Preparation, purification and common characteristics of anticoagulant peptide from peloid

Cover Page


Cite item

Abstract

Aim. To obtain the peloid extract containing peptide anticoagulant, to separate it from co-extracted compounds, to confirm the chemical structure of the purified anticoagulant, to characterize the amino acid profile and to evaluate its effect on blood clotting activity in vitro and the effect on hemostasis in laboratory animals. Methods. The anticoagulant was derived from lake Taraskul (Tyumen region) peloid. The effector was prepared and purified by original method including extraction, sedimentation of humic acids by salting-out, and removal of fulvic acids and low molecular weight fractions of humic acids by ion exchange chromatography. Purity and homogeneity of gained anticoagulant was evaluated by high performance liquid chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis. The chemical composition of the active substance was determined by acid hydrolysis and identification of phenylthiohydantoin amino acid derivatives by reversed-phase high performance liquid chromatography. Specific anticoagulant activity was evaluated by substance’s influence on effect of thrombin-dependent conversion of fibrinogen to fibrin and serum thrombin clotting time after being administered to laboratory animals. Results. Peptide anticoagulant was isolated of the peloid and purified. Its activity is realized at the stage of thrombin and fibrinogen interaction. The substance prolongs the fibrin clotting time both in a model test system and when administered intravenously to rats. The anticoagulant effect of the peptide when administered to animals lasts at least 60 min, and no significant toxic effects appear. Conclusion. An isolated active substance might be a basis for the drug development of anticoagulants.

