Effect of 3d-metal gluconates on leukocyte parameters of endogenous intoxication

Full Text

Актуальность

Лечение онкологической патологии цитостатическими препаратами часто сопровождается развитием эндогенной интоксикации [1, 2]. Она бывает следствием таких деструктивных процессов, как интенсификация свободнорадикального окисления и лавинообразное ускорение мембранодеструкции, что ведёт к токсино­образованию и срыву компенсаторных возможностей органов детоксикации. При недостатке факторов, осуществляющих репарацию, клетка оказывается неспособной устранить возникшие повреждения и вступает в апоптоз [2]. Для снижения степени эндогенной интоксикации при химиотерапии используют иммунокорригирующие препараты [1].

Ряд соединений переходных металлов, в частности 3d-металлов, способен оказывать влияние на систему иммунитета — стимулировать фагоцитарную активность лейкоцитов, регулировать функционирование макрофагов, секрецию цитокинов [3–6]. Как показано в работах [7–9], эффективное антиоксидантное и иммуномодулирующее действие проявляют глюконаты ряда 3d-металлов общей формулы M (Gl)2∙2Н2О (MGl), где М — Mn, Fe, Co, Cu, Zn.

Ранее нами было показано in vivo корригирующее действие MGl на гуморальное звено иммунитета при введении циклофосфамида (ЦФ) [10], который находит широкое применение как в клинической практике, так и в научных разработках для создания моделей индуцированной иммуносупрессии [11]. Представляет интерес оценка влияния MGl на изменение степени эндогенной интоксикации на фоне действия ЦФ.

Одним из достоверных методов оценки реактивности иммунной системы при химио­терапии, позволяющих судить о степени эндогенной интоксикации, служит определение лейкоцитарных индексов в пробах периферической крови [12, 13].

Цель

Целью данного исследования была оценка действия глюконатов 3d-металлов (Mn, Fe, Co, Cu, Zn) на степень эндогенной интоксикации у мышей на фоне цитостатического воздействия ЦФ методом определения лейкоцитарных индексов.

Материал и методы исследования

Эксперимент проводили на белых беспородных лабораторных половозрелых мышах-самцах с массой тела 25–28 г, содержащихся в условиях вивария ФГБОУ ВО БГМУ Мин­здрава России на стандартном питании (ГОСТ Р50258-92) в соответствии с международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также с правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96, ГОСТ З 51000.4-96; заключение экспертного совета по биомедицинской этике от 25.06.2021).

После окончания эксперимента мышей декапитировали под эфирным наркозом.

В работе использовали: цитостатик ЦФ («Бакстер АГ», Швейцария); иммуностимулятор глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) в виде препарата ликопид (химическое название [4-O-(2-ацетиламино-2-дезокси-β-D-глюкопиранозил)-N-ацетилмурамил]-L-аланил-D-α-глутамиламид) (АО «Пептек», Россия), действующим веществом которого он является; кальция глюконат (раствор для инъекций, АО ­БИННОФАРМ, Россия; CаGl); глюконаты 3d-металлов (MGl), синтезированные и охарактеризованные комплексом физико-химических методов по методикам, описанным ранее [7].

Животные были разделены на 9 групп по 12 особей в каждой. ЦФ вводили в виде однократной внутрибрюшинной инъекции (50 мг/кг) во всех группах животных, за исключением интактных. С целью коррекции изменений в иммунной системе после цитостатического воздействия использовали MGl и препараты сравнения ГМДП и кальция глюконат, введение которых начинали через 24 ч после введения цитостатика и далее ежедневно перорально в течение 21 дня в дозе 1/10 LD50 желудочным зондом в виде водных растворов. Контрольным интактным животным, а также получившим только ЦФ, вводили соответствующий объем дистиллированной воды.

Распределение животных по группам следующее: 1 — интактные, 2 — введение ЦФ без лечения, 3 — группа сравнения с введением ЦФ и иммуностимулятора ГМДП, 4 — группа сравнения с введением ЦФ и кальция глюконата, группы 5–9 — ЦФ и глюконаты 3d-металлов (MnGl, FeGl, CoGl, CuGl и ZnGl соответственно).

На 22-е сутки проводили забор крови и приготовление мазков с окраской по Романовскому–Гимзе. Затем определяли лейкоцитарную формулу с последующим расчётом лейкоцитарных индексов. Для оценки степени эндогенной интоксикации использовали следующие индексы.

