Electron microscopy study of antibacterial effect of selimakcid against salmonella and escherichia

Full Text

В настоящее время сложились отчётливые представления, свидетельствующие не только о положительном влиянии, но и о негативных воздействиях на организм больного многих применяемых в медицинской практике антибактериальных средств. К ним можно отнести развитие дисбиотических процессов в кишечнике, нарушение моторной и секреторной функций желудочно-кишечного тракта, задержку репарации слизистой оболочки кишечника, угнетение процессов иммуногенеза и др. [1, 3, 8, 10]. Выработка множественной лекарственной устойчивости бактерий к средствам этиотропной терапии, которая приводит к неэффективности лечения, диктует необходимость изыскания новых антимикробных препаратов [6, 11, 12]. На основании первичных исследований из 18 синтезированных сотрудниками Института органической и физической химии (ИОФХ) им. Арбузова сераорганических соединений нами была отобрана диэтиламмониевая соль N-метиламино-1-фенилметансульфоновой кислоты, названная условно селимакцид [4]. Результаты экспериментов с нашим участием показали, что селимакцид проявляет бактерицидную активность в концентрации 6-10-15-20-25 мг/мл и выше, хламидиостатичность, не обладает мутагенным, цитогенетическим, эмбриотоксическим, тератогенным, гонадотоксическим действием. Антимикробная активность не менялась в кислой среде и была сопоставима/превышала бактерицидность некоторых традиционных антибактериальных средств, применяемых для этиотропной терапии острых кишечных инфекций. В экспериментальных условиях in vivo на модели сальмонеллёза у лабораторных животных селимакцид сохраняет свою антимикробную активность и предотвращает формирование бактерионосительства [7, 9]. Цель исследования заключалась в оценке ультраструктурной организации бактериальных клеток Salmonella enteritidis и Escherichia coli после воздействия на них препарата селимакцид. В исследовании использовали изоляты Salmonella enteritidis и энтеропатогенные Escherichia coli. Селимакцид (диэтиламмониевую соль N-метиламино-1-фенилметансульфоновой кислоты) брали в концентрациях 10, 15 и 25 мг/мл на изотоническом растворе натрия хлорида. Подготовка культуры. Для электронно-микроскопических исследований культуру выращивали в течение суток на питательной среде (мясо-пептонном агаре). Бактериальную суспензию готовили на изотоническом растворе натрия хлорида в концентрации 2 млрд микробных клеток на 1 мл. Осадок культуры, полученный центрифугированием при 5000 об./мин в течение 15 мин, однократно промывали. Для изучения противомикробной активности к суспензии исходного штамма добавляли раствор селимакцида, по истечении 30 мин центрифугировали, осадок промывали изотоническим раствором натрия хлорида. Метод негативного контрастирования. Каплю исследуемой бактериальной суспензии наносили на медные сетки, покрытые формваровой плёнкой, контрастировали 2% водным раствором уранилацетата 1 мин при комнатной температуре, промывали дистиллированной водой, просушивали, а затем просматривали на электронном микроскопе JEM 100СХ-2. Метод ультратонких срезов. Осадок культуры получали центрифугированием, заключали в агар. Кусочки заключённой в агар культуры вырезали и фиксировали в эппендорфах с 1% раствором глутарового альдегида (SERVA, Германия) на 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,4) в течение 12 ч в холодильнике [2]. Постфиксацию проводили в 2% растворе четырёхокиси осмия (Московский химзавод) на том же буфере в течение 2 ч при комнатной температуре. После дегидратации образцы заключали в смесь эпоновых (Epon-812, MNA, DDSA) смол (SERVA, Германия). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-3 и изучали в электронном микроскопе JEM 100CX-2 («Jeol», Japan). Съёмку проводили на плёнку AGFA ORTHOCHROMATIC. Для получения микрофотографий негативы сканировали на сканере EPSON PERFECTION 4990 PHOTO с разрешением 600 dpi. Электронно-микроскопические исследования сальмонелл методом негативного контрастирования выявили шаровидную и палочковидную форму клеток, шириной 0,75 мкм и длиной 1,45 мкм. На микроснимках образцов S. enteritidis наблюдали отдельные клетки и их скопления, в которых микроорганизмы «прилипают» друг к другу. Клеточная стенка у большинства бактерий имеет ровную поверхность, на некоторых участках просматривается складчатость (рис. 1, А). Вокруг клеток или на клеточной стенке встречаются мембраноограниченные сферические везикулы размером 25-90 нм (рис. 2, А) с гомогенным электронно-светлым содержимым. Вероятно, эти везикулы образуются на внешней мембране клеточной стенки бактерий путём отшнуровывания части клеточного материала. В околоклеточном пространстве регистрируются единичные жгутики. Внутреннее содержимое клетки заполнено веществом различной плотности. Область нуклеоида имеет более