Phage sensitivity profiles of a nasopharyngeal opportunistic pathogen in Streptococcus pneumoniae carrier children with recurrent respiratory infections

Full Text

Актуальность. Микробиоценоз верхних дыхательных путей как составная часть микробиоты макроорганизма активно участвует в обучении иммунокомпетентных клеток антиинфекционной защите, а также в формировании патологического процесса [1]. При контаминации слизистой оболочки условно-патогенной и патогенной микрофлорой, распознаваемой PRRs-рецепторами, активируются резидентные макрофаги, NK-клетки и дендритные клетки. Синтез провоспалительных цитокинов приводит к миграции в очаг воспаления нейтрофилов, моноцитов, а также других клеток врождённого иммунитета с последующей активацией их эффекторных механизмов элиминации патогена (фагоцитоза, кислород-зависимых механизмов киллинга) [2].

Клетки врождённого иммунитета дополнительно стимулируются молекулами DAMP, накапливающимися в очаге воспаления в результате повреждения клеток [3]. Более того, клетки эпителия также способны участвовать в защите от патогенов секрецией антимикробных полипептидов (дефензинов, анионных и катионных пептидов и т.д.), дестабилизирующих мембраны чужеродных организмов [4].

Приобретённый иммунитет отвечает за формирование мукозального барьера путём секреции иммуноглобулинов типа IgA. Именно IgA доминирует в слизистых оболочках, обладает специфичностью для конкретного патогена. Синтез IgA происходит с помощью дендритных клеток, которые отбирают в основном бактерии, адгезированные на эпителии, и взаимодействуют с В- и Т-клетками лимфоаденоидного глоточного кольца, регионарных лимфатических узлов.

Однако не все микроорганизмы подвергаются элиминации клетками иммунной системы: некоторые из них вступают с системой иммунитета в синергические отношения с развитием толерантности. Хотя иммунологическая толерантность к комменсалам, вероятно, достигается с помощью множественных механизмов, за последние несколько лет регуляторные T-клетки Foxp3+ заняли центральное место в нашем понимании этого процесса. Комменсалы способствуют индукции регуляторных Т-клеток посредством прямого восприятия микробных продуктов или метаболитов Т-клетками или дендритными клетками, что в свою очередь предотвращает избыточную реакцию иммунной системы и развития воспаления [5].

К сожалению, нельзя спрогнозировать, когда тот или иной комменсальный микроорганизм преодолеет толерантность иммунной системы и начнёт проявлять патогенные свойства, так как микробиота носоглотки представляет собой чрезвычайно динамичную систему, в которой микроорганизмы находятся в состоянии непрерывного взаимодействия с иммунной системой макроорганизма и другими микроорганизмами, колонизирующими этот биотоп, — Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Hemophilus influenza, Staphylococcus aureus, spp. Prevotella, spp. Veillonella и т.д. [6].

У детей дошкольного возраста, страдающих рекуррентными респираторными инфекциями, нередко происходит совместная колонизация условно-патогенными и патогенными микроорганизмами в составе микробиома носоглотки [7]. S. pneumoniae — один из ключевых факторов в развитии мукозальных респираторных и инвазивных инфекций [8]. Носительство S. pneumoniae бывает характерной чертой часто болеющих детей. Наиболее часто отмечают совместную колонизацию S. pneumoniae с S. aureus, Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis и Klebsiella pneumoniae. Одновременная колонизация несколькими возбудителями приводит к суммированию вирулентного потенциала, что увеличивает риск развития повторных респираторных инфекций у детей. Более того, частое применение антибиотиков провоцирует формирование резистентных к антимикробным препаратам штаммов.

Вакцинация — не только наиболее эффективная мера для снижения заболеваемости инвазивными пневмококковыми инфекциями, но и важный инструмент, позволяющий снизить уровень антибиотикорезистентности пневмококков в связи с тем фактом, что наиболее устойчивы к химиопрепаратам вакцинные серотипы [9, 10].

Одним из возможных методов эрадикации носительства патогенной и условно-патогенной микрофлоры, в частности S. pneumoniae, служит применение вирулентных бактериофагов с широким спектром литической активности. Выбор бактериофагов должен быть основан на определении чувствительности к ним возбудителя in vitro. Бактериофаги, применяемые для фаготерапии и фагопрофилактики, выпускаемые различными производителями, различаются по составу фагового коктейля. Для повышения результативности проводят периодическую смену фагов в препаратах.

