Protein oxidative modification and cathepsin H activity in rats’ thymocytes at nitrogen oxide (II) synthesis modulation in vitro

Full Text

В настоящее время в качестве маркёра окислительного повреждения рекомендовано использование количественной оценки уровня карбонильных производных белков. Данный показатель позволяет одновременно оценить повреждение аминокислотных остатков свободными радикалами кислорода и/или азота, а также продуктами перекисного окисления липидов [12]. Повреждённые вследствие окисления белки способны формировать устойчивые к протеолизу токсичные агрегаты, что может приводить к апоптозу или некрозу клетки [3]. Также существует мнение, что окисленные формы белков более чувствительны к действию протеаз, чем их нативные аналоги [8]. Модифицированные белки, разрушенные протеасомами или протеазами до пептидов и/или аминокислот, могут стать источником синтеза новых необходимых клетке протеинов [7]. Именно поэтому окисление протеинов является неотъемлемой составляющей обмена белков в организме при участии тканевых протеиназ. Важно отметить, что лизосомальные протеиназы тесно связаны с формированием иммунного ответа [6], в регуляции которого также принимает участие оксид азота [13]. В свете этого актуальным представляется изучение прямого воздействия стимуляторов и ингибиторов синтеза оксида азота на цистеиновый протеолиз и окислительную модификацию белков иммунокомпетентных клеток. Целью данного исследования стало изучение in vitro влияния субстрата синтеза оксида азота (L-аргинина) и неселективного ингибитора NO-синтазы (N-нитро-L-аргинин-метилового эфира) на окислительную модификацию белков в сочетании с оценкой изменений активности катепсина Н тимоцитов. Исследование проводили на конвенциональных половозрелых крысах-самцах линии Wistar с массой тела 280-320 г. Содержание и выведение животных из эксперимента выполняли в соответствии с правилами, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Для получения клеточного биологического материала животных вводили в глубокий наркоз, производили обескровливание и стерильно извлекали вилочковую железу, погружали в охлаждённую среду RPMI 1640 и освобождали от крови, жира и соединительной ткани. Очищенную ткань помещали в стеклянный гомогенизатор (150×25 мм), содержащий среду RPMI 1640 в соотношении 1:10, и измельчали, вращая пестик вручную. Полученную взвесь клеток переносили в центрифужную пробирку и оставляли для оседания клеточных агрегатов на ледяной бане в течение 1 ч. После этого отбирали шприцем одиночные клетки и осаждали тимоциты центрифугированием в течение 10 мин при 600 g (центрифуга CM-6M ELMI, Латвия). Клеточный осадок ресуспендировали при комнатной температуре в 5 мл полной питательной среды. Тимоциты инкубировали in vitro в полной питательной среде, содержащей 5 мМ N-нитро-L-аргинин-метиловый эфир (L-NAME, «Sigma», США), n=8, или 5 мМ L-аргинин («Sigma», США) 24 ч при температуре 37 °C, n=8. Контрольная группа представляла собой тимоциты, инкубированные в тех же условиях в полной питательной среде (n=8) 24 ч. Состав полной питательной среды: среда RPMI 1640, содержащая 2 мМ L-Gln, по 2 мг/мл стрептомицина и пенициллина, а также 5 мМ L-аргинин или 5 мМ L-NAME в зависимости от экспериментальной модели. После инкубации полученные клетки осаждали при 600 g (центрифуга CM-6M ELMI, Латвия) и ресуспендировали в 0,25 М растворе сахарозы. В полученный материал добавляли Тритон Х-100 в конечной концентрации 0,1%, и отбирали аликвоты для определения общей активности катепсина Н и окислительной модификации белков. Активность катепсина Н определяли через количественное измерение 7-амидо-4-метилкумарина (АМС), высвобождающегося в результате энзиматического гидролиза пептидной связи Arg-7-amido-4-methylcoumarin («Sigma», США) [5]. Количество свободного АМС регистрировали на спектрофлуориметре «System 3 Scanning Spectrofluorometr» («Optical technology devices», inc. Elmstord, New York, 10523) при длинах волн возбуждения (λex) 360 нм и эмиссии (λem) 440 нм. Активность фермента выражали в нмоль АМС/с×г белка. Содержание белка определяли по методу Лоури с использованием коммерческого набора НПЦ «Эко-сервис» (Санкт-Петербург). Окислительную модификацию белков оценивали по методу R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [1] после осаждения нуклеиновых кислот 10% раствором стрептомицина сульфата. Карбонильные производные окисленных белков регистрировали на спектрофотометре (СФ 2000, Санкт-Петербург) при следующих длинах волн: 254, 270, 280, 356 нм (альдегид-динитрофенилгидразоны нейтрального характера), 363 и 370 нм (кетон-динитрофенилгидразоны нейтрального характера), 428 и 520 нм (альдегид-динитрофенилгидразоны основного характера) и 430, 434 и 520, 535 нм (кетон-динитрофенилгидразоны основного характера) [1]. По полученным значениям экстинкций строили спектр поглощения продуктов окислительной модификации белков и подсчитывали значения площадей под кривой для различных его компонентов, а также суммарную площадь [заявка на патент №2013 102618 (003624) от 21.01.2013; решение о выдаче патента от 05.05.2014], выражая полученные данные в условных единицах на грамм белка (у.