Нарушения митоза при дифтерийной интоксикации

Аннотация

В обширной литературе по патоморфологии дифтерии сведений о влиянии дифтерийного токсина на митоз в поражаемых тканях мы не обнаружили. Лишь в одной из работ, посвященных описанию цитотоксического действия токсина на культуру тканей, отмечено исчезновение фигур митоза в интоксицированной клеточной культуре [5].

Полный текст

В предыдущих исследованиях нами было показано, что дифтерийный токсин является митотическим ядом, и высказано предположение о том, что гибель клеток под его воздействием происходит в состоянии деления. Появлению цитотоксического эффекта предшествует значительное нарастание патологических форм митоза и снижение митотической активности до нуля, при этом цитотоксический эффект развивается по мере вступления клеток в митоз [2а, б].

Целью настоящей работы являлось цитоморфологическое исследование нарушений митоза, возникающих при действии дифтерийного токсина на культуру клеток.

В опытах использовали высокочувствительную к токсину культуру клеток перевиваемого амниотического эпителия линии FL человека. Монослойную культуру клеток в пенициллиновых флаконах с покровными стеклами выращивали общепринятым способом на среде 199 с 10% сыворотки, полученной от крупного рогатого скота и с антибиотиками — пенициллином (100 ЕД./мл) и стрептомицином (50 ЕД./мл). Перед опытом на односуточной монослойной культуре ростовую среду заменяли поддерживающей (среда 199 без сыворотки и антибиотиков).

Модель дифтерийной интоксикации односуточного монослоя клеток линии FL воспроизводили высокоочищенным кристаллическим препаратом дифтерийного токсина высокой биологической активности. В 1 мл препарата содержалось 240 флоккулирующих единиц (Lf) токсина, 14300 смертельных доз для морской свинки и 4*10 цитотоксических доз(ЦТД₅₀) В качестве единицы измерений активности токсина использовали ЦТД₅₀ то есть дозу вызывающую гибель 50% клеток монослоя к 72 ч интоксикации.

Испытавали дозы токсина, равные 0,4, 1, 4, 100 и 1000 ЦТД₅₀. Поставлено 7 опытов с 3—4 — кратным испытанием каждой дозы. Наблюдения вели через 1, 3, 6, 18, 24, 48 и 72ч инкубации клеточной культуры с токсином при 37°, делая выемки препаратов опытных и контрольных культур клеток на покровных стеклах. Препараты фиксировали метанолом или по Карнуа в течение 5 мин и окрашивали гематоксилин-эозином, затем заключали в бальзам.
Для цитоморфологического изучения действия дифтерийного токсина на митоз просмотрено и проапальзировано под микроскопом более 255 тыс. клеток на 138 препаратах культур клеток. Определяли влияние токсина на митотический индекс, соотношение фаз митоза, патологические формы митозов по классификации И. А. Алова (1972) и степень цитотоксического эффекта. Материалы обработаны статистически (Р<0,01 и Р<0,001)
Анализ митотической активности кконтрольных клеток по митотическому индексу показывает, что монослойная клеточная культура FL после смены ростковой среды на поддерживающую за 72 ч проделывает два клеточных (жизненных) цикла. Первый цикл с максимумом митозов на 18 ч заканчивается к 24 ч. Второй незначительный подъем митотического индекса идет до 48 ч, затем митотическая деятельность постепенно снижается, и к 72 ч появляются признаки старения монослоя в виде единичных мертвых клеток. Патологические митозы и погибшие клетки в контрольной культуре к этому сроку не превышают 5—7% от общего числа живых клеток.

Учет нормальных и патологических митозов в опытах с кристалическим диферийным токсином показал, что в начале своего действия токсин резко стимулирует митоза. Об этом свидетельствует быстрое нарастание митотического индекса до максимальных величин превышающих уровень контроля в 2-3 раза при действии больших доз токсина. Преобладание ранних фаз митоза-профазы и метафазы также указывает на усиление митотической деятельности. Токсин как бы подталкивает клетку к давлению. Чем больше дозы токсина, тем сильнее и быстрее проявляется его влияние (рис. 1), регистрируемое как в первом, так во втором жизненных циклах. В процессе предыдущих исследований с нативным дифтерийным токсином меньшей удельной активности и при анализе в основном нормальных форм митоза на поздних сроках наблюдения (позже 6 ч после введения токсина) этот факт был выявлен лишь в отношении малых доз токсина, поскольку под действием больших доз нормальные митозы быстро исчезали. Одновременно с ускорением митозов отмечалось быстрое нарастание патологических форм митозов почти до 100°/о незадолго до гибели всего монослоя (рис. 2).

Рис. 1. Влияние дифтерийного токсина на митоз в культуре перевиваемого амниотического эпителия линии FL человека. Обозначения: тонкая линия — митотический индекс (МИ), прерывистая-патологические митозы (ПМ), утолщенная — цитотоксический эффект (ЦТЭ), столбцы с точками— профазы, со скошенными линиями — метафазы, закрашенные- анафазы, с перекрестными линиями — телофазы.