Важное условие эффективности применения фаговых препаратов — совпадение серии препарата, тестируемого в лаборатории, с серией назначаемого пациенту препарата. Следует также помнить о выработке штамм-специфического антифагового иммунного ответа при повторном применении бактериофагов.

Цель исследования — изучение характера микробиоты и оценка профиля чувствительности к антибиотикам и бактериофагам условно-патогенной микрофлоры носоглотки у детей-носителей S. pneumoniae с рекуррентными респираторными инфекциями. Исследование одобрено локальным этическим комитетом Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии (протокол №2 от 09.09.2019).

Материал и методы исследования. Исследование микрофлоры носоглотки проведено у 182 детей с рекуррентными респираторными инфекциями, обратившихся за консультативной медицинской помощью в Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии, у которых ранее был установлен факт носительства S. pneumoniae. Распределение по возрасту было следующим: до 2 лет — 96 детей, 3–4 лет — 47 человек, 5–7 лет — 39 детей.

Посев биоматериала производили на агар (Columbia, Bio-Rad, США) с добавлением 3% эритроцитарной массы, маннит-солевой желточный агар, шоколадный агар, содержащий 10 мкг/мл никотинамидадениндинуклеотида, который добавляли в питательную среду, предварительно охлаждённую до 50–60 °C, Эндо, Сабуро. Идентификацию микроорганизмов проводили согласно нормативной документации [11]. Выделенные культуры подтверждали с помощью MALDI-TOF масс-спектрометра MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Bremen, Germany).

Оценку профиля чувствительности к антимикробным препаратам и интерпретацию результатов проводили согласно клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» EUCAST (2018).

Определение чувствительности к бактериофагам осуществляли скрининговым методом (спот-тестом). В исследование включены бактериофаги производства НПО «Микроген»: бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный (г. Уфа) и пиобактериофаг поливалентный «Секстафаг» (г. Пермь). Для определения титра бактериофага в единице объёма использовали метод Грациа (подсчёт количества образуемых негативных пятен — БОЕ/мл1).

Результаты. Изучение носоглоточной микробиоты детей дошкольного возраста с рекуррентными респираторными инфекциями показало, что Streptococcus pneumoniaе выделялся в 28,5% случаев в монокультуре в высокой степени колонизации (104–106 КОЕ/мл2). В качестве пневмококк-ассоциированного таксона регистрировался Staphylococcus aureus, который преобладал у детей старше 5 лет (46,1%) с высокой степенью колонизации (105–106 КОЕ/мл). В составе ассоциации также высевались Moraxella catarrhalis (39,3%) и Hemophilus influenzae (36,8%), реже присутствовала совместная колонизация с Moraxella nonliquefaciens (23%) и Corynebacterium pseudodiphtheriticum (21,2%). Были выявлены бактериальные ассоциации S. pneumoniaе с другими патогенами: K. pneumoniae (9,3%) и грибами рода Candida (5,5%).

Микробиологический пейзаж слизистых оболочек детей, свободных от носительства S. pneumoniaе, был представлен в основном коагулазонегативными стафилококками (S. epidermidis, S. capitis, S. hominis).

Для оценки видового разнообразия с учётом наиболее значимых и редких видов бактерий использовали индекс Шеннона — индекс разнообразия (1,7), который показал увеличение роли транзиторной микрофлоры — грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp.

Скрининг чувствительности Streptococcus pneumoniaе к антибиотикам показал следующие результаты: устойчивостью к оксациллину обладали 20,7% штаммов (n=48), к эритромицину и клиндамицину — 45,9% (n=113) и 20% (n=48) соответственно. Фенотипическая устойчивость к ко-тримоксазолу (сульфаметоксазолу + триметоприму) выявлена у 18,4% (n=45) штаммов. Данные исследования показали, что мультирезистентность штаммов (резистентность к трём и более антибиотикам) обнаружена у 48 (19,6%) изолятов. Резистентностью к трём группам антимикробных препаратов (оксациллин + эритромицин + ко-тримоксазол) обладали 14 штаммов. Количество мультирезистентных изолятов к комбинации оксациллин + эритромицин + клиндамицин составило 34.