1. Индекс стрессорной активности по Л.X. Гаркави (индекс напряжённости иммунного статуса), отражающий взаимоотношение гуморального и клеточного звеньев иммунной системы: индекс стрессорной активности = лимфоциты / сегментоядерные нейтрофилы. Повышение индекса свидетельствует об эндогенной интоксикации и токсической иммуносупрессии.
2. Лейкоцитарный индекс интоксикации Я.Я. Кальф-Калифа в модификации Б.А. Рейса, характеризующий активность процессов фагоцитоза и пролиферации нейтрофилов: лейкоцитарный индекс интоксикации = нейтрофилы / моноциты + лимфоциты + эозинофилы. Данный индекс снижается в фазу иммуносупрессии.
3. Ядерный индекс степени эндотоксикоза, характеризующий скорость регенерации нейтрофилов и моноцитов, а также продолжительность их циркуляции в кровяном русле: ядерный индекс степени эндотоксикоза = моноциты + палочкоядерные нейтрофилы / сегментоядерные нейтрофилы. Этот индекс увеличивается в острой фазе интоксикации вследствие цитолиза сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов.
4. Индекс сдвига лейкоцитов, характеризующий отношение гранулоцитов к агранулоцитам. Уменьшение данного индекса свидетельствует о нарушении иммунологической реактивности.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 10.0. Для расчёта значимости различий между группами применяли непараметрический критерий Манна–Уитни. Изменения считали значимыми при p <0,05.

Результаты и обсуждение

Как показали проведённые исследования, после однократного введения ЦФ в дозе 50 мг/кг происходило существенное изменение лейкоцитарной формулы, в частности содержание эозинофилов упало более чем в 10 раз, моноцитов — почти в 3 раза, сегментоядерных нейтрофилов — примерно в 1,5 раза. Количество палочкоядерных нейтрофилов, напротив, возросло в 2 раза, лимфоцитов — в 1,1 раза (табл. 1). Такие изменения содержания клеток иммунной системы в крови животных, в частности уменьшение соотношения зрелых и молодых нейтрофилов (так называемый сдвиг лейкоцитарной формулы влево), свидетельствуют об острой интоксикации организма животных.

 

Таблица 1. Влияние глюконатов 3d-металлов на лейкоцитарную формулу при эндогенной интоксикации мышей циклофосфамидом (ЦФ) (Ме [Q₁–Q₃])

№	Группа, n=12	Эозинофилы	Палочкоядерные нейтрофилы	Сегментоядерные нейтрофилы	Лимфоциты	Моноциты
1	Контроль, интактные	0,4 [0, 35–0, 43]	1,02 [0, 9–1, 1]	22,7 [20, 9–25, 1]	74,3 [67, 5–81, 4]	1,43 [1, 22–1, 58]
2	Контроль, ЦФ без лечения	0,03 [0, 02–0, 04]1	1,97 [1, 8–2, 1]1	14,9 [13, 3–15, 9]1	86,4 [77, 1–91, 9]1	0,52 [0, 47–0, 54]1
3	ЦФ+ГМДП	0,81 [0, 78–0, 83]1,2,4,5,7,8	0,38 [0, 36–0, 45]1,2,4–9	16,3 [15, 6–18, 3]1,2,5,9	79,4 [75, 0–89, 3]	0,61 [0, 56–0, 66]1,2,4–9
4	ЦФ+СаGl	0,4 [0, 38–0, 44]2,5–9	0,2 [0, 17–0, 22]1,2,5–8	16,6 [14, 8–17, 9]1,2,5,9	79,0 [73, 2–85, 3]	1,2 [1, 12–1, 30]1,2,5–9
5	ЦФ+MnGl	1,01 [0, 92–1, 09]1,2,6,7,9	1,22 [1, 13–1, 28]1,2,6–9	23,1 [20, 5–23, 9]2,6–9	77,0 [69, 0–79, 2]2	1,81 [1, 64–2, 01]1,2,6,7,9
6	ЦФ+FеGl	0,78 [0, 73–0, 87]1,2,7,8	0,91 [0, 86–1, 11]2,7–9	16,6 [16, 3–17, 8]2,9	76,1 [71, 3–84, 1]2–6	2,63 [2, 4–2, 8]1,2,8
7	ЦФ+СоGl	0,51 [0, 46–0, 55]1,2,8,9	0,78 [0, 74–0, 86]1,2,9	18,0 [16, 8–19, 4]1,2	76,6 [71, 2–84, 1]2	2,78 [2, 54–2, 98]1,2,8,9
8	ЦФ+СuGl	0,98 [0, 8–1, 0]1,2,9	0,82 [0, 74–0, 87]1,2,9	17,9 [17, 1–19, 6]1,2	79,4 [73, 9–83, 9]	1,76 [1, 62–1, 96]1,2,9
9	ЦФ+ZnGl	0,78 [0, 73–0, 87]1,2	0,21 [0, 19–0, 23]1,2	19,1 [18, 3–20, 6]1,2	78,8 [70, 3–84, 6]	2,39 [2, 19–2, 62]1,2