Каков же механизм антимитотического действия дифтерийного токсина? Известно, что нарушение нормального митотического процесса происходит либо в результате повреждения митотического аппарата, обеспечивающего равномерное расхождение разделившихся хромосом к двум полюсам делящейся клетки, либо вследствие повреждения самих хромосом. Соответственно различают две основные группы патологических форм митозов: формы повреждения митотического веретена и формы повреждения хромосом. Данные изучения патологических форм митозов, вызванных токсином, свидетельствуют о повреждении хромосом. На ранних сроках интоксикации обнаруживаются преимущественно набухание и склеивание хромосом в поздней профазе и метафазе с образованием бесформенных комочков или метафазы-шара, с отставанием набухших отечных хромосом в метакинезе, иногда с формированием трехгрупповой метафазы. Затем происходят агрегация и распад скомковавшихся хромосом или их уплотнение в одну массу и пикнотизация (см. рис. 2). Такую картину можно видеть на препаратах с массовой гибелью клеток под действием токсина (рис. 3). Следует отметить, что интерфазные клетки на всем протяжении интоксикации морфологически оставались интактными.

Рис. 2. Патологические формы митозов к исходу дифтерийной интоксикации клеток линии FL при разных дозах токсина. Обозначения: столбцы со скошенными линиями — набухание и слипание хромосом, с точками — отставание хромосом, с перекрестными линиями — распад скомковавшихся хромосом (кариорексис).

Рис. 3. Патологические формы митозов при дифтерийной интоксикации культуры клеток FL (40 ЦТД50, 3 ч). Окраска гематоксилин-эозином. Х 1440. Обозначения: А — метафаза с набуханием, склеиванием и отставанием хромосом; Б — ранняя анафаза с распадом склеившихся набухших хромосом формированием микро ядра; В — фрагментация хромосом- в метафазе; Г — кариорексис- и пикнотизация в телофазе.

В опытных клеточных культурах заметно чаще встречались отставание хромосом, трехгрупповая метафаза и хромосомные (или хроматидные) мосты в ана- и телофазах, что также, по-видимому, связано с набуханием и слипанием хромосом и их неспособностью к нормальному расхождению к полюсам в анафазе.

В отличие от хромосом аппарат деления клетки при дифтерийной интоксикации, очевидно, не страдает, поскольку при этом встречаются все фазы митоза, то есть переход делящейся клетки из одной фазы в другую не нарушается. Кроме того, практически отсутствуют патологические формы митоза, характерные для повреждения веретена деления. Вероятно, в дифтерийной патологии митоза существенной роли не играет и блокада синтеза клеточного белка, наступающая, как известно, в первые часы интоксикации [3, 4, 6]. Если бы митоз нарушался вследствие блокады синтеза белков, участвующих в митотическом процессе, то затруднялось бы само вступление клеток в митоз. Здесь же, наоборот, наблюдалось своеобразное подстегивание митоза и гибель только делящихся клеток с сохранением интерфазных.

При этом гибель делящихся клеток наступала либо па фоне агрегации набухших хромосом и распада поврежденных, либо при их пикпбтизации. По мере увеличения действующей дозы токсина в порядке 0,4 — 1 —100—1000 ЦТД₅₀ процент пикнотизированных клеток возрастал соответственно: 7,7—21,6 — 37,3 — 40,8 при 2,2 в контроле к 72 ч.

Таким образом, в основе цитотоксического эффекта дифтерийного токсина лежит его антимитотическая активность, которая является одним из основных элементов патогенеза дифтерийной интоксикации наряду с известным блокирующим влиянием токсина на синтез клеточного белка. Специфика цитотоксического действия токсина (продолжительность лаг-периода, постепенное развитие цитотоксического эффекта с неодновременным охватом клеток, отсутствие гибели интерфазных клеток) обусловлена особенностями антимитотического действия- токсина. Выявление антимитотического действия дифтерийного токсина свидетельствует о необходимости изучения цитотоксического эффекта и других бактерийных токсинов и микробных факторов.

ВЫВОДЫ

1. Дифтерийный токсин является митотическим дом, убивающим делящиеся клетки.
2. В начале своего действия дифтерийный ток- ин стимулирует вступление клеток в митоз, о чем свидетельствует ускоренное нарастание митотического индекса и профаз.
3. Цитотоксическому эффекту предшествуют рост патологических митозов и снижение митотического- индекса после первоначального подъема.
4. Интерфазные клетки на всем протяжении дифтерийной интоксикации остаются морфологически интактными.
5. Дифтерийный токсин вызывает в делящихся клетках необратимое повреждение хромосом с набуханием и склеиванием их на ранней стадии процесса и распадом (кариорексис) или пикнозом на поздней.