Full Text

Выбор современных лекарственных средств с антикоагулянтной активностью достаточно широк [5], однако поиск соединений, способных угнетать гемокоагуляцию, если судить по количеству публикаций, не прекращается [9]. Интерес к противосвёртывающим средствам обусловлен как высокой частотой развития тромбозов, так и осложнениями, сопровождающими применение известных антикоагулянтов [6]. При этом, судя по литературным источникам, практически не рассматривают возможность целенаправленного воздействия на образование фибрин-мономеров (за исключением ингибиторов тромбина) и самосборку фибрина, хотя доказано существование эндогенных ингибиторов этого процесса [1] и природных агентов, способных стать фармакологическими средствами для такой регуляции. Так, установлено, что в ряде растений содержатся антикоагулянты прямого действия, представляющие собой гликопептиды, механизм действия которых отличен от известных антикоагулянтов, но имеет сходство с механизмом ограничения плазмокоагуляции пептидами, выделенными из плазмы крови человека и животных. Их эффект реализуется на уровне заключительной фазы свёртывания - превращения фибриногена в фибрин, преимущественно на ранних этапах образования олиго- и полимеров. По литературным данным [3], растительные гликопептиды действуют достаточно продолжительно (до 24 ч после однократной инъекции), не вызывают «рикошетной» гиперкоагулемии и не обладают токсическим действием. Также показано, что сходные по природе и механизму действия эффекторы могут быть выделены из сапропеля [7]. Главная проблема, препятствующая дальнейшему изучению пептидных антикоагулянтов из сапропеля, - недостаточная очистка действующего вещества от сопутствующих соединений, соэкстрагируемых из сырья. Основной такой примесью являются гуминовые кислоты - крайне гетерогенное как по молекулярным массам, так и по представленному набору функциональных групп семейство органических веществ. Учитывая, что пептидные ингибиторы свёртывания крови, выделенные из растительных источников, оказались достаточно устойчивыми соединениями, не демонстрирующими выраженного токсического действия и проявляющими устойчивый дозозависимый эффект, представляется важным на максимально возможном уровне очистить антикоагулянт, уточнить его химическую природу и воздействие на свёртывание крови, поскольку вероятность получения пептидного эффектора из сапропеля как новой фармакологической субстанции высока. Материалом для исследования послужил сапропель озера Большой Тараскуль, расположенного в Тюменской области, антикоагулянт из которого получали по ранее разработанному методу [4], усовершенствованному нами. Оценку чистоты полученного антикоагулянта проводили с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на модульном хроматографе «Gilson» (Франция), используя в качестве детектора спектрофотометр с проточной кюветой «Gilson-119» (UV/vis, рабочая длина волны 210 и 254 нм). Электрофорез в полиакриламидном геле выполняли в варианте диск-фореза с использованием комплекта оборудования производства «Реанал» (Венгрия), с последующей окраской кумасси голубым (Coomassie Brilliant Blue R-250). Антикоагулянтную активность выделенного пептида оценивали по удлинению тромбинового времени в модельных пробирочных тестах и при внутривенном введении нелинейным белым крысам. После удаления соэкстрагируемых из сапропеля гуминовых веществ и очистки предполагаемого эффектора оценивали его гомогенность с использованием ВЭЖХ на колонке «ReproSil С-18». В качестве элюента использовали ацетатный буфер с рН=5,0, содержащий 30% ацетонитрила в присутствии 1% дихлорэтана, скорость протока 1 мл/мин, детектирование при длине волны 210 нм. Очищенная фракция элюировалась с колонки одним пиком, что позволяет говорить о достаточной чистоте полученного эффектора (рис. 1). Дополнительно провели электрофорез полученной фракции экстракта в полиакриламидном геле (градиент концентрации геля 5-25%) в присутствии додецил-сульфата натрия. После окраски геля кумасси голубым визуализировалась единственная окрашенная зона, что подтверждает как чистоту полученного эффектора, так и его химическую природу, поскольку использованный краситель специфичен для веществ белково-пептидной природы. На этом этапе тестировали полученное соединение на наличие антикоагулянтной активности, используя модельную тест-систему (раствор фибриногена в трис-HCl буфере с рН=7,4 и раствор коммерческого тромбина). По полученным данным рассчитывали эффективность торможения по формуле i=1-(tk/to), где tk и to - время затраченное на образование сгустка фибрина в контрольной и опытной пробах соответственно. Очищенная фракция экстракта выраженно и дозозависимо удлиняла время образования фибринового сгустка (рис. 2), что позволяет утверждать, что выделен и очищен эффектор свёртывания крови, являющийся целевым соединением. Исходя из полученных данных, для уточнения природы эффектора провели его кислотный гидролиз (6Н хлористоводородная кислота при 110 °C, 24 ч) [2] с последующим разделением продуктов распада тонкослойной хроматографией, окрашивая хроматограмму нингидрином. В результате гидролиза полученный эффектор распадается на ряд нингидрин-положительных соединений со значениями удерживания, близкими к аминокислотам (рис. 3). Для идентификации аминокислотных остатков получали их фенилтиогидантоиновые производные, обрабатывая гидролизат антикоагулянта смесью фенилизотиоцианата, воды, этанола и триэтиламина (1:1:7:1), с последующим разделением продуктов дериватизации с помощью ВЭЖХ (элюент А - СН3ОН, элюент В - 12 мМ натрий-фосфатный буфер, рН=5,5, градиент от 10 до 50% А в течение 30 мин, скорость протока 1 мл/мин, температура 40 °C) [8]. В продуктах гидролиза по времени удержания идентифицируются аспарагиновая и глутаминовая кислоты, глицин, тирозин и лейцин. Для оценки антикоагулянтного действия полученного эффектора при введении лабораторным животным растворяли антикоагулянт в изотоническом растворе натрия хлорида с концентрацией эффектора 10 мг/мл. Тестирование проводили на двух группах самцов нелинейных белых крыс с массой тела 176±9 г. В экспериментальных группах (две группы по 10 животных) крысам, находящимся под наркозом, вводили раствор антикоагулянта в яремную вену из расчёта 5 мг на 100 г массы тела. В контрольных группах (две группы по 7 животных) вводили изотонический раствор натрия хлорида. Через 5 или 60 мин после введения отбирали 4 мл крови, стабилизировали её цитратом натрия и получали бестромбоцитную плазму, в которой определяли тромбиновое время (табл. 1). Все животные контрольных и экспериментальных групп после выхода из наркоза идентично восстановили пищевое поведение, физическую активность и поведенческие стереотипы. ВЫВОДЫ 1. Из сапропеля выделен и очищен от примесей антикоагулянт, специфично угнетающий заключительный этап свёртывания крови. По химической природе выделенный и очищенный эффектор является пептидом. 2. Как в модельных пробирочных тестах, так и при введении животным выделенный пептид тормозит тромбиновое время плазмы крови, а его эффект сохраняется не менее 60 мин. 3. Введение антикоагулянта не приводит к гибели животных или явным нарушениям их физического состояния, что свидетельствует об отсутствии острого токсического действия. 4. Выделенный пептидный антикоагулянт из сапропеля можно рассматривать как основу для разработки фармакологического средства коррекции гемостаза. Рис. 1. Профиль элюции антикоагулянта из сапропеля. Условия разделения в тексте. Внесённый на колонку очищенный экстракт сапропеля элюируется одним пиком, что соответствует единственному пептидному соединению !Рисунок1.jpg Рис. 2. Зависимость эффективности торможения взаимодействия тромбина с фибриногеном в модельной системе от концентрации антикоагулянта из сапропеля. Абсцисса - концентрация эффектора, ордината - эффективность торможения (способ расчёта и описание модельной системы приведены в тексте) Рис. 3 Тонкослойная хроматография стандартной смеси аминокислот (1) и гидролизата антикоагулянта из сапропеля (2). Пластинки «Silufol», хроматографическая система - н-бутанол:уксусная кислота:вода (4:1:5). Окрашенные компоненты гидролизата имеют значения удерживания, близкие к аминокислотам !Рисунок3.jpg Калинин2.jpg Таблица 1 Изменения тромбинового времени плазмы крови крыс на фоне антикоагулянта из сапропеля через 5 мин (ТВ 5) и 60 мин (ТВ 60) после введения Тест Контроль, с Опыт, с Эффективность торможения ТВ 5 9,05±0,25 14,55±2,4 0,378 ТВ 60 9,12±0,26 10,33±0,64 0,117
×

