Клинико-иммунологическая характеристика пациентов с хроническим гепатитом C во время противовирусной терапии в безинтерфероновом режиме

Полный текст

Введение

Вирус гепатита C (ВГС) является основной причиной заболевания печени. Также он занимает лидирующее место в прогрессии фиброза, развитии цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы [1]. В последние два десятилетия растет внимание к этиотропной терапии хронического вирусного гепатита C (ХВГС) [2]. У пациентов, получавших противовирусную терапию (ПВТ), снижалась смертность, связанная с прогрессией фиброза печени и возникновением гепатоцеллюлярной карциномы. Долгие годы для лечения использовалась терапия, включавшая в себя применение препаратов интерферона и рибавирина, при этом пациенты достигали устойчивого вирусологического ответа (УВО) только в 28–46% случаев [3]. Ингибиторы протеазы вируса гепатита C — телапревир, боцепревир, нарлапревир, симепревир использовались для лечения пациентов, инфицированных ВГС 1 генотипа, в сочетании с пролонгированными интерферонами и рибавирином, что значительно увеличило долю пациентов, достигших УВО [4]. Через некоторое время появляется возможность лечения HCV-инфекции с помощью безинтерферонового режима терапии с эффективностью 95–100 % [5].

Переносимость пациентами ПВТ в безинтерфероновом режиме гораздо выше, чем ПВТ с использованием интерферонов, ­однако цена таких препаратов остается ­неизменно высокой. Поэтому актуальным оказывается вопрос о прогнозе эффективности терапии в зависимости от особенности иммунологического ответа, обусловленного генетическим свое­образием организма человека. Цитокины и хемокины являются ключевыми медиаторами воспалительного процесса и формирования иммунитета, ответственного за естественную элиминацию ВГС и результат ПВТ. С появлением безинтерфероновой терапии стало возможным лучше изучить взаимодействие ВГС и иммунной системы пациента, так как в этом случае отсутствует экзогенная стимуляция, индуцируемая интерферонами [6]. Длительное воспаление и прогрессия фиброза связаны с повышенной продукцией воспалительных хемокинов и медиаторов воспаления, постоянной активацией NK-клеток, печеночных моноцитов/макрофагов, по большей части Купферовских клеток [7]. Среди печеночных биомаркеров воспаления хемокин протеин-10 (CXCL10/IP-10), индуцируемый интерфероном-гамма (INF-γ), играет важную роль в патогенезе HCV-инфекции и связан с активацией воспаления в печени, а также со степенью развития фиброза [8, 9].

Цель: оценить динамику клинико-лабораторных изменений у пациентов с ХВГС во время ПВТ в безинтерфероновом режиме, а также изучить изменения биомаркеров воспаления печени, в том числе CXCXL10/IP-10.

Материалы и методы исследования

Было проведено исследование среди пациентов с ХВГС во время проведения ПВТ в период с 2015 по 2016 гг. Лечение проводилось на кафедре инфекционных болезней взрослых и эпидемиологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургскоий государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России, клинической базой которого явились отделения СПбГБУЗ «Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина» и ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера».

Было обследовано 14 пациентов в возрасте от 33 до 71 года во время проведения ПВТ в безинтерфероновом режиме. Средний возраст пациентов составил 49,5±7,5 лет.

Для подтверждения диагноза ХВГС у всех пациентов на начальной точке исследования проводилась серологическая диагностика с определением суммарных антител к ВГС (HCV Ab). Методом полимеразной цепной реакции проводили молекулярно-биологическое исследование (обнаружение ВГС в плазме крови пациента и выявление уровня вирусной нагрузки [ВН] и молекулярно-генетическое исследование [определение генотипа вируса]). Кроме того, у всех пациентов проводили дополнительные исследования для исключения наличия маркеров вируса гепатита В, ВИЧ и сифилиса.

Биохимический анализ крови включал определение активности цитолитических фер­ментов аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы (АлАТ и АсАТ), концентрации общего билирубина, активности амилазы, щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глютамилтранспептидазы (ГГТП), протромбинового индекса (ПТИ).

Определение степени выраженности фиброза печеночной ткани проводилось с помощью непрямой транзиентной эластометрии печени.

