On the issue of antibodies in experimental syphilis in rabbits

Abstract

Recent clinical and experimental data show that a number of complex immunobiological processes are developing in both rabbits in experimental syphilis and people with syphilis. However, the nature of these phenomena is still unclear.

Full Text

Клинические и экспериментальные данные последнего времени говорят о том, что в организме как кроликов при экспериментальном сифилисе, так и людей, больных сифилисом, развивается ряд сложных иммунобиологических процессов. Однако, сущность этих явлений продолжает оставаться все еще неясной. Известны попытки ряда исследователей, направленные к обнаружению ряда противотел в сыворотках как больных, так и при иммунизации бледными спирохэтами. Одни авторы пытались их обнаружить в сыворотке животных (обезьян, кроликов), либо зараженных, либо иммунизированных культуральными или тканевыми спирохэтами; другие же—в сыворотке людей, больных сифилисом. Однако полученные данные разных авторов довольно разноречивы и подчас резко отличаются между собой.

Так, по данным некоторых авторов в сыворотке зараженных сифилисом кроликов совсем не удается обнаружить агглютинины (Uh1еnhuth и Мulzer,, Финкельштейн), другие же их находили непостоянно (Schereschewsky, Blum и др). Blum, напр., указывает, что агглютинины в кроличьих сыворотках появляются очень медленно и слабо выражены.

Более определенные результаты в отношении агглютининов получены при иммунизации кроликов культурами бледной спирохэты. Nakano при интравенозной инъекции культуральных спирохэт наблюдал агглютинирующее действие в отношении гомологичного штамма с сывороткой, разведенной в 50 раз, в то время как нормальная кроличья сыворотка не агглютинировала в разведении 1 : 10. Другие же исследователи получали значительно высокий агглютинационный титр: Kolmеr до 1:320 при интратестикулярных инъекциях и до 1:1280 при интравенозной иммунизации, Zinsser и Hopkins 1: 4000, Kissmeyer 1: 20000, Noguchi и Akatsu 1: 40000. Bessemans, иммунизируя кроликов культуральными бледными спирохэтами штамма Noguchi в большинстве случаев получал агглютинационный титр сыворотки в отношении культуральных спирохэт 1 : 1600—- 1 :3200.

Кроме того в исследованиях ряда авторов выявлены важные особенности. Так,, например: Zinsser, Hopkins и Mс Burney при обработке кроликов культуральными спирохэтами регулярно получали титр сыворотки, до 1 :4000, при обработке же тканевыми спирохэтами получались сыворотки, незначительно отличавшиеся от нормальных. P. Р. Гельтцер, путем иммунизации кроликов спирохэтами 2-го штамма (Казань) получил агглютинацию в разведении 1 :800_, причем .одна из двух исследованных сывороток агглютинировала гетерологичные штаммы (1 шт. Казань и штамм Reiter’a) в несколько меньшем разведении.

Далее при иммунизации кроликов агглютинацию наблюдали Соhn в разведении 1:1600 ja F. Klopstock, причем последний получал более высокий агглютинационный титр по отношению к гомологичным штаммам культуральных спирохэт.

Наоборот, Nethaas и Pockels’y при интравенозной инъекции убитой культуры спирохэт шт. Reiter’a не удалось обнаружить каких-либо иммунных тел. Также отрицательные результаты получили Uhlenhuth и Grossmann.

