Comparative study of different models of alloxan-induced diabetes mellitus

Full Text

Сахарный диабет (СД) - хроническое заболевание, характеризирующееся относительной или абсолютной недостаточностью инсулина, в результате которой происходят метаболические нарушения, являющиеся основной причиной поздних осложнений СД [11]. Ранняя инвалидизация и высокая смертность среди больных СД сделали лечение этого заболевания одним из приоритетов национальных систем здравоохранения [1]. В свете этого поиск новых методов лечения и изыскание препаратов, удобных в применении и обладающих незначительными побочными действиями, на сегодняшний день остаётся актуальной проблемой медицинской науки [7]. Для проведения подобных исследований в области диабетологии используют различные модели СД, одной из которых является аллоксановая модель [9]. Аллоксановая модель наиболее изучена, её широко применяют в экспериментальных исследованиях [5]. Один из основных её недостатков - высокая летальность животных при моделировании. По этой причине для минимизации летальности животных мы сочли целесообразным модифицировать классическую методику аллоксанового СД и изучить в сравнительном аспекте течение патологического процесса. Для моделирования СД использованы половозрелые беспородные белые крысы с массой тела 280-350 г. Животные были распределены в две группы: первая группа состояла из 25 крыс, которым однократно внутрибрюшинно вводили 200 мг/кг аллоксана (классическая модель) [5], вторая группа (модифицированная методика) - из 25 крыс, которые в 1-й день получали 150 мг/кг, во 2-й день - 100 мг/кг, через день - дополнительно ещё 100 мг/кг аллоксана. В качестве контроля исследовали по 25 интактных крыс. Выбор нами внутрибрюшинного способа введения аллоксана основывался на лёгкости выполнения процедуры и малой травматичности для животных. При моделировании также учитывали, что диабетогенное действие аллоксана более активно проявляется у животных, находящихся на предварительной голодной диете [5], поэтому все животные в течение 24 ч до начала моделирования не получали пищу, но при этом доступ к воде оставался неограниченным. Для установления диабетического статуса по ходу эксперимента осуществляли контроль концентрации глюкозы в крови, взятой из хвостового надреза крыс, при помощи тест-анализатора «FreeStyle» фирмы «Abbott» и индикаторной бумаги «IME-DC». Состояние животных оценивали визуально, фиксировали летальность в группах, изменение массы тела животных, потребление корма и воды. Поведенческую активность оценивали частотой груминга. На 10-й и 21-й дни животных декапитировали, кровь и органы забирали для лабораторных исследований. Содержание глюкозы, триглицеридов, липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), липопротеинов высокой плотности (ЛПВН), холестерина, свободных жирных кислот (СЖК) в крови определяли ферментативным колориметрическим методом при использовании набора химических реактивов производства «Human» (Германия) на анализаторе ФП-901. Концентрацию в крови инсулина и С-пептида определяли иммуноферментным методом на анализаторе «Chemwell», используя стандартный набор реактивов «DEMENITECKILL-WELLSEE» (Германия). Выраженность окислительного стресса определяли по концентрации диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови и тканях печени, сердца, почек, поджелудочной железы фотоколориметрическим методом по окрашенным продуктам тиобарбитуровой кислоты [10]. Статистическую обработку полученных цифровых данных и выявление их статистической значимости проводили параметрическим методом по коэффициенту t Фишера-Стьюдента [4] и непараметрическими критериями U (Уилкоксона-Манна-Уитни) и Q (Розенбаума) [2]. Статистическую достоверность летальности в группах определяли точным методом Фишера для четырёхпольной таблицы [2]. В первой группе, начиная со 2-х суток после введения аллоксана, животные с особо острыми проявлениями