Type of local diphtheria strains

Abstract

In 1931, a group of English authors (Anderson, Happold, McLeod, and Thomson) attracted attention by reporting that the corynebacterium diphtheria can be subdivided into two main and one intermediate groups according to the type of colonies on the chocolate-telluric medium recommended by them and according to a number of other biochemical signs.

Full Text

В 1931 г. группа английских авторов (Андерсон, Гаппольд, МакЛеод и Томсон) привлекли внимание сообщением о том, что коринебактерии дифтерии могут быть подразделены на две основных и одну промежуточную группу по виду колоний на рекомендуемой ими шоколадно-теллуровой среде и по ряду других биохимических признаков. Авторы указывают, что эти группы дифтерийных бацилл, кроме различия по своим культуральным особенностям, обусловливают также различную степень выраженности клинической картины дифтерии. Они подчеркивают то обстоятельство, что эти типы постоянны и что типовая стабильность поддерживается как в культуре, так и в организме животного.

При изучении местных дифтерийных штаммов мы ставили задачу: 1) проверить возможность их классификации по схеме Андерсона и соавторов; 2) проследить соотношение различных типов возбудителя по Казани и, 3) выяснить наличие зависимости клинического течения болезни и бациллоносительства от указанных типов возбудителя.

Материалом, послужившим для разработки этих вопросов, были штаммы, свеже выделенные нами в процессе работы с февраля 1937 г. по июль 1938 г. Среди этих материалов были штаммы, полученные от больных (преимущественно в начале заболевания), штаммы реконвалесцентов — бациллоносителей и бациллоносителей контактных (всего 81 штамм).

Кроме того, для сравнения взяты 3 эталонных дифтерийных штамма, полученные нами из Центр, гос. науч, контрольного ин-та имени Тарасевича: № 1715 (gravis), № 1720 (mitis) и № 1721 (intermedius). Для сравнения были взяты также 2 штамма дифтерийных бацилл: № 137 (mitis) и № 158 (gravis), полученные из Харьковского ин-та им. Мечникова.

Методика изучения культур

Первичный посев с тампона производился на скошенную Леффлеровскую сыворотку, и в случае обнаружения в мазках из этого посева дифтерийных палочек культура’ рассевалась на чашки Петри со свернутой лошадиной сывороткой. Колонии из этих чашек (суточный и двухсуточный рост) тщательно просматривались при помощи лупы. Чистая культура выделялась опять на скошенную Леффлеровскую сыворотку, и отсюда (24-часовой рост) производились мазки для изучения морфологии дифтерийной палочки Препараты красились по Леффлеру и Нейссеру.

Для выяснения характера роста на жидких средах мы применяли Мартеновский бульон (pH 7,6), причем засев выдерживался 7 суток в термостате при 37° и 3 суток при комнатной температуре. Мясо пептонный бульон различной щелочности с индикатором Андрэда (pH — 6,8 и pH. 7,6) был взят для наблюдения за изменением реакции бульона под влиянием роста различных дифтерийных штаммов. Засевы на этом бульоне выдерживались 2 суток в термостате и затем 10 суток при комнатной температуре, при этом велась ежедневная регистрация изменения среды.

Гемолитические свойствапроверялись параллельно двумя способами: 1) на среде из 5 см³ мясо-пептонного бульона, куда добавлялось 5 капель дефибринированной крови человека и 2) на чашках с агаром, 5^и/о дефибринированной лошадиной крови. Засевы на кровяных средах выдерживались 2 суток в термостате и 1 сутки при комнатной температуре.

Ферментация углеводов проверялась на водно-сывороточной среде (2О’/« сыворотка) с добавлением индикатора Андрэда и 1% углевода. Проверялась ферментативная способность штаммов по отношению к глюко е, сахаро е, крахмалу и гликогену. При ферментации углевода появлялось отчетливое изменение цвета среды и коагуляция. Засевы на углеводных средах выдерживались в термостате 2 суток и затем при комнатной температуре 10 суток, с ежедневной регистрацией результатов. Шоколаднотеллуровый агар готовился по прописи Андерсона, Гаппольда, Мак-Леода и Томсона. Засеянные чашки с шоколадно-теллуровой средой инкубировались в термостате 48 часов, после чего зачитывались результаты роста.