Также нет единого мнения и в вопросе о спирохэтолитических свойствах сывороток у кроликов—сифилитиков. Nakano не мог обнаружить литическое действие сывороток иммунизированных кроликов с прибавлением комплемента при постановке опыта in vitro в течение 7 часов. Bess emans же наблюдал явления лизиса спирохэт при разведении сыворотки до 1 :20 и только при добавлении комплемента. По Zinsser’y и Hopkin s’y иммунные сыворотки кроликов оказывали спирохэтоцидное действие на культуральные спирохэты, причем этим действием обладала также и нормальная сыворотка, но в меньшей степени. P. Р. Гельтцер получал растворение культуральных спирохэт (2 шт.), при разведении иммунных сывороток до 1 :16, но иногда такие же результаты давала и сыворотка нормальных кроликов. Спирохэтолитическое действие кроличьих иммунных сывороток также наблюдали Е. Hoffmann, Noguchi и Akuts и, Kroо́ и Schulze, Cohn. Последний при иммунизации кроликов (и людей) убитыми культурами спирохэт штаммов Kroо́ и Reiter’a установил, что сыворотки, полученные при обработке штаммов Kroö оказывали свое спирохэтолитическое действие на гомологичные штаммы в разведении 1 :80— 1 : 160, но не оказывали действия на штамм Reiter’a; точно также сыворотки, полученные при обработке штаммом ReiteEa, оказывали спирохэтолитическое действие на гомологичный штамм в разведении от 1 : 20 до 1 : 80; но не действовали на штамм Kroо́. Сравнительные исследования Kroо́ и Schulze на питательной среде также установили типовой специфический характер спирохэтолитического действия иммунных кроличьих сывороток.

Данные указанных, а также других исследователей ясно говорят о том, что появление агглютинирующих и литических свойств в сыворотке кроликов стоит в известной зависимости от штамма бледных спирохэт, применяемых для заражения или иммунизации и Постановки самой реакции. Помимо этого, на результаты реакции, повидимому, могут оказывать влияние также способы иммунизации кро ликов, не говоря уже о различной технике постановки самих реакций. Например, в опытах Kolmer’а при иммунизации кроликов живыми апатогенными культурами Noguchi титр агглютинации при интратестикулярном введении спирохэт доходил до 1 : 320, при интравенозном же введении до 1:1280. Не останавливаясь подробно на этом вопросе мы хотели бы особенно подчеркнуть значение этих факторов, влияющих на результаты опытов, учет которых в известной степени объяснил бы те противоречия, которые существуют в вопросе об образовании „иммунных“ свойств сывороток крови при сифилисе.

Предметом настоящего сообщения являются результаты наших исследований агглютинирующих и литических свойств сывороток кроликов, зараженных сифилисом. Пользуясь этими сыворотками, помимо реакции агглютинации и лизиса мы изучали еще феномен нагрузки в отношении бледных спирохэт. Мы пользовались сыворотками кроликов, часть которых заражалась тканевыми спирохетами штамма Truffi, часть—тканевыми спирохэтами, полученными от больных вторичным свежим люэсом. В первом случае материалом для заражения служила взвесь спирохэт. полученная от склероза Truffi—кроликов, во втором же случае Reizserum с мокнущих папул. Материал, биопсированный от склероза, разрезался на мелкие части и помещался в пробирку с физиологическим раствором поваренной соли, после чего встряхивался. Получаемая взвесь, содержащая большое количество спирохэт, вводилась кроликам интратестикулярно. Сыворотки кроликов предварительно до заражения исследовались на присутствие естественных антител (агглютивины, лизины, тромбоцитобарины). Опыты производились с сыворотками не нагретыми, инактивированными и инактивированными с прибавлениями комплемента в разведениях 1:2, 1: 10, 1:20 и т. д. до 1:200 включительно. В качестве антигена были взяты чистые культуры спирохэт I и II штаммов (Казань), выращиваемых проф. Гельтцером на видоизмененной среде Fertner’a, состоящей из бульона по Готтингеру (Ph 7,6) с прибавлением кусочков бычьей печени.

Техника реакции. Реакция агглютинации ставилась в общем объеме жидкости в 5 капель в узких маленьких пробирках. В каждую пробирку прибавлялась 1 капля физиологического раствора и 2 капли сыворотки соответствующего разведения и смешивались с 2 каплями жидкой культуры спирохэт. Для обнаружения лизинов вводился еще опыт с инактивированной сывороткой с добавлением вместо физиологического раствора 1 капли свежей сыворотки морской свинки в разведении 1:20. Контролем служили —смесь 2 капель культуры спирохэт и 3 капель физиологического раствора; 2) смесь 2 кап. культуры, 2 капель физиологического раствора и 1 кап. разведенной 1:20 сыворотки морской свинки (комплемент). Пробирки ставились в термостат при 35—37° на 2 часа, после чего производилось исследование в Dunkelfeld.

