Possibility of predicting the efficiency of soft tissue sarcoma treatment on the basis of features of their immunological microenvironment

Full Text

Развитие и течение злокачественных опухолей зависят от многочисленных экзогенных и эндогенных факторов, среди которых важное место занимает взаимодействие опухолевых клеток и иммунной системы организма. Однако, если прогностическая оценка пролиферативной активности опухолевых клеток и васкуляризации опухоли получила однозначную интерпретацию, то лимфоцитарная инфильтрация продолжает оставаться областью противоречивых трактовок.

К настоящему времени известно, что иммунологическое микроокружение злокачественных опухолей неодинаково при различной локализации, гистологической характеристике, стадии, степени дифференцировки, плоидности опухоли [1, 2] и других факторах, определяющих прогноз заболевания, что позволяет рассматривать особенности тканевого субпопуляционного состава лимфоцитов в прогностическом аспекте. Так, при прогностически наиболее благоприятном люминальном А-подтипе рака молочной железы описано максимальное количество NK-клеток в ткани опухоли по сравнению с опухолями других подтипов [3], а более длительная выживаемость больных связана с максимальным присутствием среди опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов CD8+-клеток [4]. У больных раком вульвы, у которых первый этап лечения был хирургическим, а в дальнейшем после проведения химиолучевой терапии развилась длительная ремиссия, первоначальный уровень Т-лимфоцитов в опухоли был выше за счёт CD8+-клеток, чем в опухолях больных с кратковременной ремиссией [5].

Исследования связи клинического течения и особенностей локального иммунитета при саркомах мягких тканей (СМТ) немногочисленны, хотя методы иммунотерапии этой патологии активно разрабатываются [6–9]. Данные опухоли отличаются тяжёлым течением, ранним и нередко многократным рецидивированием, слабой чувствительностью к принятым методам лечения, морфологической гетерогенностью [10, 11].

Инвалидизирующие операции, быстрая генерализация и в целом неблагоприятное течение СМТ делают особенно значимой разработку различных лабораторных тестов, направленных на улучшение диагностики, прогнозирования и возможной коррекции лечения. Хотя СМТ и гетерологичны по гистологическому строению, что затрудняет поиск универсальных прогностических критериев, иммунологическое микроокружение связано не только с гистогенезом. Ранее нами, кроме обнаружения ряда различий показателей локального клеточного иммунитета при СМТ между образцами опухоли, перитуморальной зоны и линии резекции, особенности лимфоцитарного состава были также найдены в тканях первичных и рецидивных опухолей, а некоторые из этих особенностей представляются связанными со степенью дифференцировки опухоли [12].

Цель исследования — изучить возможность использования оценки факторов локального клеточного иммунитета для прогнозирования клинической динамики СМТ.

Исследование проведено на базе ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Министерства здравоохранения России».

Под наблюдением находились 38 пациентов с верифицированными злокачественными опухолями мягких тканей туловища и конечностей, проходивших хирургическое лечение с 2014 по 2016 гг. Сроки наблюдения за больными составили от 12 до 30 мес. В выборке были пациенты с первичными СМТ (n=22) и рецидивными опухолями (n=16), в целом сопоставимые по стадиям процесса, гистологическим подтипам опухолей, возрасту и гендерному составу (табл. 1).

 

Таблица 1. Характеристика больных саркомой мягких тканей

Группы пациентов		С первичными опухолями (n=22)	С рецидивными опухолями (n=16)
Средний возраст, годы		53,6	54,8
Пол	мужской	10	8
	женский	12	8
Стадия заболевания	I	0	0
	II	7	5
	III	14	9
	IV	1	2
GRADE	HIGH	5	4
	LOW	17	12
Гистотип опухоли	Липосаркома	4	3
	Недифференцированная плеоморфная саркома	7	5
	Синовиальная саркома	1	1
	Лейомиосаркома	4	3
	Рабдомиосаркома	1	1
	Злокачественная шваннома	1	1
	Ангиосаркома	2	—
	Миксосаркома	1	1
	Злокачественная мезенхимома	1	0
	Фибросаркома	0	1

 

У всех оперированных больных по линиям резекции опухолевые клетки не обнаруживались, по завершении оперативного этапа лечения больные получали адъювантную химио- и лучевую терапию в соответствии со стандартами лечения.

При проведении оценки результатов мы принимали во внимание индивидуальные особенности течения заболевания, на основании которых выделяли больных с условно благоприятным (отсутствие прогрессирования заболевания более 1 года после операции) и неблагоприятным (прогрессирование в течение 12 мес) течением заболевания. У всех пациентов с целью оценки показателей локального иммунитета исследовали полученные интраоперационно ткани опухоли, перитуморальной зоны и условно здоровые ткани, соответствующие линиям резекции (всего 114 образцов).