е./г белка). Содержание метаболитов оксида азота определяли спектрофотометрически в видимой области спектра по реакции с реактивом Грисса [2] с регистрацией на микропланшетном анализаторе StatFax 3200 («Awareness Technology», США) при длине волны 540 нм и выражали в мкМ/106 клеток. Статистический анализ результатов исследования проведён с использованием программ «Microsoft Office Excel 2010» и «Statistica 10.0». Для каждой выборки вычисляли медиану, минимальное и максимальное значения, результаты представляли в формате Ме [min; max]. Поскольку отмечалось отсутствие согласия данных с нормальным распределением (W-критерий), для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U-тест). Как показывают результаты выполненных исследований, концентрация метаболитов оксида азота тимоцитов крыс после инкубации в среде с 5 мМ L-NAME снижалась и составила 15,4 [12, 7; 17, 3] мкМ/106 клеток, что статистически значимо ниже контрольного значения 24,9 [20, 4; 32, 7] мкМ/106 клеток (р=0,03). В условиях in vitro-моделирования дефицита синтеза оксида азота зарегистрировано увеличение количества карбонильных производных белков за счёт повышения уровня альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера (рис. 1). Известно, что существует несколько путей образования карбонильных производных белков, один из которых - прямое воздействие активных форм кислорода и/или азота на аминокислотные остатки боковых цепей [12]. Генерация активных форм кислорода в условиях угнетения синтеза оксида азота (II) может происходить за счёт подавления антиоксидантной системы, а именно каталазы и α-токоферола [9]. Следует отметить, что подавление активности каталазы приводит к токсическому эффекту из-за возможного накопления водорода пероксида (перекиси водорода) в клетках. Кроме того, не обезвреженный Н2О2 при наличии металлов переменной валентности способен участвовать в неферментативном окислении белков, имеющих металл-связывающую поверхность, что приведёт к формированию карбонильных производных белков [3]. Важно отметить, что, помимо вышеуказанного прямого повреждения аминокислотных остатков в условиях дефицита синтеза оксида азота, возможно, возрастает содержание продуктов перекисного окисления липидов [9], что влечёт за собой формирование карбонильных производных за счёт взаимодействия малонового диальдегида и 4-гидрокси-2-ноненаля со свободными аминокислотами и их остатками в составе белков [3]. Протеолитические системы способны удалять повреждённые белки, именно поэтому их рассматривают как вторичные антиоксидантные системы [7]. Изучение активности протеаз в условиях окислительного стресса важно для понимания процесса обновления белков. В условиях экспериментальной модели дефицита синтеза оксида азота общая активность катепсина Н статистически значимо возросла: для контрольной группы составила 25,9 [18, 2; 28, 5] нмоль АМС/с×г белка, а для экспериментальной группы - 30,5 [26, 1; 35, 2] нмоль АМС/с×г белка (р=0,022). Активация лизосомальной протеазы на фоне увеличения содержания карбонильных производных белков предположительно свидетельствует об участии катепсина Н в деградации окислительно-модифицированных белков. Концентрация метаболитов оксида азота тимоцитов крыс после инкубации в среде с 5 мМ L-аргинином составила 40,0 [35, 1; 42, 1] мкМ/106 клеток, что статистически значимо выше контрольного значения 24,9 [20, 4; 32, 7] мкМ/106 клеток (р=0,01). В условиях моделирования дополнительного синтеза оксида азота в тимоцитах окислительная модификация белков снижалась преимущественно за счёт уменьшения вклада производных нейтральных аминокислотных остатков (рис. 2). Полученные данные укладываются в представления о роли оксида азота и его метаболитов как антиоксидантных агентов [11]. В частности, особое место среди метаболитов занимают динитрозильные комплексы железа, необходимые для транспорта и депонирования NO [4], в результате чего снижается вероятность образования карбонильных производных белков по металл-зависимому механизму. Хотя известно, что NO в результате взаимодействия с супероксид-анион радикалом может образовывать пероксонитрит (ОNОО-) - сильный окислитель, были описаны пути его детоксикации через эндогенные антиоксидантные механизмы [10]. Активность катепсина Н в условиях моделирования дополнительного синтеза оксида азота в экспериментальной группе (25,6 [19, 0; 27, 5] нмоль АМС/с×г белка) статистически значимо не отличалась от значений контрольной группы (25,9 [18, 2; 28, 5] нмоль АМС/с×г белка). Полученный результат может быть обусловлен отсутствием функциональной потребности в дополнительном протеолизе на фоне уменьшения окислительного повреждения белков и прямого подавления L-аргинином лизосомального цистеинового протеолиза. ВЫВОДЫ 1. В условиях in vitro ингибирование синтеза оксида азота в тимоцитах вызывает увеличение степени окислительной модификации белков за счёт формирования альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера, сопровождаемое активацией катепсина Н. 2. В условиях in vitro воздействия субстрата синтеза оксида азота L-аргинина на тимоциты происходит снижение уровня карбонильных производных белков за счёт альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера без изменения активности катепсина Н. Рис. 1. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков и их компонентов в тимоцитах при in vitro воздействии 5 мМ N-нитро-L-аргинин-метилового эфира; *статистически значимые различия с контролем (р ≤0,05). Абаленихиной Ю.В_1.tif Рис. 2. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков и их компонентов в тимоцитах при in vitro воздействии 5 мМ L-аргинина; *статистически значимые различия с контролем (р ≤0,05).

About the authors

Yu V Abalenikhina

Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia

Email: abalenihina88@mail.ru

M A Fomina

Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia

References

Supplementary files