Морфологическая характеристика заживления ишемизированной экспериментальной раны после применения ауто- и гетерофибробластов и дермального эквивалента
- Авторы: Шаповалова Е.Ю.1, Бойко Т.А.1, Барановский Ю.Г.1, Лугин И.А.1
-
Учреждения:
- Медицинская академия им. С.И. Георгиевского, Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского
- Выпуск: Том 99, № 1 (2018)
- Страницы: 53-59
- Тип: Экспериментальная медицина
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/7809
- DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2018-053
- ID: 7809
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель. Изучить морфологическое строение, коллагенообразование и ангиогенез в биоптатах новообразованного эпидермиса и дермы на 19-е сутки их восстановления в экспериментальной ишемизированной ране после введения ауто- и гетерофибробластов, а также после трансплантации дермального эквивалента с гетерофибробластами.
Методы. Исследование выполнено на 28 белых половозрелых мышах линии С57/В1 в возрасте до 1 года. Вокруг и в дно хирургической экспериментальной кожной раны в лопаточной области вводили 0,4 мл взвеси фибробластов и дермальный эквивалент в количестве 1,33 млн клеток. Биоптат заливали в парафин, окрашивали гематоксилином и эозином и по Вейгерту-Ван-Гизону.
Результаты. Наиболее существенно на регенераторный гистогенез влияет введение аутофибробластов, когда фиксируется наибольшая толщина эпидермиса, наиболее активны ангиогенез и коллагенообразование. Вместе с тем, самым дифференцированным эпидермис становится после трансплантации в рану дермального эквивалента с гетерофибробластами.
Вывод. Благоприятное воздействие дермального эквивалента с гетерофибробластами отличается от воздействия взвеси аутофибробластов всего на несколько процентов: толщина эпидермиса - на 4,29%, площадь коллагеновых волокон - на 2,66%, площадь кровеносных сосудов - на 4,04%, что делает такие различия недостоверными.
Ключевые слова
Полный текст
Длительно существующий дефект кожного покрова остаётся актуальной современной проблемой отечественной и мировой хирургии [1]. Причины утраты кожного покрова бывают разные: нарушение кровоснабжения и иннервации кожи, травмы, в том числе огнестрельные, местное воздействие высоких и низких температур [2], ионизирующего излучения и др. Проблема восстановления кожного покрова не решена, хотя предложено и применяется множество способов: от медикаментозных методов до хирургического пластического закрытия раны [3].
В настоящее время мировые достижения молекулярно-клеточной биологии создали основу для применения клеточных технологий при лечении длительно существующих раневых дефектов [4]. Используют введение в рану аутологических и гетерологических фибробластов, что значительно укорачивает сроки заживления [5, 6]. Несмотря на существующие работы на эту тему [7, 8], перестройки компонентов тканей раны в разные сроки заживления остаются изученными мало.
Цель исследования — изучить морфологическое строение, коллагенообразование и ангиогенез в биоптатах новообразованного эпидермиса и дермы на 19-е сутки их восстановления в экспериментальной ишемизированной ране после введения ауто- и гетерофибробластов, а также после трансплантации дермального эквивалента с гетерофибробластами.
Исследование выполнено на 28 белых половозрелых мышах линии С57/В1 в возрасте до 1 года, которые содержались в виварии Медицинской академии им. С.И. Георгиевского. Животные были разделены на контрольную группу в составе 7 особей и три экспериментальные группы по 7 особей в каждой. Эксперименты проводили со следованием всем принципам гуманности, содержащимся в директиве Европейского сообщества (86/609/ЕС), и в соответствии с «Правилами выполнения работ с привлечением экспериментальных животных».
Во всех группах операцию по моделированию кожной раны в лопаточной области производили после внутрибрюшинного введения 2,5% раствора авертина в количестве 0,3–0,4 мл. Кожу однотипно иссекали в виде круга диаметром 12 мм, к краям раны кожно-фасциальными узловыми швами фиксировали силиконовое кольцо с наружным диаметром 12 мм атравматичным шовным материалом «Полипропилен» 5-0 для исключения возможности эпителизации раны и закрытия её мобильной кожей области спины [9].
Ишемизацию раны проводили путём наложения кисетного шва нитью «Полипропилен» 5-0 на расстоянии 1,0 см латеральнее наружного диаметра раны, что нарушает циркуляцию крови в системе около лопаточных артерий мыши. Артериальный анастомоз вокруг лопаток образован ветвью подмышечной артерии a. circularisscapula и ветвью поперечной артерии шеи a. ramusdescendense, отходящей от подключичного truncus thiriocervicales.