Засевы на все указанные среды производились с суточной культуры дифтерийной палочки на с .еде Леффлера.

Вирулентность культур проверялась по способу Игльтона и Бакстер, т. е. контрольной свинке накануне опыта вводилось 500 АЕ противодифтерийной сыворотки, а на следующий день двум свинкам — опытной и контрольной — вводилось 0,2 см³ взвеси в физиологическом p ictворе NaCl b. diphtheriae на сре, е Леффлера. Стандарт эмульсии мы брали в 100 миллионов микробных тел в 1 см.

Проверка эталонных штаммов

Для того, чтобы иметь ориентировочный контроль, мы вначале провели испытание имевшихся у нас эталонных штаммов. При этом оказалось, что они полностью в схему Андерсона и соавторов не укладываются. Но все же, по совокупности ряда признаков нужно считать, что штамм № 1715 действительно относится к thiiv gravis, № 1721 — • к типу intermedius, № 158 —к типу gravis и № 137—,к rnitis. Штамм № 1720, по нашим данным, оказался принадлежащим к типу gravis, а не mitis, как указано в паспорте этого штамма.

Из этого ряда исследований мы вынесли также впечатление, что более постоянные признаки для классификации на типы — это вид колоний на шоколадно-теллуровой среде, ферментация углеводов, а подсобный признак — это характер роста на бульоне. Эти пробы получались более отчетливо и стойко, тогда как другие — как способность к гемолизу и изменение реакции среды — при наших методах исследования оказались неясными, непостоянными. Это впечатление подтвердилось и нашими дальнейшими опытами.

Местные дифтерийные штаммы

1. Дифференциация по виду колоний. На шоколадно-теллуровой среде хорошо росли большинство штаммов, но интенсивность роста была различна. У некоторых штаммов колонии достаточной величины, с выраженными особенностями типа развивались уже через 1 о 24 часа, у других—в первые сутки наблюдался очень скудный рост, и только через 40 48 часов можно было установить тип.

Из выделенных 81 штамма 6 росли с большим трудом; при первом засеве на чашки с теллуровой средой роста совершенно не было, при повторном засеве выросло всего по . о колонии Эти трудно растущие штаммы были: 3 типа gravis, 2 — mitis и 1 intermedins. Один штамм на теллуровой среде совершенно не удалось вырастить, несмотря на о-кратныи засев. По своим биохимическим свойствам этот штамм ближе всего подходил к типу intermedius. В результате на наш эм материале распределение штаммов по виду колонии на означенные три типа происходит следующим образом: а) среди больных —тип gravis в 49,1%, тип mitis45,6%, a intermedius 5,3%; b) среди бациллоносителей контактных тип gravis 47,6% , тип mitis — 47,6°/о и тип intermedius 4,8%

Типаж местных штаммов 

Табл. 1.

Тип	а) Штаммы от больных	Ь) Штаммы от контакт, бациллоносит.	с) Штаммы от реконвалесц. ба циллоносит.
Gravis............................ Mitis.............................. Intermedius .....	28 (49,1%) 26 (45,6%) 3 ( 5,3%)	10 (47,б%) . 10 (47,6%) 1 ( 4,8%)	2 (100%)
Итого . .	57 (100%) ,	21 (100%)	2 (100%)

Не всегда легко установить формы роста на шоколадно-теллуровой среде. Правда некоторые культуры деференцируются просто. Особенно это относится к большенству штампов типа gravis, у которых плоские , больние колонии, с фестончатым краем в отчетливых случаях распознаются без всякого труда. Гораздо треднее определить тип intermedius и mitis. В э.ом отношении мы присоеденяемся к мнению Сетзерланд и Айрдэл, которые считают, что тип gravis лешко распознается но нельзя с увереностью диференцировать колонии mitis и intermedius на среде Андерсона и соавторов.

