Activity of antioxidant enzymes and processes of free radical oxidation in experimental hypothyroidism and correction of thyroid shifts with iodized polysaccharide complexes

Full Text

В настоящее время в литературе встречаются лишь единичные указания на изменения антиоксидантного статуса организма при заболеваниях щитовидной железы. Существующие данные о вовлечении тиреоидных гормонов в процессы регуляции свободнорадикального окисления (СРО) весьма противоречивы [6]. Антиокислительная активность тироксина (Т4), не уступающая активности α-токоферола и превосходящая антиоксидантную активность кортизола и эстрогенов, отмечена в микросомах и митохондриях. Антиоксидантную активность тиреоидных гормонов связывают с наличием в их структуре фенольного фрагмента [1]. Показано, что Т4 в концентрации 10-7 М ингибирует развитие хемилюминесценции, вызванной действием свободных радикалов в суспензии митохондрий печени крыс, причём антиоксидантная активность гормона на 1-2 порядка превышает действие эстрогенных стероидных гормонов [3]. Увеличение концентрации активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов, белков и других соединений вносит вклад в клиническую картину как гипо-, так и гипертиреоза [4, 9]. По одним источникам, интенсификация СРО при гипотиреозе сопровождается активацией, а по другим - ингибированием ферментов антиоксидантной защиты [7]. Большой интерес представляет изучение биологически активных веществ, обладающих антиоксидантным действием и способных активировать антиоксидантную систему организма [6]. Целью настоящего исследования стало определение активности антиокислительных ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы) в ткани печени (одной из главных мишеней тиреоидных гормонов) на фоне тиамазолового гипотиреоза, а также после его коррекции йодосодержащим органоминеральным комплексом. Анализируемая биологически активная добавка содержит йод в органической связи с полисахаридами растительного генеза, в частности с пектином, в соответствии с формулой изобретения по патенту №2265377 «Биологически активная добавка к пище для профилактики йодной недостаточности и способ её получения» [5]. Йодосодержащее органоминеральное соединение имеет следующий химический состав: пектин - 23,1-25,0 мас. %; йод кристаллический (I2) - 5,0-10,25 мас. %; йодид калия (KI) - 10,0-20,5 мас. %; вода дистиллированная - остальное. Исследования проводили на крысах-самцах массой 180-220 г. Животные были разделены на четыре группы: первая - контрольная, у животных второй, третьей и четвёртой групп вызывали гипотиреоз ежедневным внутрижелудочным введением тиамазола в дозе 2,5 мг на 100 г массы тела в течение 3 нед. После воспроизведения модели гипотиреоза, начиная с 22-го дня эксперимента, животные четвёртой группы в течение 30 дней получали йодосодержащую биологически активную добавку в дозе, обеспечивающей суточную потребность крыс в йоде (от 2 до 3 мкг на 100 г массы тела), животные третьей группы находились на стандартной диете вивария. Крыс второй группы забивали на 22-е сутки эксперимента с целью оценки функционального состояния тиреоидной системы, активности антиоксидантных ферментов и интенсивности процессов СРО в печени при гипотиреозе. Забой осуществляли декапитацией под эфирным наркозом. Гомогенат печени готовили в фосфатном буфере (рН=7,45) с помощью механического гомогенизатора Поттера (тефлон-стекло). Для удаления частично разрушенных клеток и ядер гомогенаты центрифугировали 10 мин при 1000 g. Все процедуры по приготовлению гомогената и выделению субклеточных фракций проводили при температуре от 0 до +4 °C. Активности супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) и глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) оценивали с помощью реактивов набора «RANSOD Randox» фирмы «Laboratories Ltd.». Активность каталазы оценивали по методу М.А. Королюк, основанному на определении не разрушенного каталазой пероксида водорода в реакции с молибдатом при 410 нм. Белок в субклеточных фракциях определяли по Лоури. Статистическую обработку результатов производили, рассчитывая среднее арифметическое значение, стандартные отклонения и ошибки средних по группам животных. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при р <0,05. С целью определения функционального состояния щитовидной железы в сыворотке крови подопытных крыс определяли уровень гормонов щитовидной железы - свободного Т4, общего 3,5,3’-трийодтиронина (Т3) и тиреотропного гормона (ТТГ) - методом иммуноферментного анализа с использованием стандартных тест-систем: «ТироидИФА-свободный Т4», «ТироидИфа-трийодтиронин-01», «ТироидИфа-ТТГ-1» (ЗАО «Алкор Био», Россия) с помощью иммуноферментного автоматического анализатора «УНИПЛАН» (Россия). Изучение процессов СРО в гомогенатах печени крыс проводили на хемилюминомере ХЛ-003, предназначенном для автоматизированного измерения и регистрации спонтанного индуцированного свечения (хемилюминесценции), сопровождающего процессы СРО. Гомогенаты готовили в фосфатном буфере (рН=7,45) с помощью механического гомогенизатора Поттера (тефлон-стекло). Использованная схема введения тиреостатика вызывала сдвиги, которые можно охарактеризовать как начальную стадию тиреоидной недостаточности. У крыс, получавших тиамазол (животные второй, третьей и четвёртой групп), отмечено выраженное снижение концентрации свободной формы основного тиреоидного гормона - Т4 (4,33±0,29 пмоль/л против 10,48±0,69 пмоль/л в контроле, р ≤0,001). В то же время содержание общего Т3 несколько повышалось (2,61±0,19 нмоль/л при концентрации в контроле 2,30±0,14 нмоль/л), что можно считать компенсаторной реакцией, осуществляемой за счёт стимуляции щитовидной железы ТТГ, количество которого также повышалось (0,035±0,005 мкМЕ/мл при 0,022±0,003 мкМЕ/мл у интактных животных, р ≤0,05), а также активации периферического дейодирования Т4. Обнаруженные сдвиги не могут не сказаться на тиреоидзависимых звеньях метаболизма в тканях-мишенях тиреоидных гормонов. Исследование активности основных антиоксидантных ферментов в гомогенате печени крыс, получавших тиамазол, представлены в табл. 1. Наименьшим изменениям подверглась активность супероксиддисмутазы. В гомогенате печени животных, получавших тиамазол, активность данного фермента составляла 85,6% уровня активности аналогичного показателя у животных контрольной группы. Активность глутатионпероксидазы в печени гипотиреоидных животных составила 77,3% уровня интактных животных. Полученные результаты согласуются с данными других авторов, также обнаруживших снижение активности антиоксидантных ферментов при гипотиреозе [2]. Активность гемсодержащего фермента каталазы в использованной модели гипотиреоза снижалась значительно и статистически достоверно - до 40% уровня контроля (p ≤0,001). Возможно, столь существенное снижение активности каталазы обусловлено своеобразным двойным тиреоидным влиянием на концентрацию как апофермента, так и кофермента, поскольку индукцию δ-аминолевулинатсинтетазы, лимитирующей скорость биосинтеза гема, считают одним из специфических эффектов тиреоидных гормонов [8]. Закономерное следствие снижения активности антиоксидантных ферментов - активация процессов СРО, что подтверждается обнаруженным увеличением светосуммы хемилюминесценции гомогенатов печени крыс, получавших тиамазол. Так, если показатель светосуммы свечения у интактных крыс составил 14,90±0,63 у.е., то у крыс, получавших тиреостатик, - 26,48±0,99 у.е. (р ≤0,001). Использованная модель тиамазолового гипотиреоза сопровождалась снижением активности ферментов антиоксидантной защиты, что является ведущим фактором, приводящим к интенсификации процессов СРО при гипотиреозе. Избыточным образованием активных форм кислорода, в частности супероксидного аниона, вероятно, обусловлен высокий по сравнению с другими исследованными ферментами уровень активности супероксиддисмутазы. Показано, что существенное значение в регуляции активности этого фермента играет концентрация супероксидного аниона, активирующего и индуцирующего фермент [4]. Наряду с выявленными изменениями суммарной внутриклеточной активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в дальнейшем целесообразным представляется предпринять изучение реакции на гипотиреоз их цитоплазматических и митохондриальных изоферментов, поскольку они могут отличаться степенью тиреоидной чувствительности. Следующим этапом стало исследование эффективности