интоксикации начинали погибать. Основное количество летальных исходов пришлось на период от 3 до 7 дней. На 3-й день умерли 5 (20%) животных, на 4-й день - 8 (32%), на 5-й день - 2 (8%), на 7-й день - 2 (8%) крысы. Всего умерли 17 крыс, что составило 68%. В конце 1-й недели клинический осмотр оставшихся в живых крыс показал снижение двигательной активности, отсутствие груминга, значительное повышение потребности в воде на фоне выраженной полиурии. Животные заметно похудели. Шерсть выпадала, на поверхности кожи появились гноящиеся язвы. Общее состояние животных характеризовалось как крайне тяжёлое. К концу 2-й недели состояние крыс улучшалось, было стабильно тяжёлым. Животные потребляли много воды и пищи, груминг отсутствовал. К концу 3-й недели крысы становились более активными, появлялся редкий груминг. Язвы на поверхности кожи постепенно заживали. Несмотря на обильное потребление пищи и воды, животные сильно похудели. Средняя масса тела интактных животных, составлявшая в первой группе 296,64±1,85 г (276-313 г), на 21-й день снизилась до 109,75±0,8 г (106-113 г). Потеря в весе составила 41,2%. Различия статистически значимы (U=0, р <0,01). Содержание глюкозы в крови животных, составлявшее в интактном состоянии 111,8±1,46 мг/дл (108-115 мг/дл), повышалось, начиная с 3-х суток, и на 7-10-е сутки достигало критических значений - более 600 мг/дл. Во второй группе на 2-е сутки после введения аллоксана погибла 1 крыса, на 5-й день - 4 крысы, на 6-й день - 2, на 10-й день - 1 крыса. Всего умерли 8 животных, что составило 32% (p <0,025 по сравнению с первой группой). Клинический осмотр крыс, оставшихся в живых в конце 1-й недели, показал, что они малоподвижны, груминг отсутствовал. На фоне выраженной полиурии значительно повышалась потребность в воде и еде, но при этом они заметно похудели. Шерстяной покров выпадал, присутствовали очаговые язвы. Общее состояние животных характеризовалось как стабильно тяжёлое. К концу 2-й недели состояние животных оставалось стабильно тяжёлым, появился редкий груминг. К концу 3-й недели состояние животных улучшилось, увеличилась частота груминга. Некоторые язвы на поверхности кожи заживали, потребление пищи и воды было высоким, но животные не прибавляли в весе. Средняя масса тела интактных животных составляла 316,64±2,97 г (295-350 г). Средняя масса тела крыс с модифицированной моделью СД, оставшихся в живых, составила 201,0±5,6 г (167-258 г), U=0, p <0,01. Таким образом, животные потеряли 36,5% первоначального веса. Содержание глюкозы в крови интактных животных составило 112,4±1,37 мг/дл (103-129 мг/дл). На 3-и сутки этот показатель снизился до 80,8±2,98 мг/дл (76-90 мг/дл), что связано с тотальной гибелью β-клеток поджелудочной железы, в результате чего в кровь выделяется большое количество депонированного инсулина [5]. На 7-е сутки уровень глюкозы крови повышался и достигал критических значений. Аллоксан наряду с избирательным поражением β-клеток поджелудочной железы, приводящим к тотальной их гибели и повышению содержания глюкозы в крови в связи с абсолютной инсулиновой недостаточностью, обладает также общей токсичностью, проявляющейся поражением печени и почек с высокой летальностью животных [5]. В первой группе наблюдаемая с первых дней общая интоксикация приводила к гибели значительной части животных в начальный период моделирования. При дробном введении аллоксана токсическая фаза менее выражена, поэтому летальность во второй группе оказалась на 36% ниже, чем в первой группе. Повышение содержания глюкозы в крови у животных первой и второй групп было сходным. Постепенное улучшение состояния животных к концу 3-й недели в обеих группах, по всей видимости, связано со спонтанной регенерацией β-клеток поджелудочной железы, выраженной у крыс, что подтверждается и литературными данными [4, 5]. Результаты биохимического исследования крови и органов, взятых после некропсии