Образцы тканей измельчали с помощью BD Medimaсhine. Клеточные факторы локального иммунитета определяли на проточном цитометре FACS Canto II (Becton Dickinson, USA). Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов ткани опухоли, перитуморальной зоны и линии резекции оценивали с использованием моноклональных антител BD; исследовали не менее 106 событий. Определяли количественное содержание CD45+, CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD19, CD16/56+, DN (CD3+CD4–CD8–), DP (CD3+CD4+CD8+), NKT (CD3+CD16/56+), CD4+CD25+CD127dim (Т-регуляторных, T-regs) клеток. Долю лимфоцитов, положительных по указанным маркёрам, вычисляли в процентах от общего числа CD45-положительных лимфоцитов, а для T-regs — в процентах от CD3+CD4+-клеток. Кроме того, для каждого показателя клеточного иммунитета вычисляли соотношение, в числителе которого было процентное его содержание в перитуморальной зоне, а в знаменателе — в опухоли (ПЗ/ОП).

Статистическую обработку результатов оценки показателей локального иммунитета выполняли с использованием параметрических (критерий Стьюдента) и непараметрических (критерий Уилкоксона–Манна–Уитни) методов. Бессобытийную выживаемость больных первичными и рецидивными СМТ определяли по методу Каплана–Мейера.

На основании показателей бессобытийной выживаемости больные первичными и рецидивными СМТ были разделены на четыре группы. На рис. 1 представлена бессобытийная выживаемость больных исследованных групп, рассчитанная по Каплану–Мейеру, причём «событием», как правило, было рецидивирование.

Среди 22 больных первичными СМТ у 18 бессобытийный период составил 12 мес и выше (первая группа), у 4 больных он оказался меньше 12 мес (вторая группа). При дальнейшем наблюдении различия бессобытийной выживаемости у этих больных были статистически значимы (см. рис. 1, А).

В группе из 16 рецидивных больных у 9 бессобытийная выживаемость превысила, а у 7 — не превысила 12 мес (третья и четвёртая группы соответственно). ­Указанные ­различия, хотя и выявлены в виде тенденции, выглядят демонстративно, особенно в период наблюдения 12–24 мес (см. рис. 1, Б).

 

Рис. 1. Бессобытийная выживаемость больных первичными (А) и рецидивными (Б) саркомами мягких тканей

 

Наиболее низкую бессобытийную выживаемость больных второй группы можно объяснить тем, что при развитии первого же рецидива они переходили в третью и четвёртую группы и далее находились под наблюдением в их составе. Показатели локального содержания факторов клеточного иммунитета, имеющих статистически достоверные различия в зависимости от развившегося клинического эффекта, у больных сравниваемых групп представлены на рис. 2.

 

Рис. 2. Некоторые показатели локального иммунитета у больных саркомой мягких тканей (СМТ) с различным эффектом от лечения (ось Y — %); А — первичные СМТ (n=22); Б — рецидивные СМТ (n=16); первая группа — первичные СМТ с бессобытийный периодом 12 мес и выше (n=18); вторая группа — первичные СМТ с бессобытийным периодом до 12 мес (n=4); третья группа — рецидивные СМТ с бессобытийным периодом 12 мес и выше (n=9); четвёртая группа — рецидивные СМТ с бессобытийным периодом 12 мес и выше (n=7)

 

Различия между показателями первой и второй групп по уровням NK-клеток, Tregs и между показателями третьей и четвёртой групп по DN-лимфоцитам статистически достоверны (р <0,05).

Как видно из рис. 2, А, у больных первой и второй групп отмечены статистически значимые различия по уровням NK-клеток и Tregs в опухолевой ткани. Более высокий уровень NK-клеток (12,2±1,6% против 6,1±1,2%) и более низкий уровень Tregs (7,52±0,9% против 12,8±1,7% CD3+CD4+-клеток) были ассоциированы с более длительной бессобытийной выживаемостью больных первичными СМТ.

При рецидивных СМТ раннее развитие повторных рецидивов было связано с более высоким уровнем DN-клеток в опухоли (9,3±2,2% против 5,5±0,8%; см. рис. 2, Б). Все указанные различия были статистически значимы (р <0,05).

Другие показатели иммунологического микроокружения опухоли не продемонстрировали статистически достоверных межгрупповых различий, их не было ­также у показателей лимфоцитарного ­состава ­перитуморальных зон и линий резекции. Однако сравнительный анализ коэффициентов соотношения процентного содержания исследованных субпопуляций лимфоцитов в перитуморальной зоне по отношению к их содержанию в опухоли позволил установить следующие статистически достоверные различия. При первичных СМТ у больных первой группы отмечен более высокий коэффициент ПЗ/ОП для NKT-лимфоцитов, который составлял 2,16±0,62 против 0,81±0,084 у больных второй группы (р <0,05). При рецидивных СМТ коэффициент ПЗ/ОП, вычисленный для Т(CD3+)-лимфоцитов, был статистически значимо ниже в третьей группе по сравнению с четвёртой (0,67±0,055 и 1,17±0,2 соответственно; р <0,05).