Сначала были исследованы сыворотки здоровых кроликов с двумя штаммами. Всего исследовано 23 сыворотки с 1 шт. и 30 сыв. со 2 шт., из них параллельно с обоими штаммами—20 сыв.. только с 1 шт.— 3 сыв., со 2 шт.—10 сыв. Эти исследования показали, что нормальные сыворотки проявляют как агглютинирующее, так и литическое действие по отношению к культуральным спирохэтам обоих штаммов. Отрицательные реакции агглютинации с цельной кровью нами отмечались в 3 случаях в опыте с I шт. и в 2 случ. со II шт. Большинство же нормальных сывороток агглютинировало в разведении 1: 2 (13 сыв. с I шт. и 16 сыв. со II шт.), несколько меньшая, но все же значительная часть сывороток агглютинировала в разведении 1: 10 (6 сыв. с I шт. и II сыв. со II шт.) и лишь единичные сыворотки в разведении 1: 20 (по 1 сыв. с I и II шт.). Явления лизиса наблюдались в незначительной части исследованных сывороток и причем в меньших разведениях, чем агглютинация. Литическое действие сывороток отмечалось при исследовании с I шт. в разведении 1:2 в 5 случ., 1:10 в 2 случ.; со II шт. в разведении 1:2 в 6 и 1:10 в 3 случаях. Эти реакции выражались примерно в одинаковой степени со всеми сыворотками, за исключением инактивированных, которые в сравнении с остальными, агглютинировали чаще в меньших разведениях (1:2).

Можно отметить несколько различное агглютинирующее действие сывороток в отношении отдельных штаммов спирохэт, именно агглютинации в более высоких разведениях—1:10, наблюдалась чаще со II шт., по сравнению с I шт.

После предварительных наблюдений нами были исследованы сыворотки кроликов, инфицированных штаммом Truffi. Всего было заражено 12 кроликов, однако, за время наших наблюдений часть из них погибла от разных причин, что несколько сократило число наших исследований. У всех опытных кроликов наблюдались те или иные сифилитические изменения, в которых при исследовании в Dunkelfeld находили бледные спирохэты.

Сыворотки исследовались со II шт., через определенные промежутки времени после заражения—от 15 до 30 дней, от 1 до 2, от 2 до 3, от 3 до 4 и с 4 до 6 мес.

Результаты исследований сывороток на р. агглютинации нами представлены в табл. № 1, которая показывает следующее:

В течение 6 месяцев наблюдения после инфекции кроликов меньшая часть сывороток агглютинировала в тех же разведениях, что и сыворотки нормальных кроликов. Большая же часть сывороток проявляла агглютинирующее действие в больших разведениях, чем нормальные сыворотки, однако, агглютинационный титр достигает незначительного предела—до 1:40 и в отдельных случаях до 1:60. Степень агглютинации являлась

различной в зависимости от разведений сыворотки—от слабо положительной, когда в поле зрения находились склеившиеся спирохэты и наряду с ними отдельные подвижные экземпляры, до резко положительной реакции, когда все спирохеты лежали склеенными в кучки. Имея в виду, что агглютинация спирохэт в разведениях 1:20 нормальных сывороток имела место лишь в единичных случаях, мы полагаем, что явления агглютинации в сифилитических сыворотках с этого разведения имеют специфический характер. Как видно из таблицы, специфическая реакция агглюцинации в болыпей степени выражена в первые 2-3 мес. после заражения кроликов, затем отмечается тенденция к уменьшению агглютинационного титра, однако, число сывороток с явлениями специфической агглютинации остается без заметных колебаний. Зависимость явлений агглютинаций от йода применявшихся сывороток в наших опытах почти незаметна, за исключением инактивированных сывороток, большая часть которых в первый месяц после инфекции кроликов агглютинировала в слабых разведениях, как и нормальные сыворотки.

