Features of hemostatic activity of 2-[3-methyl-1-h-propyl-7-(1,1-dioxothiethanyl-3) xantinyl-8-thio] acetic acid cyclohexilammonium salt

Full Text

Из всех критических состояний, возникающих в практической медицине, наиболее грозными и опасными остаются кровотечения [9]. Последствия кровотечения - геморрагический шок, синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания, синдром массивной гемотрансфузии, ишемия жизненно важных органов и другие - либо бывают фатальными, либо значительно осложняют течение и исход основного заболевания. Одно из направлений поиска новых методов профилактики кровотечения - разработка средств фармакологической коррекции системы гемостаза. Препараты для остановки кровотечений, традиционно применяемые в медицинской практике, недостаточно эффективны и не способны привести к действенному снижению кровопотери [5, 7, 8]. Результаты предыдущих собственных исследований демонстрируют потенциально высокую активность некоторых новых производных ксантина в отношении системы гемостаза в условиях in vitro [1]. Данное исследование посвящено дальнейшему изучению системной гемостатической активности циклогексиламмониевой соли 2-[3-метил-1-н-пропил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио] уксусной кислоты в условиях эксперимента [2]. Вся исследовательская работа, согласно [3], проведена в два этапа: - изучение фармакологической активности циклогексиламмониевой соли 2-[3-метил-1-н-пропил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио] уксусной кислоты (соединение I) в условиях in vitro; - определение эффективности соединения I в контролируемых (модельных) условиях эксперимента in vivo при внутрибрюшинном введении крысам. Экспериментальная работа в условиях in vitro выполнена на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. К исследованию не допускали кровь добровольцев с тяжёлой соматической, онкологической патологией, эндокринными, острыми и хроническими инфекционными заболеваниями, курящих, употреблявших накануне исследования алкоголь и лекарственные препараты (в том числе антибиотики, антиагреганты, антикоагулянты и др.). Забор крови проводили из кубитальной вены с использованием систем вакуумного забора крови «BD Vacutainer®» (Dickinson and Company, США). В качестве стабилизатора венозной крови использовали 3,8% раствор натрия цитрата в соотношении 9:1. Исследование влияния на систему гемостаза в условиях in vivo проводили при внутрибрюшинном введении крысам данных веществ в эквимолярной концентрации, которая для этамзилата составляла 38,1 мг/кг, для соединения I - 72,1 мг/кг. Между инъекцией исследуемого вещества и забором крови проходил 1 ч. Животных наркотизировали диэтиловым эфиром и фиксировали на препаровальном столике, далее проводили забор крови из яремной вены в пробирки с 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 9:1. Все тесты проводились на обогащённой и обеднённой тромбоцитами плазме. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 100g в течение 10 мин, бестромбоцитарной плазмы - при 300g в течение 15 мин. В работе использовали центрифугу ОПН-3.02 (Россия). Исследование влияния соединения I и этамзилата на функциональную активность тромбоцитов как in vitro, так и in vivo проводили с помощью лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «Биола 230 LA» (Россия). Интенсивность агрегации оценивали по динамике изменения светопропускания плазмы при добавлении к ней индукторов агрегации по методу G. Born [4] и по динамике изменения размеров образующихся агрегатов [6]. В качестве индуктора агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 20 мкг/мл и коллаген в концентрации 5 мг/мл производства «Технология-Стандарт» (Россия). Анализ агрегатограмм проводили с использованием программного обеспечения AGGR с учётом следующих показателей: общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая; полная, неполная обратимая, необратимая), значение максимальной агрегации и максимальной скорости агрегации (tg α), средний размер тромбоцитарных агрегатов в относительных единицах. Экспериментальную оценку специфической системной гемостатической активности in vivo осуществляли на