Исследование чувствительности выделенных культур S. pneumoniaе к бактериофагам показало, что 97,2% штаммов были чувствительными к стрептококковому бактериофагу, 75% штаммов — к пиобактериофагу, причём у всех антибиотикорезистентных штаммов сохранялась чувствительность к стрептококковому бактериофагу. Как известно, стрептококковый бактериофаг обладает способностью специфически лизировать бактерии Streptococcus, а пиобактериофаг вызывает специфический лизис следующих бактерий: Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, энтеропатогенных Escheri­chia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae. Оба эти препарата можно применять в составе комплексной терапии при лечении заболеваний уха, горла, носа, верхних дыхательных путей и лёгких.

Также не исключена роль назофарингеального носительства Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae совместно с Streptococcus pneumoniae в развитии рекуррентных инфекций респираторного тракта. Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae относятся к ESKAPE-­патогенам, обладающим по сравнению с другими представителями микробиоты верхних дыхательных путей выраженной склонностью к формированию резистентности, что особенно неблагоприятно для детей, регулярно получающих антимикробную терапию на фоне частых респираторных инфекций.

С учётом данной гипотезы была оценена антибиотико- и фагочувствительность к наиболее часто используемым препаратам с антибактериальным действием. Оценка профиля резистентности назофарингеальных штаммов Klebsiella pneumoniaе (n=23) показала, что наиболее активными антиклебсиеллёзными препаратами служат фуразолидон и гентамицин (84,8% чувствительных изолятов). Доля чувствительных к ципрофлоксацину изолятов составила 78,3%, к цефтриаксону и цефиксиму — по 78,3% культур, к хлорамфениколу — 71,7%, к тетрациклину — 69,6% штаммов. Количество полирезистентных штаммов составило 14% (n=9).

Определение литической активности бактериофагов в отношении Klebsiella pneumoniaе с использованием спот-теста: к бактериофагу клебсиелл поливалентному очищенному чувствительны 39,1%, к пиобактериофагу поливалентному «Секстафаг» — 45,7% изолятов.

Для количественной оценки литической активности бактериофагов в отношении культур, к которым была выявлена умеренная чувствительность (++), использовали метод Грациа (n=8). Данный метод позволяет регистрировать количество негативных колоний (стерильных пятен), образовавшихся в агаризованной питательной среде в результате инкубирования взвеси бактериофага при его культивировании с тестируемыми изолятами. Учитывали результаты путём подсчёта БОЕ, засеянных наиболее высокими разведениями (рис. 1).

 

Рис. 1. Количество негативных колоний в 1 мл бактериофага при различных разведениях

 

При обнаружении на секторе чашки негативных колоний культуру оценивают как чувствительную. Получены следующие результаты: на фоне равномерного роста Klebsiella pneumoniaе видны зоны полного отсутствия роста (полный лизис). Каждая бляшка образовалась в результате действия одной частицы фага. Титр испытуемого бактериофага (количество активных частиц фага) варьировал от 9×10–6 до 5×10–5 БОЕ/мл (табл. 1).

 

Таблица 1. Литическая активность клебсиеллёзного фага в отношении назофарингеальных штаммов Klebsiella pneumoniae

Номер штамма	Возбудитель	Спот-тест	Бактериофаг клебсиеллы поливалентный очищенный
			Титр по Грациа, БОЕ/мл (по разведениям)
269	K. pneumoniae	++	47×10–5	3×10–6
135	K. pneumoniae	++	67×10–5	7×10–6
145	K. pneumoniae	+	5×10–5	1×10–6
151	K. pneumoniae	+/–	5×10–5	0×10–6
285	K. pneumoniae	+	46×10–5	4×10–6
282	K. pneumoniae	++	94×10–5	9×10–6
347	K. pneumoniae	++	87×10–5	9×10–6
621	K. pneumoniae	+	18×10–5	1×10–6

 

Определение профиля резистентности к антимикробным препаратам назофарингеальных штаммов Staphylococcus aureus (n=113) показало следующие результаты: все штаммы были чувствительны к фузидиевой кислоте, чувствительность к мупироцину составила 75,2%. К хлорамфениколу были чувствительны 71,6% штаммов, к фторхинолонам (ципрофлоксацину) — 64,6%, к макролидам (эритромицину) — 61,6% изолятов Staphylococcus aureus. Результаты ранжирования антистафилококковой активности химиопрепаратов в отношении назофарингеальных Staphylococcus aureus по мере снижения эффективности: фузидиевая кислота ˃ мупироцин ˃ хлорамфеникол ˃ ципрофлоксацин ˃ эритромицин.

Фаговые препараты проявили достаточно высокую антибактериальную активность: стафилококковый бактериофаг оказывал литическое действие в отношении 71,6% изолятов, пиобактериофаг — в отношении 63,7% испытуемых культур золотистого стафилококка. Необходимо отметить, что бактериофаги лизировали и штаммы Staphylococcus aureus с множественной устойчивостью к антимикробным препаратам.

Обсуждение. Таким образом, микробиоценоз носоглотки детей-носителей пневмококков представлен вариабельным многокомпонентным сообществом условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Анализ носительства патогенов, обладающих инвазивными свойствами, необходим для разработки методов профилактики заболеваний респираторного тракта с учётом ассоциативного характера назофарингеальной микробиоты. Результаты исследования свидетельствуют, что штаммы условно-патогенных бактерий, колонизирующие носоглотку детей с рекуррентными рецидивирующими инфекциями, достаточно эффективно лизируются бактериофаговыми препаратами, следовательно, бактериофаги можно применять в качестве альтернативных антибактериальных препаратов для фаготерапии и фагопрофилактики. Преимущество комбинированного применения химиопрепаратов и бактериофагов заключается в том, что бактерии не имеют общих механизмов устойчивости к антимикробным средствам и бактериофагам, поэтому их можно использовать для успешной эрадикации антибиотикорезистентных патогенов.

Исследования, направленные на изучение назофарингеального носительства указанных возбудителей и их взаимосвязь, позволят в каждом конкретном случае провести целенаправленную профилактику и лечение инфекционных процессов с учётом региональных особенностей, в частности вызванных ассоциациями и монокультурами бактерий.

Выводы

1. Микробиоценоз носоглотки детей-носителей пневмококков представлен вариабельной полимикробной ассоциацией.

2. Носоглоточные штаммы эффективно лизируются бактериофагами. Моно- и поливалентные бактериофаги можно применять в качестве альтернативы антибактериальному лечению у детей-носителей Streptococcus pneumoniae c рекуррентными респираторными инфекциями.

3. Необходимо проведение мониторинга устойчивости назофарингеальных бактерий к бактериофагам с целью актуализации фагового состава.

 

Участие авторов. Л.Т.Б. — руководитель работы, участвовала в сборе материала, анализировала данные; О.Ф.Т. участвовала в сборе материала, проводила исследования; Т.А.Ч. участвовала в сборе материала, проводила исследования; Н.С.К. проводил исследования; К.Н.С. проводил исследования; Г.Ш.И. анализировала данные.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке государственного задания №АААА-А16-116041110143-3, выполняемой в соответствии с отраслевой научно-исследовательской программой Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Проблемно-ориентированные научные исследования в области эпидемиологического надзора за инфекционными и паразитарными болезнями» (на 2016–2020 гг.).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

L T Bayazitova

Kazan Scientific and Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Kazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: bajalt@mail.ru
SPIN-code: 3981-9173
Russian Federation, Kazan, Russia; Kazan, Russia

O F Tupkina

Kazan Scientific and Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: bajalt@mail.ru
SPIN-code: 3544-6622
Russian Federation, г. Казань, Россия

T A Chazova

Kazan Scientific and Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: bajalt@mail.ru
SPIN-code: 6571-0937
Russian Federation, г. Казань, Россия

N S Konyshev

Kazan State Medical University

Email: bajalt@mail.ru
Russian Federation, г. Казань, Россия

K N Syuzev

Kazan State Medical University

Email: bajalt@mail.ru
Russian Federation, г. Казань, Россия

G Sh Isaeva

Kazan Scientific and Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Kazan State Medical University

Email: bajalt@mail.ru
SPIN-code: 8251-9884
Russian Federation, г. Казань, Россия; г. Казань, Россия

References

Supplementary files