Для сравнения агглютинирующего действия опытных сывороток на отдельные штаммы бледных спирохэт, нами были поставлены дополнительные опыты на 4 кроликах, инфицированных тем же штаммом Truffi (см. табл. № 2).

Полученные при этом результаты в основном те же, что и в группе сывороток, представленных в табл. № 1—незначительное повышение агглютинационного титра, отсутствие заметной связи агглютинирующего действия в зависимости от вида сывороток. Однако, здесь довольно заметно различное агглютинирующее действие сывороток на отдельные штаммы спирохэт. Агглютинация спирохэт II шт. при исследовании как активных, так и других сывороток, чаще наблюдается в предельных разведениях (1:40).

Помимо исследования сывороток кроликов, зараженных шт. Truffi, нами были исследованы сыворотки 4 кроликов, зараженных бледными спирохэтами из мокнущих папул от больных свежим вторичным люэсом. В течение 2—3 месяцев нашего наблюдения клинические явления отмечались у одного кролика, в виде значительного уплотнения яичка; при исследовании пунктата найдены бледные спирохэты. При исследовании сыворотки со II шт. получена агглютинация в разведении 1:40 черен месяц и через 2—3 мес. У остальных кроликов каких-либо специфических клинических явлений на коже за время наших наблюдений не отмечалось. Реакция агглютинации, являвшаяся отрицательной в разведении 1:10 до заражения, оставалась без заметных изменений и после заражения.

Литическое действие отмечалось почти во всех опытных сыворотках. В зависимости от концентрации сывороток лизис проявлялся в различной степени —начиная от прекращения подвижности и различных форм дегенерации спирохэт до их полного зернистого распада. Явления лизиса наблюдались обычно в разведении сывороток (10—20, в отдельных случаях в разв. 1:40). Литическое действие сывороток являлось несколько различным по отношению к спирохэтам разных штаммов. Обычно отмечалось, что в условиях одних и тех же разведений сыворотки оказывали более сильное литическое действие на спирохэты I штамма. Последние подвергались лизису в более резкой степени, чем спирохэты II шт. Явления лизиса наблюдались во всех группах сывороток. Однако, не во всех в одинаковой степени. Это относится, главным образом, к группе инактивированных сывороток, которые в сравнении с другими сывороткам и„ оказывали наиболее слабое литическое действие.

Сравнивая эти реакции мы можем отметить следующее:

Явления агглютинации и лизиса выступали не в одинаковой степени по отношению к спирохэтам отдельных штаммов. Явления агглютинации при равных разведениях сывороток в более резкой степени наблюдались в отношении спирохэт II шт.; напротив, явления лизиса чаще и в более сильной степени отмечались в отношении спирохэт I шт. Последнее совпадает с отдельными наблюдениями P. Р. Гельтцера. Он считает возможным объяснить это явление либо индивидуальной особенностью спирохэг I шг., в силу которой они легче растворяются и погибают под влиянием спирохэтолизинов, что в свою очередь может находиться в зависимости от более продолжительного срока их сапрофитной жизни на искусственных питательных средах, чем шт. II; либо несовершенством техники постановки опытов в смысле неодинакового количества засеянных спирохэт того или другого штамма, в связи с чем спирохэтолитическое действие сыворотки могло резче сказаться в опытах, для которых был введен материал из культур с менее повышенным ростом спирохэт. Необходимо отметить, что при прочих равных условиях культуры спирохэт I шт. дают обычно не столь богатый рост, чем культуры II шт.

Как агглютинация, так и лизис в более слабо выраженной степени встречаются при исследовании инактивированных сывороток. Наконец, титр этих реакций во всех группах сывороток является неодинаковым. При исследовании одних и тех же сывороток в различных разведениях обычно наблюдалось, что агглютинация яснее выражена при более высоких разведениях сывороток, лизис же-—при более высоких концентрациях; с промежуточными же разведениями сывороток наблюдаются обычно одновременно как явления агглютинации, так и лизис спирохэт.

Реакция Rieckenber g—Брусина.

Исследование ряда авторов показывает, что эта реакция, выражающаяся в нагрузке кровяными пластинками, является специфической и весьма чувствительной, позволяющей, по мнению Кричевского, дифференцировать даже отдельные расы одного и того же штамма.