электронно-плотную структуру, чем гиалоплазма. Среди компонентов нуклеоида определяется округлый участок, характеризующийся высокой электронной плотностью, вероятно, аппарат репликации и транскрипции дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) [5]. На дистальных участках просматривается гомогенное электронно-светлое периплазматическое пространство. На снимках были обнаружены гантелевидные делящиеся бактерии, в которых хорошо просматривались перетяжки. На ультратонких срезах бактерии имеют шаровидную или палочковидную форму. Вокруг клеток регистрируются везикулы внешней мембраны. На микрофотографиях хорошо просматриваются извилистая многослойная клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана, которые окружают бактериальные клетки, характерные для грамотрицательных микроорганизмов. На поверхности клеток, видны пили (рис. 1, Б), участки которых длиной до 15 нм изредка попадают на плоскость среза. В суточной культуре сальмонелл обнаруживались и единичные жгутики. На наружной поверхности клеточной стенки выявлен аморфный материал средней электронной плотности, среди которого встречаются электронно-плотные гранулы размером от 17,5 до 40,0 нм (рис. 2, Б). Под наружной мембраной находится пластинчатый внутренний ригидный слой клеточной стенки, образованный пептидогликанами. Общая толщина слоёв клеточной стенки составляет от 17,5 до 23,0 нм (в среднем 20,9, р <0,05). Под клеточной стенкой располагается относительно ровная цитоплазматическая мембрана (7,5-8,5 нм), её контуры не повторяют извилистости наружной мембраны. Между клеточной стенкой и цитоплазмой имеется периплазматическое пространство. У некоторых клеток наблюдается примыкание цитоплазматической мембраны к клеточной стенке. У большинства клеток оно располагается тонкой ровной лентой либо образует расширения и заполнено электронно-прозрачным веществом. Ультраструктура цитоплазмы бактерий S. enteritidis характеризуется высокой электронной плотностью и заполнена гранулярным компонентом - рибосомы, полирибосомы. Присутствуют электронно-плотные включения размером 30-60 нм и изредка округлые внутрицитоплазматические мембранные структуры. В области нуклеоида нити ДНК не просматриваются. При негативном контрастировании клетки Escherichia coli имеют палочковидную форму длиной от 1,41 до 4 мкм и шириной в среднем 0,5 мкм (рис. 3, А). На микроснимках образцов клетки образуют конгломераты, как и сальмонеллы. Клеточная стенка у большинства из них имеет ровную поверхность, на некоторых участках просматривается складчатость. Мембраноограниченные сферические везикулы вокруг клеток встречаются очень редко, регистрируются единичные жгутики. Область нуклеоида и окружающей гиалоплазмы отличается высокой плотностью. Электронно-микроскопические исследования образцов Escherichia coli по методу ультратонких срезов регистрировали сечения клеток шаровидной или палочковидной формы. На снимках обнаружены гантелевидные делящиеся бактерии. Везикулы внешней мембраны размером 35-47 нм располагаются в непосредственной близости к поверхности клеточной стенки. Ультратонкие исследования односуточной культуры E. coli выявили гладкую поверхность клеточной стенки, на которой регистрируются пили диаметром 9-11 нм и жгутики 22-24 нм. На срезах (рис. 3, Б) просматриваются немного извилистая многослойная клеточная стенка и плазматическая мембрана. Между клеточной стенкой и плазмалеммой имеется периплазматическое пространство. На наружной поверхности клеточной стенки выявлен аморфный материал более высокой плотности, чем у возбудителей сальмонеллёза. Общая толщина слоёв клеточной стенки варьирует от 19,1 до 41,7 нм, среднее значение составляет 25,44 нм (р <0,05), что превышает толщину клеточной стенки сальмонелл на 5,35 нм. Ультраструктура цитоплазмы бактерий Escherichia coli характеризуется высокой электронной плотностью. Встречаются округлые гомогенные электронно-плотные включения размером до 80 нм, зона нуклеоида не просматривается, что характерно для клеток без нарушений в транспортных системах [5]. При воздействии селимакцида на Escherichia coli на микрофотографиях, полученных методом негативного контрастирования, в зависимости от концентрации препарата обнаруживаются клетки с различной степенью повреждения. После влияния селимакцида в концентрации 10 мг/мл бо́льшая часть клеток сохраняет палочковидную форму и прежние размеры (рис. 4, А). Вокруг некоторых бактерий обнаруживаются мембраноограниченные везикулы размером 50-100 нм. Отмечаются уплотнение области нуклеоида и цитоплазмы, увеличение периплазматического пространства, особенно в дистальных участках. По мере увеличения концентрации селимакцида (15 и 25 мг/мл) увеличивается доля повреждённых клеток, которые внешне выглядят как сморщенные, они теряют свой объём за счёт резкого сокращения периплазматического пространства, вероятно, из-за дефектов клеточной стенки (рис. 4, Б, В). Границы клеток становятся неровными, цитоплазма и нуклеоид не дифференцируются, имеют высокую электронную плотность. В культуре Escherichia coli, выдержанной в среде, содержащей селимакцид в концентрации 25 мг/мл, кроме изменений, описанных выше, наблюдаются бактерии на стадии лизиса, которые теряют своё содержимое путём отделения клеточных частей, ограниченных мембранами, от клетки (рис. 4, Г). Исследования методом ультратонких срезов Salmonella enteritidis и Escherichia coli после воздействия селимакцида в концентрации 25 мг/мл: после выдерживания культур сальмонелл и эшерихий в среде, содержащей селимакцид, размеры клеток по сравнению с контролем существенно не меняются. В культуре Salmonella enteritidis наблюдается увеличение количества везикул внешней мембраны. У эшерихий как в контроле, так и под воздействием антибактериального средства обнаруживаются только единичные везикулы внешней мембраны. У клеток Salmonella enteritidis за счёт деструкции аморфного наружного слоя изменяется структура клеточной стенки, она становится тоньше, чем в норме (средняя толщина 16,4 нм, р <0,05). Количество и размеры гранул на поверхности клеточной стенки - без изменений. У Escherichia coli размеры клеточной стенки под действием антибактериального препарата не меняются, она остаётся такой же плотности. У обеих исследуемых культур по периферии цитоплазмы наблюдаются уплотнение мелкогранулярного компонента цитоплазмы и просветление в центральной части клетки, в области нуклеоида (рис. 5). Отмечается увеличение количества плотных (осмиофильных) включений в области нуклеоида. Регистрируется расширение периплазматического пространства с дистальных сторон клеток, которое заполнено мелкогранулярным содержимым средней электронной плотности. В культуре Escherichia coli часто обнаруживаются повреждённые клетки с хлопьевидной цитоплазмой и разрывами плазматической мембраны (см. рис. 5, Б). Регистрируются и лизированные клетки, которые распадаются на отдельные мембраноограниченные и не ограниченные части. Среди культуры сальмонелл клетки с такой степенью повреждения не регистрируются (см. рис. 5, А). ВЫВОДЫ 1. Ультраструктурная картина постантибиотического эффекта препарата селимакцид на клетках Salmonella enteritidis характеризуется увеличением везикул внешней мембраны и изменениями клеточной стенки, которые можно отнести к адаптационным. 2. В культуре Escherichia coli после выдерживания в среде, содержащей селимакцид, отмечается наличие как повреждённых (с хлопьевидной цитоплазмой и разрывами плазматической мембраны), так и лизированных (отделяют своё содержимое в окружающую среду) клеток. 3. Уплотнение цитоплазмы вокруг просветлённого нуклеоида и увеличение перинуклеарного пространства у сальмонелл и эшерихий, вероятно, связано с дисбалансом ионно-транспортных систем, диссоциацией рибосом, что приводит к нарушению белок-синтезирующего комплекса и дезориентации генетического аппарата. Рис. 1. Культура клеток Salmonella enteritidis без воздействия препарата: А - негативное контрастирование; Б - метод ультратонких срезов. ЦП - цитоплазма; КС - клеточная стенка; Ц - цитоплазматическая мембрана; В - включения цитоплазмы; ПЛ - пили; mm - мкм Рис. 2. Культура клеток Salmonella enteritidis без воздействия препарата: А - негативное контрастирование; Б - метод ультратонких срезов; В - включения цитоплазмы; Г - гранулы на поверхности клеточной стенки; стрелки показывают везикулы внешней мембраны; mm - мкм missing image file missing image file missing image file Рис. 3. Культура клеток Escherichia coli без воздействия препарата: А - негативное контрастирование; Б - метод ультратонких срезов. ЦП - цитоплазма; КС - клеточная стенка; ЦМ - цитоплазматическая мембрана; ПП - периплазматическое пространство; mm - мкм missing image file missing image file Рис. 4. Культура клеток Escherichia coli после воздействия селимакцида. Негативное контрастирование: А - влияние селимакцида в концентрации 10 мг/мл; Б - влияние селимакцида в концентрации 15 мг/мл; В, Г - влияние селимакцида в концентрации 25 мг/мл. ПП - периплазматическое пространство; ПК - повреждённые клетки; стрелка - везикулы внешней мембраны; mm - мкм. © 6. «Казанский мед. ж.», №1 missing image file missing image file missing image file missing image file Рис. 5. Воздействие селимакцида в концентрации 25 мг/мл. Метод ультратонких срезов. А - Salmonella enteritidis; Б - Escherichia coli. ЦП - цитоплазма; ПП - периплазматическое пространство; Н - нуклеоид; В - осмиофильные включения; стрелки показывают разрывы цитоплазматической мембраны; mm - мкм.

About the authors

G Kh Murtazina

Kazan State Medical University

Email: murtaza07@mail.ru

M M Salnikova

Federal Toxicological, Radiation and Biological Safety Center

References

Supplementary files