животных, представлены в табл. 1 и на рис. 1 и 2. Уровень глюкозы (см. табл. 1) в крови животных в первой группе на 10-й день резко повысился и превышал показатели интактных животных на 370,7%, а на 21-й день - на 146,2%, тогда как во второй группе содержание глюкозы повысилось соответственно на 364,5% (на 6,2% меньше по сравнению с первой группой) и 151,5% (на 5,3% больше по сравнению с первой группой). Состояние β-клеток панкреатических островков поджелудочной железы характеризует возможность секреции ими инсулина и С-пептида, служащих диагностическими маркёрами СД [5]. Уровень инсулина (см. табл. 1) в крови животных первой группы на 10-й день был снижен на 95,8%, на 21-й день его содержание повысилось, однако по сравнению с интактными крысами потеря составляла 83,7%. Во второй группе потеря соответственно составляла 96,1 и 82,9%. Различие между результатами групп составляет 0,3 и 0,8%. Снижение уровня С-пептида в первой группе на 10-й день составило 96%, на 21-й день - 83,7%, а во второй группе - 96,0 и 83,7% соответственно. Содержание липидов и жирных кислот в крови отражено на рис. 1. В первой группе содержание холестерина в крови животных, забитых на 10-й день, превышало показатель интактных животных на 11,9% (p <0,01), триглицеридов - на 210,2% (p <0,001), ЛПНП - на 22,1% (p <0,001), ЛПОНП - на 59,1% (p <0,01), СЖК - на 147,5% (p <0,001). При этом содержание ЛПВП снизилось на 30,9% (p <0,001). На 21-й день содержание триглицеридов превышало показатель интактных крыс на 97,2% (p <0,001), холестерина - на 7,8% (p <0,05), ЛПНП - на 15,0% (p <0,05), ЛПОНП - на 27,8% (p <0,05), СЖК - на 93,3% (p <0,001), а потеря ЛПВП составляла 25,7% (p <0,01). Как видно из полученных данных, в результате естественной реверсии диабетического статуса по сравнению с 10-м днём содержание триглицеридов снизилось на 36,4%, холестерина - на 3,6%, ЛПНП - на 5,8%, ЛПОНП - на 19,6%, СЖК - на 21,9%. При этом содержание ЛПВП повысилось на 7,5%. Во второй группе содержание холестерина на 10-й день превышало показатель интактных животных на 13,7% (p <0,01), триглицеридов - на 249,7% (p <0,001), ЛПНП - на 29,2% (p <0,001), ЛПОНП - на 59,2% (p <0,01), СЖК - на 51,1% (p <0,001). При этом содержание ЛПВП снизилось на 37,7%. На 21-й день по сравнению с интактным состоянием содержание триглицеридов увеличилось на 105,2% (p <0,001), холестерина - на 6,0% (p <0,05), ЛПНП - на 18,8% (p <0,05), ЛПОНП - на 25,3% (p <0,05), СЖК - на 68,7% (p <0,001), количество ЛПВП снизилось на 25,8% (p <0,001). В этой группе на 21-й день по сравнению с 10-м днём содержание триглицеридов снизилось на 41,3%, холестерина - на 6,8%, ЛПНП - на 8,0%, ЛПОНП - на 21,3%, СЖК - на 17,5%, а ЛПВП - повысилось на 19,0% (p <0,01). Как видно из полученных результатов, при введении аллоксана крысам в обеих группах наряду с гипергликемией развивается умеренная гиперлипидемия, что связано как с нарушением гликолиза, так и с усилением свободнорадикального окисления липидов. Цифры, полученные в наших экспериментах, согласуются с данными литературы [3]. Результаты определения содержания первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов в первой и второй группах представлены на рис. 2. Как видно из рисунка, в первой группе на 10-й день содержание первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов резко увеличивается. Так, в крови концентрация ДК и МДА увеличивалась на 348,8 и 398,7%, в печени - на 661,5 и 717,6%, в сердце - на 357,0 и 432,0%, в почках - на 727,2 и 1068,8%, в поджелудочной железе - на 1025,9 и 997,8% соответственно. На 21-й день эти показатели были выше по сравнению с интактными животными: в крови - на 116,7 и 177,5%, в печени - на 377,5 и 415,8%, в сердце - на 117,8 и 262,4%, в почках - на 460,7 и 948,4%, в поджелудочной железе - на 411,2 и 558,9%. Если сравнивать с показателями на 10-й день, содержание ДК и МДА на 21-й день снизилось: в крови - на 51,7 и 