половозрелых крысах-самцах массой от 190 до 220 г. Препараты вводили внутрибрюшинно за 1 ч до моделирования паренхиматозного кровотечения. Затем под эфирным наркозом проводили срединную лапаротомию, выводили в рану переднюю поверхность печени. С использованием специального ограничителя проводили резекцию печени (для получения одинаковых объёма, формы и размеров). Образовавшаяся рана представляла собой эллипс площадью 2,5 см2, её глубина составляла 0,3 см. Раневую поверхность плотно осушали марлевой салфеткой до наступления окончательного гемостаза. Во время вмешательства отмечали время остановки кровотечения и объём кровопотери. Величину кровопотери определяли гравиметрическим методом (взвешивание пропитанного кровью марлевого материала на электронных весах) и рассчитывали по А.С. Либову [3]. Экспериментальные исследования с участием лабораторных животных проводили согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в Российской Федерации (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96, ГОСТР 50258-92) и приказу Минздравсоцразвития России №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP - от англ. Good Laboratory Practice). Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета «Statistica 10,0» (StatSoft Inc, США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для описания групп использованы медиана и межквартильный интервал. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05. Результаты исследования проагрегантной активности в условиях in vitro представлены в табл. 1. В результате экспериментальной работы установлено, что введение 2×10-3 моль/л соединения I в кювету агрегометра за 5 мин до индукторов приводит к усилению агрегации тромбоцитов в среднем на 8,5%, что в 2 раза превышает показатели этамзилата. При изучении зависимости «доза-эффект» установлено, что при концентрации 5×10-4 моль/л соединения I агрегация тромбоцитов усиливалась в среднем на 2,3%. В данной концентрации проагрегантная активность этамзилата не регистрируется. Следует отметить, что предварительная инкубация препарата сравнения (этамзилата) индуцировала спонтанную агрегацию тромбоцитов. Данный эффект отсутствовал при исследовании соединения I. При определении проагрегантной активности при внутрибрюшинном введении этамзилата и соединения I установлено, что полученные результаты в условиях in vivo по спектру проагрегантной активности полностью соотносятся с данными, полученными на этапе in vitro (табл. 2). Максимальная агрегация тромбоцитов на обоих индукторах в присутствии соединения I превышала показатели этамзилата в среднем на 11,8%. Значительно изменялась скорость агрегации тромбоцитов в присутствии соединения I - увеличивалась на 27,6% относительно контроля и на 25,4% в сравнении с этамзилатом. Следует отметить, что средний радиус тромбоцитарных агрегатов в присутствии соединения I превышал контроль в среднем на 35%, группу этамзилата - на 25%. Таким образом, по всем показателям, измеряемым анализатором агрегации тромбоцитов, соединение I статистически значимо превосходило препарат сравнения (этамзилат). Результаты исследования системной гемостатической активности на модели паренхиматозного кровотечения у крыс представлены в табл. 3. Этамзилат при внутрибрюшинном введении крысам в сравнении с контрольной группой достаточно эффективно снижал время остановки кровотечения, не оказывая существенного влияния на общий объём кровопотери. Соединение I проявляло выраженную гемостатическую активность, превышающую показатели контрольной группы и группы этамзилата. Таким образом, соединение I проявляет исключительно проагрегантную активность в условиях как in vitro, так и in vivo, превышающую показатели препарата сравнения (этамзилата). При этом спонтанная агрегация тромбоцитов в присутствии этамзилата достигала в среднем 22,1% относительно контроля, а индуктор-индуцированная агрегация независимо от вида индуктора увеличивалась не более чем на 5% относительно контроля. Это позволяет сделать вывод, что в момент индуцированной агрегации соединение I оказывает более избирательное действие на активированные тромбоциты в отличие от препарата сравнения, основной эффект которого