Итак, выявлены статистически значи­мые различия некоторых показателей локального иммунитета у больных СМТ с различной бессобытийной выживаемостью после операции и проведённым адъювантным лечением.

При первичных СМТ низкое содержание NK-клеток и высокое Тregs в микроокружении опухоли ассоциировалось с рецидивированием, развивающимся в течение первого года после операции. Опухоли больных с бессобытийным периодом от 1 до 3 лет и более, напротив, характеризовались высоким локальным уровнем NK-клеток и более низким Тregs в опухоли, а также более высоким соотношением ПЗ/ОП для NK-Т-лимфоцитов. При рецидивных СМТ риск неблагоприятной клинической динамики был выше у больных с высоким уровнем DN-лимфоцитов в ­опухоли. На ­основании представленных данных получен патент РФ №2625035 [13].

Обнаружение в ткани рецидивных СМТ высоких уровней DN-T-лимфоцитов, не экспрессирующих рецепторов основных субпопуляций, возможно, отражает нарушения процессов дифференцировки Т-клеток, находящихся в микроокружении таких опухолей. Эти лимфоциты считают принадлежащими к субпопуляции Т-клеток с TCRγΔ, которые могут обладать свойствами Тregs [14], хотя у них и не выявлено FoxP3. В норме их высокие количества содержатся в вилочковой железе (тимусе) и лимфоидном аппарате желудочно-кишечного тракта [15], однако описано повышение их уровня в крови при некоторых злокачественных опухолях [16], что предполагает негативные изменения иммунного статуса.

Судя по полученным нами данным, высокий уровень этих лимфоцитов в микроокружении опухоли делает его менее иммунологически полноценным, с чем может быть связано и неоднократное рецидивирование, наблюдаемое в данной группе больных. Что касается присутствия иммунофенотипически документированных Тregs в опухоли, то их негативная роль многократно описана при различных видах онкологической патологии, как и положительное значение наличия в опухолевом очаге NK-и NKТ-лимфоцитов, считающихся важнейшими факторами противоопухолевой защиты.

Ранее нами было показано более низкое содержание в ткани рецидивных СМТ по сравнению с первичными СD3+СD8+-Т-лимфоцитов и более высокое — Тregs, что, по-видимому, характеризует иммуносупрессию, связанную с угнетением цитотоксического звена адаптивного иммунитета при рецидивах. Кроме того, при рецидивных СМТ показатели локального иммунитета в тканях, прилежащих к опухоли, менее значительно отличаются от показателей самой опухоли, чем при первичных, что предполагает выраженное дистантное влияние опухоли, связанное с преимущественным подавлением цитотоксических лимфоцитов (СD3+СD8+ и СD16/56+) [12]. Отмеченную в работе W.W. Tsengetal (2014) [8] отрицательную связь присутствия опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов с общей и бессобытийной продолжительностью жизни больных липосаркомами авторы связывают с найденной ими гиперэкспрессией рецептора апоптоза PD-1 на CD8+-лимфоцитах и редкой частотой выявления NK-клеток в опухолях.

Итак, в нашей работе на исследованном контингенте больных были установлены потенциально прогностически значимые иммунологические характеристики микроокружения СМТ, различные у первичных и рецидивных опухолей. Для демонстрации полученных результатов приводим клинические примеры, демонстрирующие различный статус у больных СМТ с неблагоприятным и благоприятным прогнозом.

Пример №1.

Больной Д. Диагноз: «Рецидивирующая лейомиосаркома мягких тканей области правого плечевого сустава, G3рT2bN0M0, стадия III, состояние после комбинированного лечения (операция + адъювантная паллиативная химиотерапия в 2015 г., операция + 3 курса химиотерапии 2-й линии). Рецидив №2, состояние после хирургического лечения + 4 курса адъювантной паллиативной химиотерапии. Рецидив №3, генерализация процесса, метастазы в лёгкие, клиническая группа 2».

Гистологический анализ №60975-8/15 от 5.08.2015: «G3-лейомиосаркома с некрозом и кровоизлияниями».

Анамнез заболевания. 10.12.2014 по поводу диагноза «Лейомиосаркома мягких тканей области правого плечевого сустава, G3рT2bN0M0, стадия III, состояние после хирургического лечения, клиническая группа 2» выполнена операция: удаление опухоли мягких тканей области правого плеча с пластикой ротационным кожно-жировым лоскутом. По месту жительства проведен курс паллиативной химиотерапии: ­ифосфамид 2,5 г/м2 1–3-й дни + месна 100% 1–4-й дни, дакарбазин 250 мг/м2 1–3-й дни, доксорубицин 20 мг/м2 1–3-й дни. Без эффекта.