2. Диференциация по биохимическим особеностям. а) Рост на бульоне. Из 40 штампов типа gravis только один не дал пленку, но давали небольшое помутнение бульона. Остальное 36 штампов типа gravis воспроизводили типичный рост т.е. хрупкую пленку, зернистый осадок на дне и совершенн опрозрачный бульон. Штаммы типа mitis в этом отношении были более вариабильными, а именно: 12 штампов давали рост в виде крошащейся пленки и прозрачный бульон; остальные 24-равномерную муть в бульоне, что и является характерным для э;-ого типа, 2 культуры intermedius образовали на бульоне пленку, при совершенно прозрачной среде, а 2пленку и слетка мутноватый бульон.

Ь) Ферментация углеводов. Что касается ферментации углеводов, а особенно крахмала и гликогена, то здесь получились наиболее отчетливые результаты. Крахмальные и гликогеновые среды показали полный параллелизм в ферментации. При сбраживании уже через 18 — 24 ч;са получалось покраснение и свертывание той и другой углеводных сред. Б лее поздние реакции через 48 часов были сравнительно редкими. Культуры типа gravis во всех случаях дали отчетливое сбраживание крахмальных и гликогеновых сред с образованием кислоты. Тип intermedius дал незначительную ферментацию крахмаленых и гликогеновых сред во в ех 4 случаях. Культуры типа mitis ни в одном случае не дали характерного изменения этих углеводов. Только в некоторых случаях на 4 — 5-й день отмечалось небольшое порозовечие среды, но и то без свертывания. Глюкоза разлагалась с образованием кислоты всеми дифтерийными штаммами. Сахароза оставалась не измененной.

с) Проверка гемолитической способности не дала ничего определенного. Следует лишь отметить, что более устойчивыми но отношению к дифтерийным штаммам оказались эритроциты лошади, так как процент гемолизирующих штаммов на кровяных чашках получился ниже, чем таковой на бульоне с кровью человека.

3. Диференциация по морфологии дифтерийной палочки. Морфологически дифтерийная палочка со среды Леффлера представлялась в большинстве случаев как длинная, тонкая, несколько изогнутая бацилла, с биполярной зернистостью. Однако, около 20 — 25% всех трех типов давали некоторые отклонения от классической морфологии дифтерийной палочки, они были или несколпко укороченными, грубоватыми или со слабо выраженной зернистостью. Различия в морфологии между тремя типами установить не удалось.

4. Различие типов по вирулентности для морской свинки. Вирулентность штаммов, проверенная по способу Игльтона и Бакстера, представлена в таблице 2. Сильно вирулентными штаммами мы считали те, которые давали обширный глубокий некроз на 2 — 3 сутки, в дальнейшем переходящий в некротическую язву. К штаммам с вирулентностью средней степени мы относили те из них, которые вызывали на 3 — 4-е сутки ясно выраженный инф льтрат и некроз. Слабо вирулентными считались штаммы, образующие на 3—4-е сутки незначительный поверхностный некроз. Авирулентными— не дающие никакой реакции.

Вирулентность штаммов для морской свинки

Табл. 2.

Т и п	Сильно вирулентные	Средне вирулентные	Слабо вирулентные	Авирулентные
Gravis . . . Mitis . . Intermedius .	13 (32,5%) 6 (16,2%) I (25,0%)	20 (50,0%) 19 (51,3%) 3 (75,0%)	6 (15,0%) 7 (19,0°/0)	1 (2,5%) 5 (13ф%)

Из таблицы 2 видно, что наиболее вирулентными для морской свинки, по нашим данным, оказались штаммы типа gravis, которые дали 32,5% сильных некротических реакций и лишь 1 штамм этого типа (2,5%) не дал никакой реакции. Среди штаммов типа mitis оказалось в 5 раз больше авирулентных штаммов (13,5%), чем среди gravis, а сильно вирулентных, наоборот, меньше'(16,2%). Судить о степени вирулентности типа intermedius также, как и о других его качествах, нам трудно ввиду того, что в нашем распоряжении имелось всего 4 штамма этого типа. Однако, все 4 культуры intermedius были сильно и средне-вирулентными.