44,4%, в печени - на 37,3 и 36,9%, в сердце - на 52,4 и 31,9%, в почках - на 32,2 и 10,3%, в поджелудочной железе - на 54,6 и 40,0%. Во второй группе на 10-й день концентрация ДК и МДА увеличивалась: в крови - на 296 и 389%, в печени - на 389 и 503%, в сердце - на 342 и 386%, в почках - на 536 и 811%, в поджелудочной железе - на 983 и 992% соответственно. На 21-й день эти показатели были выше, чем у интактных крыс: в крови - на 89,0 и 154%, в печени - на 218 и 276%, в сердце - на 99,0 и 176%, в почках - на 122 и 469%, в поджелудочной железе - на 381 и 514%. На 21-й день концентрация ДК и МДА относительно 10-го дня снизилась в крови на 48,9 и 48,1%, в печени на - 46,7 и 37,6%, в сердце - на 54,9 и 45,0%, в почках - на 49,4 и 37,5%, в поджелудочной железе - на 55,8 и 43,7%. Отличия всех показателей от значений, полученных у животных интактной группы, статистически значимы (р <0,001). Определение содержания продуктов перекисного окисления липидов у интактных и моделированных животных показало, что количество первичных и вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов в плазме крови и тканях в обеих группах резко возрастает и в зависимости от активности антиоксидантной системы ткани выражено в различной степени. Однако во второй группе этот процесс менее выражен, чем в первой группе. Как известно, гипергликемия, дислипидемия, усиление перекисного окисления липидов - классическая триада, сопровождающая СД, приводящая к развитию ангиопатий, являющихся причиной гипоксии и нарушения трофики тканей различных органов [6, 7, 11]. ВЫВОД Исходя из полученных результатов, мы приходим к заключению, что при моделировании сахарного диабета аллоксаном в обеих группах все исследуемые биохимические показатели на 10-е сутки изменяются патологическим образом, развивается острая форма аллоксанового сахарного диабета. На 21-й день показатели из-за естественной реверсии смоделированного диабетического статуса животных начинают улучшаться, однако значительно уступают таковым у интактных животных (развивается хроническая форма аллоксанового сахарного диабета). При этом летальность животных в предлагаемой нами модифицированной модели аллоксанового сахарного диабета на 36% ниже по сравнению с «классической» моделью. Таблица 1 Содержание глюкозы, инсулина и С-пептида в плазме крови животных на 10-й и 21-й дни моделирования сахарного диабета аллоксаном Группы Статистические данные Глюкоза, мг/дл Инсулин, мкЕД/мл С-пептид, нг/мл Интактные животные M±m 111,8±1,46 3,8±0,12 0,15±0,01 Min-Max 108-115 3,4-4,1 0,12-0,18 p - - - Первая группа на 10-й день M±m 526,2±3,76 0,16±0,09 0,006±0,0015 Min-Max 518-539 0,0-0,5 0,00-0,01 p <0,001 <0,001 <0,001 Первая группа на 21-й день M±m 275,2±4,409 0,62±0,066 0,018±0,006 Min-Max 262-287 0,4-0,8 0,008-0,019 p <0,001 <0,001 <0,001 Вторая группа на 10-й день M±m 519,3±4,01 0,15±0,09 0,006±0,0015 Min-Max 510-532 0,0-0,6 0,00-0,01 p <0,001 <0,001 <0,001 Вторая группа на 21-й день M±m 281,2±3,9 0,65±0,076 0,018±0,006 Min-Max 268-292 0,4-0,8 0,008-0,019 p <0,001 <0,001 <0,001 Примечание: р - статистическая значимость различий по сравнению с интактными крысами. Рис. 1. Содержание холестерина, липидов и жирных кислот в крови животных с аллоксан-моделированным сахарным диабетом. Указаны планки погрешностей со стандартными ошибками. ЛПВП - липопротеины высокой плотности; ЛПНП - липопротеины низкой плотности; ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности; СЖК - свободные жирные кислоты. Джафарова.tif Рис. 2. Изменение концентрации (%) диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) при аллоксан-моделированном сахарном диабете у животных на 10-й и 21-й дни (норма 100%) с указанием стандартной ошибки; поджел. - поджелудочная.

About the authors

R E Jafarova

Scientific and Research Center of Azerbaijan Medical University, Baku, Azerbaijan

Email: rjafarova@bk.ru

References

Supplementary files