Correlation of reciprocal and autoactivation pathways of contact phase initiation of blood coagulation

Full Text

При соприкосновении крови с поврежденной интимой или с чужеродными поверхностями протезов кровеносных сосудов или клапанов сердца, в аппаратах искусственного кровообращения и гемодиализа в ней происходит инициация внутреннего пути свертывания и кининогенеза. Процесс начинается с активации фактора XII (фактор Хагемана) и включает ограниченный протеолиз прекалликреина, высокомолекулярного кининогена и фактора XI. Установлено, что фактор ХIIа, необходимый для эффективной активации прекалликреина и фактора XI, получается путем реципрокной активации: где XII и ХIIа — зимогеи и энзиматически активная форма фактора Хагемана, IIК и К — прекалликреин и калликреин плазмы крови. Свое образование получающиеся фактор ХIIа и калликреин стимулируют посредством положительной обратной связи (реципрокно). Однако для запуска реакций 1 и 2 необходимо инициальное количество фактора ХIIа или калликреина. Изучение взаимодействия высокоочищенных препаратов перечисленных белков контактной фазы между собой и различными контактными поверхностями позволило выдвинуть несколько гипотез для объяснения механизма возникновения первоначальной ферментативной активности. Предполагают, что ее источником является конформационное изменение молекулы фактора XII на отрицательно заряженной поверхности [5], следовая активность зимогена фактора XII [7], субстратиндуцированный катализ [8], ограниченный протеолиз молекулы фактора XII следовыми количествами активных плазменных протеаз [13], энзиматическая аутоактивация фактора XII [15]. В нативной плазме крови, представляющей собой многокомпонентную систему, фактор ХIIа, необходимый для гемокоагуляции и кининогенеза, может получаться за счет нескольких указанных выше механизмов. Например, полагают, что при дефиците фактора Флетчера- (плазменного прекалликреина) фактор ХIIа образуется преимущественно аутоактивационным путем [17], хотя другие авторы отвергают такую возможность [8].

Целью настоящей работы было, во-первых, выяснение вопроса, какая часть фактора ХIIа образуется в плазме крови по реципрокному механизму (реакции 1, 2); во-вторых, требовалось установить, какой из двух агентов — ингибитор фактора ХIIа из кукурузы или ингибитор калликреина контрикал — более эффективен для торможения активации фактора XII и прекалликреина на контактной поверхности. В опытах использовали пул бедной тромбоцитами цитратной плазмы, полученной из крови доноров. С целью уменьшения контактной активации крови при ее получении, обработке и хранении применяли фторопластовую посуду и пластиковые дозаторы.

Энзиматическую активность калликреина и фактора ХIIа определяли при 37° по разложению искусственного хромогенного субстрата, Н-Д-Про-Фен-Арг-паранитроанилида гидрохлорида, S-2302 (Каби Диагностика, Швеция):

где S — субстрат, Р — окрашенный продукт паранитроанилин, регистрируемый спектрофотометрически при 405 нм. Специфические активности калликреина и фактора ХПа по отношению к данному хромогенному субстрату составляют 149 мкмоль/(мин мг) и 14,4 мкмольДмин-мг) [17]. В кювету прибора до общего объема 500 мкл помещали 0,05 М трис-HCl буфер pH 7,8 в 0,012 M NaCl; 0,006 М раствор хромогенного субстрата (для конечных концентраций 50,0; 62,5; 83,3; 120,0 и 240,0 мкмоль соответственно 4,2; 5,2; 7,0; 10,0 и 20,0 мкл) и 50 мкл 13-кратно разведенной буфером плазмы крови. Активатором служила поверхность кварцевого стекла кюветы площадью 3,5 см². Соотношение между объемом плазмы крови и площадью чужеродной поверхности было близко к таковому в аппаратах для искусственного кровообращения и гемодиализа;

Для подавления активности фактора ХIIа применяли полученный по методу [9] ингибитор фрагмента фактора ХIIа из кукурузных зерен, а для инактивации плазменного калликреина —ингибитор контрикал (ГДР). Значения константы Михаэлиса (Км), максимальной скорости разложения хромогенного субстрата (V макс.), констант ингибирования (К инг.), а также значений были рассчитаны статистическим методом [3]. Математическое моделирование реакций контактной фазы и разложения субстрата произведено на ЭВМ.

Контакт плазмы крови с поверхностью кварцевого стекла в условиях опыта ведет к образованию калликреина и фактора ХIIа и, как следствие этого, к возрастанию крутизны графика разложения хромогенного субстрата (рис. 1 А, Б, В). Последующее замедление разложения субстрата обусловлено в первую очередь его истощением и, по-видимому, инактивацией калликреина и фактора ХIIа антитромбином III, С1-инактиватором, а2-макроглобулином и другими плазменными ингибиторами [4].

 

 

Рис. 1. Рост экстинкции при разложении возрастающих концентраций хромогенного субстрата (Л — 62,5 мкмоль; Б—120,0 мкмоль; В — 240,0 мкмоль). Точки соответствуют экспериментальным данным, непрерывные линии — расчетные, согласно уравнениям 6—9. Горизонтальными штриховыми линиями обозначены максимальные экстинкции при полном разложении субстрата. На Г, Д и Е представлены изменения относительного содержания фактора ХIIа (штриховая линия) и калликреина (штрих-пунктирная линия), полученные расчетным путем. На горизонтальных осях отложены единицы времени (мин).

 

Измерения скорости образования продукта при различных концентрациях хромогенного субстрата при последующем расчете дали для регистрируемой амидолитической активности значения Км, равные 229 мкмоль и Умакс.— 0,87 мкмоль/мин в пересчете на содержание энзимов в 1 мл неразведенной плазмы крови. Из литературы известно, что для плазменного калликреина Км равна 200 мкмоль [10], для фактора ХПа Км— 190 мкмоль [15]. Вычисленная из опыта Умакс. была также сопоставлена с потенциальными величинами Умакс., полностью активированных в плазме крови калликреина и фактора XII. Для расчета были использованы приведенные выше значения специфической активности плазменного калликреина и фактора XII и их концентрации в плазме крови, равные соответственно 50 мкг/мл и 30 мкг/мл [6].

Оказалось, что полученная из эксперимента Умакс. составляет 190% от рассчитанной для фактора ХПа Умакс. и только 12% — от Умакс. калликреина. Амидолитическая активность фактора ХIIа не может превышать 100%, и при отсутствии вносимых извне ингибиторов нельзя представлять рассчитанную из эксперимента Умакс. как результат действия только одного из двух рассматриваемых энзимов. Кроме того, известно, что калликреин, в отличие от фактора ХПа, не может получаться аутоактивационно [11, 16], а образуется посредством реакции 2. Следовательно, в изучаемой системе одновременно присутствуют фактор ХПа и калликреин и реакции 1 и 2 протекают с их участием (реципрокная активация).

Для торможения активации фактора XII и прекалликреина в опытах кукурузный ингибитор вводили в плазму до конечных концентраций 0,15; 0,60; 2,40 мг/мл, а контрикал—до концентраций 0,10; 0,40; 1,60 мг/мл или 250, 1000 и 4000 АТрЕ на 1 мл плазмы. Концентрации представлены в расчете на белок в препаратах ингибиторов. К инг. амидолитической активности составила 1,3 10^-7 моль для контрикала (мономера) и 9,6 10—⁸ моль — для кукурузного ингибитора. Полученные величины отличаются от известных из литературы констант ингибирования чистых ферментов: К инг. равна 1,7-10^-8 моль для ингибирования плазменного калликреина кантрикалом [18] и К инг.— 2,4-10^-8 ммоль для ингибирования фрагмента фактора ХПа кукурузным ингибитором [9]. Увеличенные в несколько раз по сравнению с литературными значениями величины К инг. обоих ингибиторов свидетельствуют об уменьшении сродства в комплексе фермент— ингибитор. Это объясняется, по-видимому, тем, что используемый в опыте ингибитор воздействует только на один из двух ферментов. Кроме того, снижение эффективности ингибирования, проявляющееся в росте К инг. для контрикала, может быть связано также и с тем, что прекалликреин высокомолекулярным кининогеном, преданными и вносимыми извне ингибитора.

Величина Iso для кукурузного ингибитора составила 1,46 -10^-7 моль, а По контрикала— 2,08 10^-7 моль, что указывает на несколько большую эффективность (Р<0,05) кукурузного ингибитора для торможения амидолизиса, отражающего ход контактной активации в плазме крови.

Оба ингибитора в максимальной концентрации имели молекулярное соотношение ингибитор/фермент не менее 400. Создание 100-кратного молекулярного избытка кукурузного ингибитора в плазме крови [2, 12] позволяет имитировать дефицит фактора Хагемана. Но в условиях опыта наибольшие применявшиеся концентрации кукурузного ингибитора или контрикала не могли полностью предотвратить реакции разложения хромогенного субстрата, хотя Умакс. амидолизиса снижалась по сравнению с неингибированной плазмой приблизительно в 10 раз (рис. 2). Таким образом, использование специфических ингибиторов фактора ХПа и калликреина в высоких концентрациях не позволяет полностью исключить их участие в реакциях активации и разложения хромогенного субстрата.

 

 

Рис. 2. Рост экстинкции при разложении хромогенного субстрата S-2302 (240,0 мкмоль) при различных концентрациях кукурузного ингибитора: 1 — без ингибитора; 2— 0,15 мг/мл; 3 — 0,60 мг/мл; 4 — 2,40 мг/мл.

 

При изучении процесса активации фактора XII непосредственно в плазме крови был использован метод математического моделирования протекающих реакций. Рассматривались только механизмы реципрокной и аутолитической активации фактора XII, для которых известны кинетические константы [17]. Концентрации фактора ХПа, калликреина и окрашенного продукта — паранитроанилина — рассчитывали на ЭВМ путем многократного применения вычислительного цикла. Расчеты производили согласно уравнениям:

фактора XII и калликреина в условиях опыта, полученная при разведении их плазменной концентрации 0,3 мкмоль в 130 раз. (К кат)п и (Км)п каталитическая константа и константа Михаэлиса реакций 1—5. Р и Р макс.— текущая и максимальная концентрация паранитроанилина при полном разложении хромогенного субстрата. Эти концентрации связаны с регистрируемой экстинкцией соотношением скорости связывания субстрата с энзимом. Входящие в выражение F величины Км, ß, а также плазменная концентрация 0,3 мкмоль приняты равными для фактора XII и калликреина.

В условиях опыта концентрации хромогенного субстрата и образующегося продукта (50,0; 240,0 мкмоль) многократно превышают концентрации фактора XII, прекалликреина и их активных форм (~ 0,0023 мкмоль). Поэтому реакции 4 и. 5, в отличие от 1, 2, 3, были записаны с указанием стационарной концентрации промежуточного продукта. Из рис. 1 (А, Б, В) видно, что при возрастании концентраций хромогенного субстрата к 60 мин с образованием паранитроанилина разлагается все меньшая его доля. Данный факт оказалось возможным объяснить эффектом ингибирования по бесконкурентному механизму [3]. Паранитроанилин так же, как и субстрат, может существенно снижать концентрацию фактора ХIIа и калликреина образованием комплекса, для подтверждения этого реакции 4 и 5 были записаны с указанием обратимости стадии образования продукта. Эффект подобного ингибирования связан с концентрацией продукта параметром ß.