В настоящее время имеются исследования этого феномена нагрузки по отношению к различным видам простейших и спирохэт. Из доступной нам литературы мы знаем исследование этого феномена по отношению к бледным спирохэтам только Кrantz’a, Аристовского и Взорова. Krantz при исследовании сывороток кроликов, инфицированных своим штаммом бледных спирохэт получал положительный феномен нагрузки в отношении спирохэт того же штамма; при применении же спирохэт и сывороток другого происхождения получая со отрицательная реакция. Аристовcкий и Взоров изучали феномен нагрузки с. сыворотками нормальных кроликов и кроликов, проиммунизированных культурами бледных спирохэт I и II шт. (Казань) и штамма Reiter’a. С нормальными сыворотками положительная реакция нагрузки наблюдалась при разведении 1 : 2— 1:5 и как очень редкой явление при разведении 1 : 10. (Соответственно этим разведениям концентрация сыворотки в опытной пробирке равнялась 1 : 10, 1 :25 и 1 : 50). Сыворотки же иммунизированных кроликов давали положительный феномен нагрузки при концентрации иммунной сыворотки в опытной пробирке 1 :1000 и даже 1 :2000, в отдельных же случаях при еще больших разведениях до 1 : 5000 и даже 1 : 10.000.

Нам казалось важным исследовать реакцию нагрузки с точки зрения выяснения следующих моментов: возможности обнаружения этого феномена по отношению к бледным спирохэтам с сыворотками кроликов, зараженных сифилисом и его отношения к отдельным штаммам культуральных спирохэт.

При изучении феномена нагрузки нами были испытаны сыворотки нормальных кроликов и сыворотки кроликов, зараженных интратестикулярно штаммом Truffi. В качестве антигена применялись спирохэты культур I и II штаммов.

При постановке реакции мы придерживались методики, предложенной Аристовским и Взоровым. Исследуемые сыворотки инактивировались. Взвесь кровяных бляшек готовилась из крови, взятой из сердца мирской свинки, причем кровь смешивалась в пробирке с 2°/₀ раствором Nart. citrici из расчета—1 часть крови на 1 часть цитрата; смесь центрифугировалась в течение нескольких минут при большом числе оборотов: при этом на дне пробирки образуется осадок из красных кровяных шариков, а над ним столбик белесоватой жидкости—цитратной плазмы, с большим содержанием кровяных пластинок.

В маленьких узких пробирках смешивались по 1 капле сыворотки соответствующего разведения (1 : 2, 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1:60, 1 : 80 и т. д.), по 3 капли кровяных бляшек и по 1 капле культуры спирохэт. В качестве контроля служила смесь 3 капель взвеси бляшек, 1 капли физиологического раствора NaCl и 1 капли культуры спирохэт. Результаты определялись после 1 часа пребывания пробирок в термостате при 35—37° путем исследования капли смеси в затемненном поле.

Феномен нагрузки наблюдался в сыворотках как здоровых кроликов, так и зараженных, причем в зависимости от концентрации сывороток в различной степени—начиная от спирохэт, облепленных несколькими экземплярами бляшек, до спирохэт, сплошь покрытых ими. Из исследованных 25 нормальных сывороток со спирохетами I шт, феномен нагрузки отсутствовал в разведении 1:2 в 4 сыв., отмечался при разведениях 1:2 в 12, 1:10 в 7, 1:20 в 2 сыворотках. При исследовании же 28 сывороток со спирохетами II шт. этот феномен отсутствовал при разведении 1: 2 в 2 сыв., наблюдался в разведениях сывороток 1:2 в 8, 1:10 в 13 и 1:20 в 5 случаях. Т. о. нормальные сыворотки с обоими штаммами спирохэт дали феномен нагрузки в пределах разведений до 1:20, причем в рамках этих разведений реакция чаще наблюдалась при исследовании сывороток со спирохэтами I шт. в разведениях до 1:10, со II шт. в разв. 1:10—20.