Из иссечённой кожи мышей выделяли фибробласты в условиях стерильного бокса с ламинарным потоком воздуха. Кусочки кожи после ферментативного удаления эпидермиса помещали в среду DMEM F12 (Lonza) и измельчали сосудистыми ножницами до размера 1–2 мм. Затем к кусочкам ткани добавляли равные объёмы растворов коллагеназы I типа (200 ЕД/мл, Sigma) и диспазы (30 ЕД/мл, Gibco). Полученную смесь инкубировали в течение 1 ч при 37 °C и постоянном перемешивании.
После фильтрации суспензии через фильтр диаметром 0,40 мкм и центрифугирования в течение 7 мин при 1000 об./мин фибробласты ресуспендировали и культивировали в среде DMEM F12 (Lonza) с добавлением 10% телячьей сыворотки (HyClone) и 50 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина (ПанЭко) в чашках Петри в инкубаторе при температуре 37 °C и концентрации СО2 5% до достижения 100% конфлюента. Для пересева клеток использовали 0,25% трипсин с 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислотой.
В первой и второй экспериментальных группах интраоперационно в дно раны и вокруг неё вводили 0,4 мл взвеси фибробластов 1-го или 2-го пассажа в ростовой среде DMEM F12 (Lonza) в количестве 1,33 млн клеток. В первой экспериментальной группе вводили гетерофибробласты, во второй — аутофибробласты.
В третьей экспериментальной группе в рану трансплантировали дермальный эквивалент с гетерофибробластами, приготовленный на основе коллагена I типа из крысиных хвостов. Стерильный 0,34 М раствор NaOH объединяли с концентрированной (×10) питательной средой 199 в соотношении 1:1. Полученную смесь соединяли с охлаждённым раствором коллагена, после чего добавляли суспензию фибробластов в питательной среде DMEM F12, содержащей 10% эмбриональной сыворотки (HyClone). Полученную смесь инкубировали при 37 °C в инкубаторе до полной полимеризации геля [10].
На 19-й день после операции у мышей всех групп интраоперационно иссекали образовавшийся биоптат и фиксировали 10% забуференным формалином для морфологического исследования. Материал заливали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Вейгерту–Ван-Гизону для визуализации эластических и коллагеновых волокон.
Морфологическое исследование гистологических препаратов проводили с помощью светооптического микроскопа OLIMPUS СХ-31 с цифровой камерой OLIMPUS 35050Z. Толщину эпидермиса, количество микрососудов в срезах, площадь коллагеновых волокон и микрососудов в дерме биоптатов измеряли с помощью программы «ImageJ» при увеличении объектива 40 и окуляра 10 по 50 замеров в каждой группе. Полученные цифровые данные (выраженные в пикселах) были переведены в микрометры при помощи деления количества пикселов на коэффициенты, специально для этого выведенные: объективы ×10 — 6379251, ×40 — 98911797.
Статистическую обработку цифровых данных проводили с использованием лицензионного программного обеспечения Microsoft Office Excell и Statistica 10.0. Сравнение средней толщины эпидермиса, площади, занимаемой коллагеновыми волокнами и сосудами грануляционной ткани, в биоптатах экспериментальных групп проводили в процентах по отношению к контрольной группе.
В ходе заживления экспериментальной раны происходило самопроизвольное отпадение силиконового кольца за счёт постепенной эпителизации раны от краёв к центру и прорезывания удерживающих кольцо швов, что расценивалось как важный признак активности регенеративных процессов. У мышей контрольной группы отпадение силиконового кольца было зафиксировано в среднем на 12,4±0,10 сутки после операции по созданию экспериментальной раны. Под толстыми остатками струпа обнаруживалась полная эпителизация раны.
Рис. 1. Биоптаты кожи мыши. Контрольная группа. Окраска гематоксилином и эозином. 1 — эпидермис; 2 — кровеносный сосуд; 3 — остатки шовного материала; 4 — лейкоцитарная инфильтрация; 5 — коллагеновые волокна. Увеличение: окуляр ×10, объектив ×20
На 19-е сутки после моделирования раны эпидермис биоптата образован многослойным эпителием толщиной 55,24±0,11 мкм (табл. 1). Видны базальный слой, несколько рядов шиповатых клеток и фрагментарно просматривается зернистый слой. Роговой слой тонкий и находится на начальных стадиях дифференцировки клеток (рис. 1). На срезах просматриваются остатки шовного материала удерживавшего силиконовое кольцо. Они осумковываются эпидермоцитами с лейкоцитарной инфильтрацией вокруг.