Специфическая трудность, возникающая, при попытке выражения процессов контактной активации и разложения хромогенного субстрата уравнениями 6—9 обусловлена тем, что значения входящих в уравнения параметров не могут быть непосредственно получены из литературы ввиду их существенного разброса (табл.), а также вследствие вероятных колебаний концентраций ферментов в отдельных опытах. Поэтому кинетические параметры определялись с помощью метода Позенброка [1], исходя из минимума допустимой максимальной погрешности для серии опытов с тем, однако, условием, чтобы получаемые значения параметров не противоречили литературным данным.

Минимальная максимальная погрешность, а Е макс.— наибольшая экстинкция при концентрации субстрата 62,5 мкмоль. Полученная по формуле величина составляла в среднем 7% и была сопоставимой со вкладом аутоактивационной реакции (1 — 24%) в продукцию фактора ХПа калликреином, зафиксированного в системе очищенных факторов (ХП+К) [17]. Для каждой группы опытов, проделанных с одной и той же плазмой крови, были рассчитаны серии параметров. Усредненные параметры для опытов с концентрациями хромогенного субстрата 62,5; 120,0; 240,0 мкмоль по сравнению с литературными значениями представлены в таблице. С учетом разброса концентраций ферментов в разных группах опытов все параметры согласуются с соответствующими литературными значениями. Расчетный параметр, характеризующий реакцию аутоактивации фактора ХII равен нулю. Это означает, что в условиях опыта процесс контактной активации в плазме крови может быть описан без учета вклада реакции 3. Наглядным подтверждением данного положения на рис. 1 0, является удовлетворительное совпадение экспериментальных и теоретических кривых роста экстинкции. Более или менее значительный вклад аутоактивационной реакции или каких-либо других механизмов, не учтенных представленной моделью (уравнения 6—9), не позволил бы с помощью известных констант описать данные эксперимента и проявился бы систематическим несовпадением экспериментальных и теоретических графиков. В данном случае систематическое отклонение не превосходило погрешности эксперимента. Оценку относительного вклада в образование фактора ХПа и калликреина (по их действию на хромогенный субстрат) аутоактивационного и других вероятных механизмов, отличных от реципрокной активации (реакции 1 и 2), производили по формуле:

На рис. 1 (Т, Д, Е) представлены рассчитанные графики изменения относительного содержания фактора ХIIа и калликреина в течение опыта при концентрациях хромогенного субстрата 62,5; 120,0 и 240,0 мкмоль. Из таблицы и рисунков видно, что с ростом применяемой концентрации субстрата падает относительное содержание активных факторов в начальный момент времени и снижаются уровни максимумов кривых. Поскольку происхождение максимумов связано с уравниванием скоростей образования активных ферментов и их ингибированием окрашенным продуктом реакций 4 и 5, зависимость относительных содержаний фактора ХIIа и калликреина от концентрации субстрата достаточно очевидна. Аналогично объясняется и зависимость исходных уровней активных ферментов от концентрации субстрата, хотя сам вопрос о происхождения инициальной, ферментативной активности остается открытым.

ВЫВОДЫ

1. Образование активных ферментов контактной фазы свертывания крови, фактора ХIIа и калликреина, при соприкосновении плазмы крови человека с чужеродной поверхностью (кварц) осуществляется преимущественно (93%) механизмом реципрокной активации, запускаемым следовыми количествами фактора ХIIа и (или) плазменного калликреина. Таким образом, основной механизм активации ключевых факторов внутреннего пути гемостаза и кининогенеза идентичен как для очищенных факторов, так и для плазмы крови.
2. Ингибитор фактора ХIIа из кукурузных зерен и ингибитор калликреина контрикал даже в очень высоких концентрациях не обеспечивают полного подавления контактной фазы свертывания в плазме крови человека.

About the authors

D. M. Zubairov

S.V. Kurashov Medical Institute

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

I. M. Baishev

S.V. Kurashov Medical Institute

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

V. N. Mikhailov

S.V. Kurashov Medical Institute

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files