Примечание: ^1–9различия достоверны (р <0,05) по сравнению с группами 1–9; ГМДП — глюкозаминилмурамил­дипептид.

 

При введении препарата сравнения ГМДП степень интоксикации несколько снижалась, однако на уровень моноцитов препарат не оказывал существенного влияния. При использовании второго препарата сравнения, CаGl, данный показатель практически нормализовался, но остальные значительно отличались от интактных.

Введение MGl приводило к увеличению содержания моноцитов, эозинофилов, сегментоядерных нейтрофилов и уменьшению палочкоядерных нейтрофилов, что может свидетельствовать о стадии восстановления организма. При использовании всех MGl, за исключением FeGl, зарегистрирована нормализация количества лимфоцитов (статистических различий по этому показателю с группой интактных животных не обнаружено).

Лейкоцитарные индексы для интактных животных заметно изменялись после применения ЦФ, но под действием MGl происходила коррекция этих значений, степень которой достоверно (p <0,05) превышала степень коррекции под действием препаратов сравнения ГМДП и CаGl (табл. 2).

 

Таблица 2. Влияние глюконатов 3d-металлов на лейкоцитарные индексы при эндогенной интоксикации мышей ­циклофосфамидом (ЦФ) (Ме [Q₁–Q₃])

№	Группа, n=12	Индекс стрессорной активности	Лейкоцитарный индекс интоксикации	Ядерный индекс степени эндо-токсикоза	Индекс сдвига лейкоцитов
1	Контроль, интактные	3,11 [2, 97–3, 41]	0,32 [0, 29–0, 34]	0,09 [0, 08–0, 11]	0,32 [0, 30–0, 36]
2	Контроль, ЦФ без лечения	5,82 [5, 53–6, 19]1	0,19 [0, 17–0, 21]1	0,175 [0, 15–0, 19]1	0,21 [0, 19–0, 22]1
3	ЦФ+ГМДП	4,72 [4, 3–5, 1]1,2,4,5,7–9	0,21 [0, 19–0, 24]1,2,5,9	0,15 [0, 14–0, 17]1,2,8	0,22 [0, 20–0, 24]1,5,8,9
4	ЦФ+СаGl	4,81 [4, 4–5, 2]1,2,5,7–9	0,21 [0, 19–0, 22]1,2,5,7–9	0,17 [0, 15–0, 20]1,5,9	0,21 [0, 19–0, 24]1,5,8,9
5	ЦФ+MnGl	3,29 [2, 96–3, 64]2,6–9	0,31 [0, 28–0, 32]2,6–9	0,13 [0, 12–0, 15]1,2,6–8	0,32 [0, 30–0, 36]2,6–9
6	ЦФ+FеGl	4,65 [4, 22–4, 96]1,2,9	0,22 [0, 20–0, 24]1,2,9	0,165 [0, 16–0, 18]1,9	0,23 [0, 22–0, 25]1,2,9
7	ЦФ+СоGl	4,2 [3, 95–4, 74]1,2	0,23 [0, 22–0, 25]1,2	0,165 [0, 15–0, 18]1,9	0,23 [0, 22–0, 25]1,2,9
8	ЦФ+СuGl	4,33 [3, 78–4, 53]1,2	0,23 [0, 22–0, 25]1,2	0,185 [0, 17–0, 20]1,9	0,26 [0, 24–0, 27]1,2
9	ЦФ+ZnGl	3,98 [3, 67–4, 27]1,2	0,24 [0, 22–0, 25]1,2	0,14 [0, 13–0, 16]1,2	0,27 [0, 24–0, 28]1,2

Примечание: ^1–9различия достоверны (р <0,05) по сравнению с группами 1–9; ГМДП — глюкозаминилмурамил­дипептид.