Таблица 1. Количественные характеристики биоптатов кожи мышей контрольной и экспериментальных групп
Биоптаты кожи | Толщина эпидермиса, мкм | Площадь дермы на срезах, мкм | Площадь сосудов в дерме, % | Площадь коллагеновых волокон в дерме, % |
Биоптаты кожи в контрольной группе | 55,24±0,11 | 68 567,77±2,16 | 1,02±0,01 | 33,76±0,22 |
Биоптаты кожи в первой экспериментальной группе | 64,29±0,20 | 47 825,70±1,45 | 1,19±0,03 | 55,44±0,17 |
Биоптаты кожи во второй экспериментальной группе | 111,62±0,35 | 58 820,47±2,15 | 1,80±0,02 | 63,14±0,12 |
Биоптаты кожи в третьей экспериментальной группе | 102,74±1,13 | 54 128,58±2,09 | 1,68±0,01 | 60,15±0,37 |
Под эпидермисом расположена грануляционная ткань, выполняющая полость раны. Граница между эпидермисом и будущей дермой чёткая за счёт формирования базальной мембраны и волнистая. Полноценные сосочки не сформированы. Грануляционная ткань образована переплетающимися коллагеновыми волокнами без чёткой ориентации, между которыми присутствуют клетки, представленные преимущественно функционально активными фибробластами. Коллагеновые волокна занимают 33,76±0,22% площади дермы.
Эластические волокна отсутствуют. Немногочисленные кровеносные капилляры и венулы расширены, их площадь составляет 1,02±0,01% площади дермы. Имеются вертикально расположенные капилляры различного диаметра. Стенка сосудов состоит из одного ряда эндотелиальных клеток.
У мышей первой экспериментальной группы эпителизация раны и отпадение силиконового кольца зафиксированы на 1 день раньше, чем в контроле, а именно на 11,4±0,06 сутки после операции и введения взвеси гетерофибробластов на ростовой среде ДМЕМ F12. При этом толщина эпидермиса была на 14,08% больше, чем в группе контроля, и составляла 64,29±0,20 мкм. Эпидермис сформирован и состоит из четырёх слоёв: базального, шиповатого, зернистого и рогового. Зернистый слой просматривается участками (рис. 2, А). Базальная мембрана ровная, лейкоцитарная инфильтрация отсутствует. Грануляционная ткань под эпидермисом представлена тонкими пучками неориентированных коллагеновых волокон, кровеносными сосудами и клеточными элементами. Коллагеновые волокна занимают в среднем 55,44±0,17% площади дермы, что на 39,11% больше, чем в контрольной группе. Эластические волокна отсутствуют во всех участках дермы. Площадь кровеносных капилляров больше на 14,29% по сравнению с группой контроля.
У мышей второй экспериментальной группы на фоне введения взвеси аутофибробластов в ростовой среде ДМЕМ F12 эпителизация раны и отпадение силиконового кольца зафиксированы ещё раньше, чем в контроле и первой экспериментальной группе, — на 11,00±0,01 день после операции. На 19-е сутки регенераторного гистогенеза устранение тканевого дефекта кожи наиболее значительно продвинулось. Толщина эпидермиса зафиксирована на 50,52% больше, чем в контрольной группе. Значительно более дифференцированными были слои эпидермиса. На поверхности заметен выраженный роговой слой (рис. 2, Б). Эпидермис вдаётся в подлежащую грануляционную ткань, формируя сосочки и закладки волос.
Рис. 2. Биоптаты кожи мыши. А — первая экспериментальная группа; Б — вторая экспериментальная группа; 1 — эпидермис; 2 — кровеносный сосуд; 3 — сосочки; 4 — фибробласты; 5 — коллагеновые волокна. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: окуляр ×10, объектив ×20
Рис. 3. Биоптаты кожи мыши. А — вторая экспериментальная группа, окраска по Вейгерту–Ван-Гизону; Б — третья экспериментальная группа, окраска гематоксилином и эозином; 1 — эпидермис; 2 — кровеносный сосуд; 3 — сосочки; 4 — волосяной фолликул; 5 — коллагеновые волокна. Увеличение: окуляр ×10, объектив ×20
Грануляционная ткань характеризуется во второй группе мощным усилением процессов ангиогенеза и коллагенообразования. Коллагеновые волокна приобрели некоторую регулярную ориентацию параллельную эпидермису, особенно заметную в глубоких слоях (рис. 3, А). Площадь, занятая коллагеновыми волокнами, увеличилась на 46,53% по сравнению с контролем и составила 63,14±0,12% площади грануляционной ткани, а сосудов — на 43,33% и составила 1,73±0,01% (см. табл. 1). Лейкоцитарная инфильтрация отсутствовала. Клеточные элементы фибробластического ряда были представлены крупными и вытянутыми отростчатыми клетками, что свидетельствовало об их функциональной активности. Эластические волокна отсутствовали во всех участках дермы.
У мышей третьей экспериментальной группы отпадение силиконового кольца фиксировалось на 12,20±0,11 день после операции. На 19-й день после трансплантации дермального эквивалента с гетерофибробластами рана была покрыта толстым пластом эпидермиса. Эпидермис выглядел более дифференцированным, чем в предыдущих группах. Присутствовали и были хорошо развиты все слои эпидермиса, в том числе и зернистый слой. Толщина эпидермиса составляла 102,74±1,13 мкм, что на 43,87% больше, чем в группе контроля. Эпидермис образовывал выросты в подлежащую грануляционную ткань, являющиеся закладкой волос и сосочкового слоя дермы (рис. 3, Б). В грануляционной ткани дермы видны сформированные закладки волос. Площадь, занятая коллагеновыми волокнами, увеличилась на 43,87% по сравнению с группой контроля и составила 60,15±0,37%, а сосудов — на 39,29% и составила 1,68±0,01% площади грануляционной ткани (см. табл. 1). Тонкие слабо ориентированные пучки коллагеновых волокон заполняли всю дерму биоптата.
Выводы
1. На 19-й день заживления ишемизированной раны кожи раневой процесс находится в процессе перехода от стадии пролиферации с образованием грануляционной ткани в стадию дифференцировки или фиброзирования.
2. Наиболее существенно на регенераторный гистогенез влияет введение аутофибробластов, когда фиксируется наибольшая толщина эпидермиса, наиболее активны ангиогенез и коллагенообразование.
3. Самым дифференцированным эпидермис становится после трансплантации в рану дермального эквивалента с гетерофибробластами за счёт наличия закладок волос в виде сформированных волосяных фолликулов.
4. Благоприятное воздействие дермального эквивалента с гетерофибробластами отличается от воздействия взвеси аутофибробластов всего на несколько процентов: толщина эпидермиса — на 4,29%, площадь коллагеновых волокон — на 2,66%, площадь кровеносных сосудов — на 4,04%, что делает такие различия недостоверными.
Работа поддержана проектом «Сеть академической мобильности “РНИЭМ”» ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» и выполнена с использованием инфраструктуры НУЗ НКЦ ОАО «РЖД» (г. Москва) и ФГБУН «Институт цитологии РАН» (г. Санкт-Петербург).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.
Об авторах
Елена Юрьевна Шаповалова
Медицинская академия им. С.И. Георгиевского, Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского
Автор, ответственный за переписку.
Email: Shapovalova_L@mail.ru
г. Симферополь, Россия
Татьяна Анатольевна Бойко
Медицинская академия им. С.И. Георгиевского, Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского
Email: Shapovalova_L@mail.ru
г. Симферополь, Россия
Юрий Геннадиевич Барановский
Медицинская академия им. С.И. Георгиевского, Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского
Email: Shapovalova_L@mail.ru
г. Симферополь, Россия
Игорь Анатольевич Лугин
Медицинская академия им. С.И. Георгиевского, Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского
Email: Shapovalova_L@mail.ru
г. Симферополь, Россия
Список литературы
- Govrin G. New method for treating hard-to-heal wounds: clinical experience with charged polystyrene microsphers. Wounds. 2010; 6 (4): 52-61.
- Данилов Р.К. Раневой процесс: гистогенетические основы. СПб.: ВМедА. 2008; 380 с.
- Хрупкин В.И., Зубрицкий В.Ф., Ивашкин А.Н. и др. Дерматопластика раневых дефектов. М: ГЭОТАР-Медиа. 2009; 102 с.
- Винник Ю.С., Салмина А.Б., Дробушевская А.И. и др. Клеточные технологии и тканевая инженерия в лечении длительно не заживающих ран. Вестн. эксперим. и клин. хир. 2011; 4 (2): 392-397.
- Шаповалова Е.Ю., Бойко Т.А., Барановский Ю.Г. и др. Морфологическая характеристика заживления ишемизированной экспериментальной раны на 12 сутки после применения ауто- и гетерофибробластов и дермального эквивалента. Международ. науч.-исслед. ж. 2017; (8-3): 51-55.
- Porter S. The role of the fibroblast in wound contraction and healing. Wounds. 2007; 3 (2): 45-48.
- Зорин В.Л., Зорина А.И., Петракова О.С., Черкасов В.Р. Дермальные фибробласты для лечения дефектов кожи. Гены & Клетки. 2009; 4 (4): 26-40.
- Мелешина А.В., Быстрова А.С., Роговая О.С. и др. Тканеинженерные конструкты кожи и использование стволовых клеток для создания кожных эквивалентов (обзор). Соврем. технол. в мед. 2017; 9 (1): 198-218. doi: 10.17691/stm2017.9.1.24.
- Барановский Ю.Г., Ильченко Ф.Н., Шаповалова Е.Ю. Способ моделирования трофической язвы у лабораторных мышей в опытной модели. Вестн. неотложной и восстановительной хир. 2016; 1 (2): 258-260.
- Андреев Д.Ю., Абрамова Н.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. Эффективность кожной пластики и дермального эквивалента в лечении обширных язв голени смешанного генеза. Вестн. хир. им. И.И. Грекова. 2013; 172 (1): 104-107.