Результаты исследований показывают, что феномен нагрузки с опытными сыворотками наблюдается в более высоких разведениях, чем со здоровыми, примерно 90% сывороток с начала 2-го месяца инфекции дали феномен нагрузки в разведениях выше 1: 20, доходящих в некоторых случаях до 1:80, в пределах которых здоровые сыворотки ни разу не давали эту реакцию. Повышение титра реакции наступало в течение второго месяца после инфекции кроликов и втечение 4 месяцев нашего наблюдения оставалось без особых колебаний. Правда, в течение 4-го месяца как бы выступает тенденция к снижению титра этой реакции, однако, делать какие либо выводы в отношении дальнейшей динамики этой реакции, за неимением более продолжительных наблюдений—не представляется возможным.

Все сыворотки, за исключением одной, реагировали положительно в разведении выше 1 :20. В отношении разных штаммов отмечается ясное различие. Сыворотки, исследованные со спирохэтами II шт., чаще проявляли феномен нагрузки в более высоких разведениях, нежели в I шт.

Резюмируя полученные нами данные в отношении реакции нагрузки мы можем отметить следующее: в наших случаях феномен нагрузки с нормальными сыворотками наблюдался в несколько больших предельных разведениях (1:20), концентрация сыворотки в опыте равняется (1:100), нежели в наблюдениях проф. Аристовского и Взорова.

Сыворотки кроликов, зараженных штаммом Truffi, значительно отличаются от нормальных по своему действию на спирохэгы обоих штаммов, вызывая феномен нагрузки при разведениях 1:40—1:60 — 1:80 (концентрация сывороток в пробирках соответственно равняется разведениям 1:200, 1:300, 1:400) и резко отстают от сывороток кроликов, иммунизированных культуральными спирохэтами.

При исследовании опытных сывороток I и II штаммы спирохэт дают феномен нагрузки при одинаковых предельных разведениях, однако I шт. в сравнении с I шт. чаще дает реакцию нагрузки в предельных разведениях сывороток. Повидимому, спирохэты II шт, по своим иммунобиологическим, антигенным особенностям в большей степени соответствуют спирохэтам штамма Truffi, которыми заражены кролики, чем спирохэты I шт.

Сравнивая результаты р. R-Б. с другими реакциями, мы можем отметить следующее: титр феномена нагрузки при исследовании сывороток кроликов—сифилитиков является несколько более высоким, чем при остальных реакциях; причем повышение титра первого идет параллельно с таковым остальных. Отмечается известное сходство р. R-Б и агглютинации в отношении штаммов спирохэт; как феномен нагрузки, так и явления агглютинации в более высоких разведениях чаще наблюдались при исследовании со спирохэтами II шт.

Резюмируя все полученные нами данные опытов мы можем отметить следующее:

Большинство исследованных нормальных сывороток проявляет агглютинирующее и литическое действие на культуральные спирохеты в небольших разведениях—1:10.

Сыворотки инфицированных кроликов проявляют агглютинирующее и литическое свойства примерно в 85% случаев, причем в незначительных пределах—до 1: 40 —1: 60.

Явления лизиса наблюдались со всеми сыворотками, однако, в более слабо выраженной степени с инактивированными сыворотками без прибавления комплемента. Добавление к ним комплемента усиливало литическое действие сывороток.

Агглютинирующие и лизирующие свойства сывороток проявлялись несколько различно по отношению к отдельным штаммам спирохэт. Более сильным агглютинирующим действием обладают сыворотки в отношении спирохэт II штамма. Обычно при одних и тех же разведениях сывороток явления агглютинации чаще и в более резкой степени отмечались со спирохэтами II штамма.

Явления же лизиса чаще и в более резкой степени проявлялись при исследовании сывороток со спирохэтами I шт.

Феномен нагрузки наблюдался при несколько больших разведениях сывороток, чем реакции агглютинации и лизиса, в особенности при исследовании сывороток со II штаммом.

Т. о. наши исследования показывают, что при экспериментальном сифилисе кроликов специфические агглютинационные и литические свойства сывороток, а также феномен нагрузки выражаются в слабой степени.