 

Распределение субстанций по эффективности коррекции лейкоцитарных индексов может быть представлено следующим образом.

Индекс стрессорной активности: CаGl <ГМДП

Лейкоцитарный индекс интоксикации: CаGl <|ГМДП 

Индекс сдвига лейкоцитов: CаGl <ГМДП

Ядерный индекс степени эндотоксикоза: CаG

Анализ представленных рядов и полученных численных значений позволяет сделать вывод о высокой степени иммунокоррекции цитотоксического действия ЦФ при использовании MnGl. Лейкоцитарные индексы при введении данного глюконата корректируются практически до значений, полученных для интактных животных. Возможно, в этом случае имеет значение то обстоятельство, что Mn-супероксиддисмутаза катализирует дисмутацию супероксидного анион-радикала, образование которого связано с деструкцией клеточных мембран. Кроме того, известна также роль ионов марганца в активации РНК-полимеразы1 и некоторых киназ, участвующих в регенеративных внутриклеточных процессах [14, 15].

Заслуживает внимания также степень эффективности глюконатов цинка и меди, что, возможно, связано с цитопротективными свойствами этих металлов, участвующих в защите дезоксирибонуклеиновой кислоты и транскрипционных факторов (p53, Erg, Sp1, NF-κB, AP1) от свободнорадикального повреждения, ингибирования протеиназ и др. [5, 13].

Выводы

1. Глюконаты 3d-металлов оказывают корригирующее влияние на степень эндогенной интоксикации, вызванной цитостатиком циклофосфамидом.
2. Глюконаты 3d-металлов снижают токсическую иммуносупрессию, увеличивают реактивность фагоцитов и скорость регенерации лейкоцитарного звена.
3. Наиболее высокая эффективность выявлена у глюконата марганца, далее следуют глюконаты цинка и меди.

 

Участие авторов. Е.А.К. и С.И.У. проводили исследования; И.Г.К. и Ю.И.М. синтезировали глюконаты 3d-металлов, участвовали в обсуждении результатов и написании статьи; Л.М.Г. обеспечивала доставку и содержание экспериментальных животных, отвечала за сбор материала; О.А.К. анализировала результаты, писала статью, руководила работой.
Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования №AAAA-A20-120012090027-6.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутс­т­вии конфликта интересов по представленной статье.
Благодарности. Выражаем благодарность ЦКП «Химия» УфИХ УФИЦ РАН за предоставленное оборудование для исследования синтезированных глюконатов 3d-металлов.

About the authors

Olga A. Knyazeva

Bashkir State University

Author for correspondence.
Email: olga_knyazeva@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-1753-4784
SPIN-code: 3828-3978
Scopus Author ID: 7006637251
ResearcherId: G-3457-2017

M.D., D.Sci. (Biol.), Prof., Depart. of Biochemistry and Biotechnology

Russian Federation, Ufa, Russia

Elena A. Kireeva

Bashkir State Medical University

Email: kireevarabota@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6289-4722

Assistant, Depart. of Faculty Therapy

Russian Federation, Ufa, Russia

Irina G. Konkina

Ufa Institute of Chemistry, Ufa Federal Research Center, Russian Academy of Sciences

Email: irkonk@anrb.ru
ORCID iD: 0000-0003-4159-5867

Cand. Sci. (Chem.), Assoc. Prof., Senior researcher, laboratory of coordination chemistry

Russian Federation, Ufa, Russia

Sabina I. Urazaeva

Bashkir State Medical University

Email: urazaeva2010@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6417-8671

M.D., Cand. Sci. (Med.), Assistant, Depart. of Psychotherapy with IDPO course

Russian Federation, Ufa, Russia

Luiza M. Gazdalieva

Bashkir State Medical University

Email: luiza_doc@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3784-5133

M.D., Cand. Sci. (Med.), Assistant, Depart. of Biological Chemistry

Russian Federation, Ufa, Russia

Yuri I. Murinov

Ufa Institute of Chemistry, Ufa Federal Research Center, Russian Academy of Sciences

Email: murinov@anrb.ru
ORCID iD: 0000-0002-8199-1912

D. Sci. (Chem.), Prof., Head, Laboratory of coordination chemistry

Russian Federation, Ufa, Russia

References

Supplementary files