About the authors

E P Kalinin

Tyumen State Medical University, Tyumen, Russia

Email: kalinin@tyumsma.ru

D I Boyarintsev

Tyumen State Medical University, Tyumen, Russia

S L Galyan

Tyumen State Medical University, Tyumen, Russia

References

  1. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., Умутбаева М.К. О возможной роли ингибитора самосборки фибрина в регуляции свёртывания крови // Гематол. и трансфузиол. - 1985. - Т. 30, №1. - С. 35-38.
  2. Дарбре А. Практическая химия белка / Под ред. А. Дарбре. - М.: Мир, 1989. - 621 с.
  3. Дементьева И.А. Защитное действие недиализующейся фракции экстракта медуницы при угрозе тромбоза / В кн.: Обмен веществ в норме и патологии. / Под ред. А.Ш. Бышевского. - Тюмень: ТюмГМИ, 1992. - С. 30.
  4. Калинин Е.П., Русакова О.А., Чирятьев Е.А. Способ получения антикоагулянта из сапропеля. Патент на изобретение №RUS2175552 от 16.03.2000.
  5. Государственный реестр лекарственных средств. - http://www.grls.rosminzdrav.ru (дата обращения: 30.08.2015).
  6. Суханова Г.А., Меликян А.Л., Вахрушева М.В. и др. Варфариновый некроз кожи у пациента с дефицитом протеина С // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2014. - №1. - С. 75-82.
  7. Чирятьев Е.А., Бышевский А.Ш., Яковлева Н.В., Платонов Е.В. Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью Патент на изобретение №RUS2101023 от 10.01.1998.
  8. Dimova N. RP-HPLC analysis of amino acids with UV-detection // Compter rendus l’Academie bulgare des Sciences. - 2003. - Vol. 56, N 12. - P. 75-78.
  9. Ellis G., Camm A.J., Datta S.N. Novel anticoagulants and antiplatelet agents; a guide for the urologist // BJU International. - 2015, Mar 23. - doi: 10.1111/bju.13131.

© 2015 Kalinin E.P., Boyarintsev D.I., Galyan S.L.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.





This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies