Cytokines regulate HIV-1 replication and lymphocyte apoptosis in vitro

Full Text

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последнее время в области терапии инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), патогенез заболевания остаётся предметом научных дискуссий, что обусловливает актуальность проведения дальнейших научных исследований. К примеру, на наш взгляд, актуально исследование роли цитокинов в регуляции вирусной репликации и апоптоза лимфоцитов (Лф), поскольку именно данные процессы способствуют развитию иммунодефицита и прогрессированию заболевания [6]. Показано, что в плазме крови ВИЧ-инфицированных по мере прогрессирования заболевания изменяются концентрации цитокинов. В частности, отмечено снижение содержания интерлейкина-2 (ИЛ-2), а также повышение количества ИЛ-4, ИЛ-7 и фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) [3, 7, 10]. Следовательно, данные цитокины можно рассматривать в качестве потенциальных факторов, способных оказывать влияние на репликацию ВИЧ-1 и апоптоз Лф. Вышеизложенное стало основанием для проведения настоящего исследования по изучению роли цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α в патогенезе ВИЧ-инфекции, а именно в регуляции процессов репликации ВИЧ-1 и апоптоза Лф. Предметом изучения были Лф периферической крови 30 здоровых доноров (17 мужчин и 13 женщин) в возрасте от 25 до 50 лет. Мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) выделяли центрифугированием на градиенте плотности раствора фиколл-пак («Sigma», США). С помощью камеры Горяева определяли количество МНПК в 1 мл питательной среды RPMI 1640 («Биолот», г. Санкт-Петербург). В стерильных условиях ламинарного бокса («Labconco», США) МНПК вносили в лунки 24-луночных плоскодонных планшетов («Orange Scientific», Бельгия) в конечной концентрации 500×103 клеток/мл и культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением L-глутамина, эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург) и антибиотиков («Sigma», США). В культуры Лф вносили цитокины в следующих концентрациях: 10 ME/мл ИЛ-2 («Sigma», США), 3 нг/мл ИЛ-4, 2,5 нг/мл ФНО-α («Biosource», США), 15 нг/мл ИЛ-7 («National Сancer Institute», США). Концентрации цитокинов определялись на основании литературных данных и соответствовали их физиологическим значениям [8, 9]. Культивирование клеток проводили при 37 °С в СО2-инкубаторе («Jouan», США) в течение 11 дней. На 3-й, 6-й, 9-й и 11-й дни проводили забор части клеточной суспензии на предмет анализа учётных признаков Лф: общее количество клеток, экспрессия активационных маркёров и маркёров апоптоза. В отдельные 24-луночные планшеты помещали МНПК с целью моделирования ВИЧ-инфекции in vitro. Инфицирование клеток производили сразу же в 1-й день через 2 ч после добавления цитокинов. Для инфицирования использовали лабораторный штамм ВИЧ-1 NL4-3 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, США). Культивирование Лф и анализ их учётных признаков проводили аналогично неинфицированным культурам. Определение в культуре клеток количества активированных Лф проводили, используя соответствующие моноклональные антитела (мкАТ): (1) мкАТ к молекуле CD25, конъюгированные с флюорохромом FITC («Сорбент», Москва), (2) мкАТ к молекулам HLA-DR, конъюгированные с флюорохромом РЕ («Сорбент», Москва). Для определения активационного статуса инфицированных Лф (клеток с активной вирусной репликацией) проводили окрашивание клеточной суспензии на поверхностные активационные маркёры CD25 и HLA-DR с последующим внутриклеточным выявлением вирусного белка р24gag с помощью соответствующих мкАТ («Beckman Сoulter», CША). Оценку результатов осуществляли методом проточной цитометрии на приборе «Facs Calibur» («Becton Dickinson», CША). В качестве критериев, использованных для оценки апоптоза Лф, были выбраны следующие: снижение величины трансмембранного митохондриального потенциала (Δym) на фоне одновременной экспрессии молекул фосфатидилсерина [1]. Для этого использовали соответствующие флюорохромы: DiOC6 и MC 540 («Sigma», США), а также Annexin V («PharMingen», США), конъюгированный с флюорохромом FITC (AnnV-FITC). Апоптоз инфицированной популяции Лф исследовали следующим образом: 1-й этап - окрашивали клетки с помощью флюорохрома AnnV-FITC; 2-й этап - клетки отмывали, затем проводили внутриклеточное окрашивание на наличие белка ВИЧ-1 р24gag с помощью соответствующих мкАТ, конъюгированных c флюорохромом PE («Beckman Сoulter», CША). Оценку результатов проводили на проточном цитометре «Facs Calibur». Репликацию ВИЧ-1 оценивали методом иммуноферментного анализа по содержанию вирусного белка р24gag (пкг/мл) в супернатантах инфицированных культур. Для этого применяли тест-систему «ДС-ИФА-ВИЧ-АГ-скрин» («Диагностические системы», Нижний Новгород) и использовали стандарт с концентрацией белка р24gag 11 нг/мл («Bio-Rad», Франция). Учёт результатов проводили на планшетном фотометре «Multiskan EX» («Thermo Labsystem», Финляндия). Полученные экспериментальные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью компьютерной программы BIOSTATISTICA (S.A. Glantz, McGraw Hill). Уровень статистической значимости (р) считали равным 0,05. Связь между признаками оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). Внесение ВИЧ-1 в культуры Лф, инкубированные в отсутствие цитокинов, не приводило к его репликации, в то время как после внесения ВИЧ-1 в культуры Лф, инкубированные с цитокинами ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α, отмечалась вирусная репликация (р <0,05). Пик репликации ВИЧ-1 возникал на 6-й день культивирования: (1) в присутствии ИЛ-7 (р24gag - 526±146 пкг/мл); (2) в присутствии ИЛ-2 (р24gag - 3974±115 пкг/мл); (3) в присутствии ИЛ-4 (р24gag - 2769±223 пкг/мл); (4) в присутствии ФНО-α (р24gag - 2695±288 пкг/мл). Таким образом, по способности индуцировать репликацию ВИЧ-1 изучаемые цитокины располагаются в следующей последовательности: (1) ИЛ-7 - наибольшие значения вирусной репликации; (2) ИЛ-2; (3) ИЛ-4 и ФНО-α - наименьшие значения вирусной репликации. После установления того, что исследуемые цитокины индуцируют репликацию ВИЧ-1 в Лф, была поставлена задача выяснить причину данного феномена. Для этого изучали способность цитокинов вызывать активацию Лф. Известно, что именно активированные клетки являются основными источниками репликации ВИЧ-1 [2]. Уровень активации Лф оценивали по экспрессии поверхностных маркёров (см. выше). В отсутствие цитокинов количество активированных Лф было минимальным (не более 2,5%) как в неинфицированных, так и в инфицированных культурах. В присутствии цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α происходила активация Лф как в неинфицированных, так и в инфицированных культурах (р <0,05). Было обнаружено, что Лф с активной вирусной репликацией (р24gag-позитивные) представляют собой гетерогенную популяцию клеток. Среди них присутствовали как Лф, экспрессирующие классические маркёры активации CD25 и HLA-DR, так и клетки без признаков активации. Проведённые исследования также показали, что во всех инфицированных культурах, инкубированных с цитокинами, была выявлена прямая зависимость между уровнем репликации ВИЧ-1 и количеством активированных Лф (r >0,74, р <0,05), а также между уровнем репликации ВИЧ-1 и количеством инфицированных (р24gag-позитивных) клеток (r >0,74, р <0,05). Цитокины ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α в отсутствие инфицирования ВИЧ-1 поддерживали жизнеспособность Лф в культуре (на заключительный 11-й день количество Лф соответствовало их количеству на начальных этапах культивирования). Напротив, при инфицировании Лф в присутствии цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α) наблюдалась их гибель по механизму апоптоза. В инфицированных культурах количество Лф с признаками апоптоза достоверно отличалось от неинфицированных культур (рис. 1). Статистический анализ полученных результатов показал, что в присутствии цитокинов количество Лф с признаками апоптоза было достоверно больше в инфицированных культурах, чем в неинфицированных (рис. 2). По способности индуцировать апоптоз Лф в инфицированных культурах цитокины располагаются в следующей последовательности: (1) ФНО-α - в культурах отмечено наибольшее количество Лф с признаками апоптоза; (2) в присутствии ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-7 обнаружено одинаковое количество Лф с признаками апоптоза. В инфицированных культурах в присутствии цитокинов (ИЛ-2 и ИЛ-7) по механизму апоптоза погибали преимущественно неинфицированные Лф, в то время как Лф с активной репликацией вируса оставались жизнеспособными. Результаты проведённого исследования свидетельствуют, что цитокины ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α индуцируют репликацию ВИЧ-1 в Лф. Репликация ВИЧ-1 отмечена только при наличии в культуре активированных Лф. Цитокины вызывали активацию Лф, в результате в культурах происходила вирусная репликация. Инфицирование культур неактивированных Лф (то есть инкубированных в отсутствие цитокинов) не индуцировало репликацию ВИЧ-1, так как не обеспечивало активацию данных клеток. В литературе продемонстрировано, что активация Лф - один из пусковых факторов репликации ВИЧ-1 [2]. В то же время полученные результаты свидетельствуют, что Лф с активной репликацией ВИЧ-1 представляют собой гетерогенную популяцию клеток. Среди них присутствовали как Лф, экспрессирующие классические маркёры активации CD25 и HLA-DR, так и клетки, не имеющие данных маркёров. Следовательно, можно предположить, что наряду с классическим механизмом репликации ВИЧ-1 в Лф существует альтернативный, то есть не зависящий от активации Лф, что требует дальнейшего изучения. Данный факт заслуживает особого внимания, так как свидетельствует об альтернативных молекулярных механизмах репликации ВИЧ-1 в Лф, не связанных с активацией клеток-мишеней. Кроме того, продукция ВИЧ-1 в Лф, не экспрессирующих активационных маркёров, может также свидетельствовать о произошедшей реактивации пула латентно инфицированных клеток, не экспрессирующих, как известно, классические активационные маркёры. Дальнейшие запланированные исследования по изучению механизмов латентности при ВИЧ-инфекции и, в частности, по изучению фенотипа, характерного для пула латентно инфицированных Лф, могут подтвердить правомочность данного положения. Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в инфицированных in vitro ВИЧ-1 клеточных культурах цитокины ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α индуцируют гибель Лф по механизму апоптоза (см. рис. 1 и 2). Более чувствительны к апоптозу были неинфицированные Лф, в то время как инфицированные клетки оставались жизнеспособными. Этот факт может быть объяснён следующими механизмами. Показано, что активация Лф повышает их чувствительность к развитию апоптоза [4]. Следовательно, исследуемые цитокины, вызывая активацию Лф, способствовали развитию их программированной гибели. В инфицированных культурах под влиянием цитокинов накапливались свободные вирионы и вирусные белки. В то же время известно, что некоторые белки ВИЧ-1 (Env, Nef, Tat, Vpr, протеаза) способны индуцировать гибель неинфицированных Лф по механизму апоптоза [6]. Высвобожденные из инфицированных Лф вирусные белки запускают апоптоз неинфицированных клеток при контактном взаимодействии с ними. Механизмы действия данных белков весьма разнообразны. В частности, некоторые из них (белки Env, Nef, Tat) способны индуцировать активацию Лф и, следовательно, повышать чувствительность данных клеток к развитию активационного апоптоза [6]. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что инфицированные Лф (клетки с активной вирусной репликацией) оставались жизнеспособными в присутствии цитокинов. Показано, что в возникновении данного феномена также важную роль играют вирусные белки. В частности, белок вируса Tat повышает в клетке активность белка-ингибитора апоптоза с-FLIP [5]. В то же время результаты настоящего исследования показали, что в данном процессе также немаловажную роль играют и клеточные факторы, в частности цитокины ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α. Они, действуя в совместно с вирусными белками, обусловливают оптимальный для жизнедеятельности инфицированных Лф особый активационый статус, проявляющийся при отсутствии экспрессии классических маркёров CD25 и HLA-DR. Перечисленные особенности, вероятно, препятствуют развитию активационного апоптоза инфицированных Лф. Для подтверждения правомочности данной гипотезы необходимо проведение дальнейших исследований. Результаты проведённого исследования свидетельствуют о том, что цитокины, содержание которых повышается в плазме крови больных при прогрессировании ВИЧ-инфекции (то есть ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α), индуцируют репликацию ВИЧ-1 в Лф in vitro, а также способствуют гибели неинфицированной популяции Лф по механизму апоптоза. При этом цитокины поддерживают жизнеспособность инфицированных Лф и тем самым способствуют формированию вирусных резервуаров в организме ВИЧ-инфицированных. Следовательно, повышение уровней ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α в плазме ВИЧ-инфицированных больных можно рассматривать в качестве маркёров неблагоприятного течения заболевания. Таким образом, цитокины ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и ФНО-α, являющиеся факторами, направленными на поддержание гомеостаза иммунной системы и формирование адекватного иммунного ответа, при ВИЧ-инфекции могут играть негативную роль. ВЫВОДЫ 1. Интерлейкины-2, -4, -7 и фактор некроза опухоли альфа индуцируют репликацию ВИЧ-1 в лимфоцитах. Наиболее эффективные индукторы вирусной репликации - интерлейкины-7 и -2. 2. В инфицированных in vitro ВИЧ-1 клеточных культурах цитокины (интерлейкины-2, -4, -7 и фактор некроз опухоли альфа) поддерживают жизнеспособность инфицированных лимфоцитов (клеток с активной вирусной репликацией), в то же время индуцируя гибель неинфицированной популяции лимфоцитов по механизму апоптоза. Наиболее эффективный индуктор апоптоза лимфоцитов - фактор некроза опухоли альфа. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №13-04-97034 р_поволжье_а. Рис. 1. Апоптоз лимфоцитов в неинфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-) и инфицированных (ВИЧ+) культурах, инкубированных в присутствии интерлейкинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7) и фактора некроза опухоли (ФНО) альфа - 6-й день культивирования. Лимфоциты с признаками апоптоза (%) - в левом верхнем квадрате. Бойчук_1.tif Рис. 2. Апоптоз лимфоцитов в неинфицированных и инфицированных ВИЧ-1 культурах, инкубированных в присутствии цитокинов - интерлейкинов (ИЛ) и фактора некроза опухоли (ФНО) альфа, 6-й день культивирования.

About the authors

S V Boichuk

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Email: boichuksergei@mail.ru

P D Dunaev

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

I G Mustafin

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

References

Supplementary files