Типы, и клиническое течение.

Для заключения о связи клинической картины дифтерии с типом возбудителя имеющийся у нас материал недостаточен: в нашем распоряжении имелось всего 28 историй болезни, полученных из 1 инфекционной больницы¹)Однако, из этого материала мы сочли возможным сделать некоторые обобщения, представленные в таблице 3. К тяжелым формам мы отнесли те, которые давали обширные пленки, большую отечность, часто альбуминурию, осложнения и признаки токсинемии. К средне-тяжелым — случаи с значительными пленками, покрывающими тонзиллы и небные дужки, легкие периадениты, как исключение — альбуминурию и осложнения. Легкие формы — локализованные местные явления, отсутствие альбуминурии и осложнений.       и                   ,

Тины дифт. бацилл и клинмч. течение инфекции

Табл. 3.

	Тяжелые случаи	Средне тяжелые	Легкое течение	Дифтерия носа.
Gravis . . .	3	6	2	5
Mitis . . .	-—.	6	■—	4
intermedius .	1		—	1

По нашим данным, тип gravis дал наибольшее число тяжелых случаев (3), и intermedins 1 случай. Число заболеваний со средней тяжестью одинаково для gravis и mitis. Тип gravis дает, однако, и легкие формы (2 случая), дифтерия носа также в 5 случаях была вызвана типом gravis. Смертельных случаев было 2, причем один из них был вызван возбудителем типа gravis, и заболевание действительно относилось к тяжелой токсической форме; другой, вызванный типом mitis, по течению болезни скорее относился к средне-тяжелым, но так как 5-месячный ребенок был отягощен рахитом, страдал абсцессом легких, то случай окончился летально.

Таким образом, мы, на основании наших ограниченных данных по клинике дифтерии, можем отметить, что строгой зависимости течения болезни от типа возбудителя нам установить не удалось, хотя следует указать, что в наиболее тяжелых случаях заболевание обусловлено было возбудителем типа gravis.

Стабильность типов дифтерийных культур. Выделенные нами дифтерийные штаммы долгое время поддерживались на среде Леффлера, пересевались на свежую среду 2 раза в месяц. Спустя 1—2 года мы эти штаммы вновь засеяли на шоколадно-теллуровую среду, чтооы снова на основании формы колонии провести типирование этих культур. Оказалось, что у всех штаммов сохранился первоначальный характер роста на этой среде и изменения типа колоний мы ни разу не отметили.

Выводы

1. Выделенные в течение 1937 — 38 г. дифтерийные штаммы (81 штамм) полностью диференцировать по схеме английских авторов не удалось.

2. Наиболее постоянными признаками типирования являются — форма колонии на шоколадно-теллуровой среде и ферментация крахмала и гликогена. Менее характерным является рост на бульоне и еще менее характерным признак лизирования эритроцитов.

3. В результате диференциации штаммов по виду колоний на теллуровой среде и сбраживания углеводов оказалось, что у наших больных тип gravis был представлен в 49,1%» mitis в 45,6% и interniedius в 5,3%; среди бациллоносителей контактных gravis в 47,6%, mitis — в 47,6% и intermedins — в 4,8%.

4. Наиболее вирулентными для морской свинки оказались культуры типа gravis, вызвавшие наибольшее число сильных реакций.

5. Строгой зависимости между типом возбудителя и течением болезни установить не удалось.

6. Выделенные штаммы, будучи снова типированы на шоколаднотеллуровой среде, через 1—2 года показали постоянство типа.

1) Приносим благодарность директору 1 инф. б-цы проф. А. Ф. Агафонову за любезно предоставленные нам для разработки истории болезни.