приходится на интактные тромбоциты, тем самым потенциально повышая риск тромбообразования, с одной стороны, и оставаясь неэффективным в момент кровотечения, с другой [5, 7, 8]. Результаты исследования гемостатической активности этамзилата и соединения I с применением модели паренхиматозного кровотечения подтверждают эти данные: этамзилат статистически значимо укорачивает время кровотечения, не оказывая влияния на объём кровопотери. Соединение I выигрышно снижает оба определяемых показателя, демонстрируя выраженный системный гемостатический эффект. ВЫВОД Результаты проведённых исследований раскрывают потенциально высокую системную гемостатическую активность циклогексиламмониевой соли 2-[3-метил-1-н-пропил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8-тио] уксусной кислоты и убеждают в необходимости дальнейшего изучения данного соединения и его аналогов для создания на их основе высокоэффективных селективных корректоров системы гемостаза. Таблица 1 Показатели аденозиндифосфат(АДФ)-индуцированной и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов под действием этамзилата и соединения I в условиях in vitro Шифр Концентрация, моль/л Спонтанная агрегация тромбоцитов, % к контролю Усиление АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, % к контролю Усиление коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов, % к контролю Этамзилат 2×10-3 22,1 (20,7-25,2) 3,7 (1,5-5,9) 4,3 (2,2-6,9) 10-3 10,2 (7,4-13,5) 4,2 (2,1-6,3) 5,3 (3,1-8,6) 0,5×10-3 2,9 (1,2-5,7) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) Соединение I 2×10-3 0,0 (0,0-0,0) 8,5 (6,7-10,5) 9,7 (7,4-11,5) p=0,00058 p=0,006 p=0,0045 10-3 0,0 (0,0-0,0) 5,1 (3,4-7,3) 7,1 (5,2-10,3) p=0,0064 p=0,013 p=0,0034 0,5×10-3 0,0 (0,0-0,0) 2,3 (1,4-3,7) 4,2 (2,9-6,3) p=0,001 p=0,00002 p=0,0001 Примечание: представлены медиана и межквартильный интервал (n=7); p - уровень статистической значимости различий признаков групп этамзилата и соединения I. Таблица 2 Показатели аденозиндифосфат(АДФ)-индуцированной и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов при внутрибрюшинном введении этамзилата и соединения I Показатель Контроль Этамзилат Соединение I p2 Коллаген, мм 55,9 (53,8-58,1) 67,9 (64,2-69,3) p1=0,0003 75,9 (75,3-76,4) p1=0,00007 0,0002 СРТА (коллаген), о.е. 6,5 (6,2-6,7) 9,1 (7,8-11,4) p1=0,0012 11,6 (11,1-11,9) p1=0,0005 0,2 tg α (колаген), с 36,5 (34,3-38,2) 37,2 (35,7-38,6) p1=0,02 46,6 (45,4-47,3) p1=0,00034 0,0048 АДФ, мм 54,1 (50,6-57,4) 67,1 (64,9-68,6) p1=0,00081 77,5 (76,7-79,4) p1=0,00017 0,0037 СРТА (АДФ), о.е. 6,3 (6,2-7,1) 7,6 (7,2-8,3) p1=0,0002 8,8 (8,5-9,0) p1=0,00075 0,1 tg α (АДФ), с 42,7 (40,2-44,9) 46,4 (45,9-47,1) p1=0,001 54,8 (53,1-55,9) p1=0,0008 0,0061 Примечание: представлены медиана и межквартильный интервал (n=7); СРТА - средний размер тромбоцитарных агрегатов в относительных единицах (о.е.); tg α - максимальная скорость агрегации; p1 - уровень статистической значимости различий признаков в сравнении с контрольной группой; p2 - уровень статистической значимости различий признаков групп, получавших этамзилат и соединение I. Таблица 3 Показатели гемостатической активности этамзилата и соединения I при внутрибрюшинном введении крысам Препарат Контроль Этамзилат Соединение I Время кровотечения, с 97,9 (91,2-99,1) 71,9 (70,6-73,4) p1=0,0016 64,2 (62,7-65,4) p1=0,000073 p2=0,0104 Разница в массе салфеток, г 7,6 (7,4-8,1) 6,9 (5,5-7,1) p1=0,23 4,1 (3,8-4,3) p1=0,00002 p2=0,0001 Примечание: представлены медиана и межквартильный интервал (n=7); p1 - уровень статистической значимости различий признаков в сравнении с контрольной группой; p2 - уровень статистической значимости различий признаков групп, получавших этамзилат и соединение I.

About the authors

F Kh Kamilov

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

G A Timirkhanova

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

A I Samorodova

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

Email: avsamorodov@gmail.com

F A Khaliullin

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

R A Gubaeva

Bashkir State Medical University, Ufa, Russia

References

Supplementary files