йодированного полисахаридного комплекса в коррекции обнаруженных сдвигов. У животных четвёртой группы, которые после 3-недельного введения тиреостатика в течение 1 мес получали органоминеральный комплекс, концентрация ТТГ составила 0,006±0,001 мкМЕ/мл, свободного Т4 - 24,05±0,60 пмоль/л против 0,022±0,003 мкМЕ/мл и 10,48±0,69 пмоль/л соответственно в контроле (р ≤0,001), что свидетельствует о стимулирующем воздействии исследуемого соединения на функциональную активность щитовидной железы. Введение гипотиреоидным животным «йодбиополимера» способствовало также восстановлению активности антиокислительных ферментов. Так, в гомогенате печени крыс, прошедших после воспроизведения гипотиреоза месячный курс терапии йодосодержащим полисахаридным комплексом (четвёртая группа), активность супероксиддисмутазы почти достигала контрольных значений и составляла 95,5% активности интактных животных. Активность глутатионпероксидазы и каталазы даже несколько превышала контрольные значения, достигая соответственно 115,6% (р ≤0,05) и 112,7% уровня активности в контроле. В то же время у животных, находившихся на стандартном рационе (третья группа), через 1 мес после отмены тиамазола активность исследованных ферментов оставалась ниже контрольных значений, причём каталазы - значительно ниже (49,9% контроля, p ≤0,001). Методом хемилюминесцентного анализа было установлено корригирующее влияние «йодбиополимера» на функциональное состояние системы окислительного гомеостаза в печени. Светосумма хемилюминесценции у крыс четвёртой группы снижалась до 16,11±0,52 у.е. против 26,48±0,99 у.е. (вторая группа) (р ≤0,001). Аналогичный показатель у животных третьей группы составил 22,62±0,84 у.е. (р ≤0,01). ВЫВОДЫ 1. Использованная модель тиамазолового гипотиреоза (3-недельное введение тиреостатика в дозе 2,5 мг на 100 г массы тела) сопровождалась снижением в ткани печени крыс активности антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, а также особенно выраженным снижением активности гемсодержащего фермента каталазы. Обнаруженные сдвиги позволяют отнести ферменты антиоксидантной системы к тиреоидзависимым звеньям метаболизма. 2. Введение на фоне гипотиреоза йодосодержащего органоминерального комплекса способствует восстановлению активности антиоксидантных ферментов, нормализации скорости и интенсивности реакций СРО в щитовидной железе, что свидетельствует об эффективности исследуемого «йодбиополимера» в коррекции метаболических нарушений при гипотиреозе и указывает на целесообразность дальнейшего изучения его тиреотропных свойств. Таблица 1 Активность ферментов антиоксидантной системы печени крыс с экспериментальным гипотиреозом и после его коррекции йодосодержащим органоминеральным комплексом (М±m, n=12) Группа животных Активность ферментов Первая, контроль Вторая, экспериментальный гипотиреоз Третья, экспериментальный гипотиреоз + стандартная диета Четвёртая, экспериментальный гипотиреоз + «йодбиополимер» 22-е сутки от начала эксперимента 30-е сутки после воспроизведения гипотиреоза Супероксиддисмутаза, ЕД/мг белка; в % к контролю 21,73±1,16 - 18,60±2,23 85,6 19,43±2,56 89,4 20,75±1,22 95,5 (106,8)’ Глутатионпероксидаза, ЕД/мг белка; в % к контролю 655,33±53,59 - 506,28±61,48 77,3 545,68±39,55 83,3 757,84±51,72× 115,6 (138,9)’ Каталаза, мкмоль/г белка; в % к контролю 3150,62±78,55 - 1269,65±198,48** 40,3 1573,3±38,81** 49,9 3551,42±128,31* ×× 112,7 (135,7)’ Примечания: ‘в скобках указан процент от активности в третьей группе; хразличие с третьей группой статистически значимо (p ≤0,01); *различие с контролем статистически значимо (p ≤0,05); **различие с контролем статистически значимо (p ≤0,001); ××различие с третьей группой статистически значимо (p ≤0,001).

About the authors

F Kh Kamilov

Bashkir State Medical University, Ufa city

A N Mamtsev

Moscow State University of Technologies and Management named after K.G. Razumovsky

V N Kozlov

Moscow State University of Technologies and Management named after K.G. Razumovsky

G M Abdullina

Bashkir State Medical University, Ufa city

O V Lobyreva

Moscow State University of Technologies and Management named after K.G. Razumovsky

Email: bioritom@mail.ru

References

Supplementary files