулирует вступление клеток в митоз, о чем свидетельствует ускоренное нарастание митотического индекса и профаз.
3. Цитотоксическому эффекту предшествуют рост патологических митозов и снижение митотического- индекса после первоначального подъема.
4. Интерфазные клетки на всем протяжении дифтерийной интоксикации остаются морфологически интактными.
5. Дифтерийный токсин вызывает в делящихся клетках необратимое повреждение хромосом с набуханием и склеиванием их на ранней стадии процесса и распадом (кариорексис) или пикнозом на поздней.