На фоне проводимого лечения у больного развился рецидив. 24.03.2015 удаление рецидива опухоли мягких тканей области правого плечевого сустава с резекцией акромиального отростка и пластикой аутодермотрансплантатом. Гистологический анализ: недифференцированная опухоль мягких тканей с обширными очагами некроза, инфильтративным ростом, G3. В поперечнополосатых мышцах крупные петрификаты. С 10.04.2015 по 02.06.2015 проведено 3 курса химиотерапии 2-й линии: трабектедин (йонделис) 2,5 мг на 500 мл изотонического раствора натрия хлорида внутривенно капельно.

Результаты исследования показателей локального иммунитета.

– Первичная опухоль (10.12.2014): CD3+ 78,3%, CD3+CD4+ 27,6%, CD3+CD8+ 43,6%, CD16/56+ 4,5%, CD3+CD4–CD8– 6,5%, CD3+CD16/56+ 6,0%, CD3+CD4+CD25+CD127dim 25,3%.

– Перитуморальная зона: CD3+ 50,6%, CD3+CD4+ 21,0%, CD3+CD8+ 23,5%, CD16/56+ 5,6%, CD3+CD4–CD8– 6,1%, CD3+CD16/56+ 3,6%, CD3+CD4+CD25+CD127dim 6,2%.

– Рецидивная опухоль (24.03.2015): CD3+ 83,1%, CD3+CD4+ 37,3%, CD3+CD8+ 23,1%, CD16/56+ 8,0%, CD3+CD4–CD8– 22,2%, CD3+CD16/56+ 3,5%, CD3+CD4+CD25+CD127dim 20,8%.

– Перитуморальная зона: CD3+ 66,8%, CD3+CD4+ 31,5%, CD3+CD8+ 24,5%, CD16/56+ 6,6%, CD3+CD4–CD8– 17,4%, CD3+CD16/56+ 2,3%, CD3+CD4+CD25+CD127dim5,7%.

Проведённое лечение: 28.07.2015 — удаление опухоли области правого плечевого сустава с пластикой ротационным лоскутом.

Заключение: анализ иммунологических показателей свидетельствует о неблагоприятном течении заболевания с развитием рецидивов.

В результате в феврале 2016 г. пациент обратился с жалобами на рецидив опухоли в области послеоперационного рубца размерами до 5×5×6 см, опухоль изъязвлённая, экзофитной формы. При спиральной рентгеновской компьютерной томографии органов грудной клетки выявлены множественные метастазы в лёгкие. Направлен по месту жительства для проведения 6 курсов адъювантной паллиативной химиотерапии.

Пример №2.

Больной Б. Диагноз: «СМТ правой голени T2bN0M0 (рG3T2bN0M0), стадия III, состояние после хирургического лечения. Клиническая группа 2».

Анамнез. Опухоль появилась около 6 лет назад после тупой травмы. Сначала опухоль была небольших размеров, затем прогрессивно увеличилась, с чем больной и обратился в Ростовский научно-исследовательский онкологический институт.

Проведённое лечение: 17.04.14 фасциально-футлярное удаление опухоли мягких тканей правой голени.

Гистологический анализ №31355-362; 31363-366 от 22.04.2014: G3-полиморфная липосаркома. По линии резекции опухоли нет.

Результаты исследования показателей локального иммунитета (17.04.2014).

– Опухоль: CD3+ 62,9%, CD3+CD4+ 17,7%, CD3+CD8+ 41,8%, CD16/56+ 29,6%, CD3+CD4–CD8– 3,3%, CD3+CD16/56+ 7,2%, CD3+CD4+CD25+CD127dim 2,3%.

– Перитуморальная зона: CD3+ 65,5%, CD3+CD4+ 18,6%, CD3+CD8+ 45,4%, CD16/56+ 33,6%, CD3+CD4–CD8– 1,3%, CD3+CD16/56+ 15,3%, CD3+CD4+CD25+CD127dim 1,2%.

Заключение: анализ иммунологического статуса свидетельствует о благоприятном прогнозе.

В результате развитие рецидива не зарегистрировано.

 

В представленной статье конфликт интересов отсутствует.

About the authors

E Yu Zlatnik

Rostov Research Institute of Oncology

Author for correspondence.
Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

I A Novikova

Rostov Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

E M Nepomnyashchaya

Rostov Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

O N Selyutina

Rostov Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

T V Ausheva

Rostov Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

T A Aliev

Rostov Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

L N Vashchenko

Rostov Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

E P Ul'yanova

Rostov Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

N M Mashchenko

Rostov Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

References

Supplementary files