Общая характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Общая характеристика пациентов

Пол пациентов, м:ж		4:10
Средний возраст пациентов, лет		49,5±7,5
Уровень билирубина, мкмоль/л		18,0±11,3
Активность АлАТ, МЕ/л		99,8±1,5
Активность АсАТ, МЕ/л		102,2±2,6
Медиана вирусной нагрузки, МЕ/л		5,4 х 105
Генотип HCV, 1b:1a, абс.		13:1
Степень фиброза (по METAVIR), абс.	F0	3
	F1	0
	F2	0
	F3	3
	F4	8
ПВТ с использованием пролонги­рованных интерферонов в анамнезе, абс.		9

 

При проведении ПВТ в безинтерфероновом режиме у 8 пациентов применяли комбинированный препарат: дасабувир, омбитасвир, паритапревир, ритонавир в течение 12 недель. У 3 пациентов в комбинации с рибавирином. Остальные шесть пациентов получали даклатасвир и асунапревир в течение 24 недель. Эффективность ПВТ ХГС определялась по процентной доле пациентов, у которых уровень ВН в плазме крови был ниже определяемого уровня на 2–4 неделю терапии.

Дополнительное иммунологическое исследование цитокинов/хемокинов во время ПВТ было проведено у 11 пациентов, определение Т- и В-клеток, несущих на своей поверхности хемокиновые рецепторы, проводилось у 6 пациентов.

В плазме крови измеряли концентрации цитокинов/хемокинов: TNFα, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3α, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC методом мультиплексного анализа по технологии xMAP («Luminex») с использованием коммерческих тест-систем «Milliplex MAP» («Millipore») (США), основанных на магнитных микросферах «Milliplex Mag» (США), согласно инструкциям производителя. Регистрацию и анализ данных проводили на приборе «Luminex MAGPIX» («Luminex») (США).

У шести пациентов также были оценены процентные содержания CXCR3+ и CCR6+ лимфоцитов: Т-клеток, Th (Т-хелперов), CTL (цитотоксических лимфоцитов), NK-клеток (натуральных киллеров) и B-лимфоцитов методом проточной цитофлюориметрии с использованием различных комбинаций моноклональных антител: для оценки CTL и NK-клеток — CD3/CD16,56/CXCR3/CCR6/CD8, В-лимфоцитов и Тh — CD19/CD3/CXCR3/CCR6/CD4.

Для определения статистически значимых различий медиан был использован критерий Краскела-Уоллиса с уровнем значимости р<0,05.

Результаты исследования

Все пациенты, получавшие ПВТ, были разделены на две группы. Принципом деления на группы послужила разная выраженность фиброза печени. В первую группу были отнесены пациенты с отсутствием фиброза печени — F0, а во вторую — с выраженным фиброзом и циррозом печени — F3–F4. Количество наблюдаемых пациентов составило: в первой группе — 3 человека, а во второй — 11 больных.

В процессе ПВТ у всех пациентов обеих групп ВН достигла неопределяемого уровня на 2–4 неделях терапии и оставалась таковой в течение всей терапии и при последующем наблюдении в течение 12 недель.

Также к моменту достижения пациентами вирусологического ответа происходила нормализация активности печеночных ферментов: АлАТ и АсАТ (рис. 1), щелочной фосфатазы и гамма-глютамилтранспептидазы. Средние значения показателей концентрации общего билирубина и ПТИ были в пределах нормы.

 

Рис. 1. Изменение активности АлАТ (слева) и АсАТ (справа) у пациентов с ХВГС в процессе ПВТ

 

У части пациентов обеих групп были определены концентрации цитокинов/хемокинов: TNFα, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3α, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC (I группа — 2 человека, II группа — 9 человек), а у 6 пациентов были определены субпопуляции Т- и В-лимфоцитов с CXCR3 и CCR6 рецепторами (I группа — 2 человека, II группа — 4 человека). Величины иммунологических показателей в процессе терапии были сопоставлены с показателями группы условно здоровых людей. Для случаев достоверного изменения иммунологических показателей их величины приведены в табл. 2.

 

Таблица 2. Изменение иммунологических показателей (медианы) во время проведения противовирусной терапии в безинтерфероновом режиме

Время Показатель	Начало	6/12 нед.	12/24 нед.	Досто­верность* (p)
CCL10/IP-10 (F0), пг/мл	1139	603	292	0,025
CCL10/IP-10 (F3-4), пг/мл	1898	933	615	0,00015
CD3(F0), %	67	69	76	0,065
TNKCCR6+(F3-4), %	5,6	9,9	10,7	0,02

* достоверность изменения этих показателей, рассчитанная по трем временным точкам методом Краскела-­Уоллиса.

 

В группе пациентов, не имевших фиброза печени, были обнаружены достоверно значимые снижения концентрации CXCL10/IP-10 к окончанию лечения по сравнению с ­показателями до начала терапии (р=0,025) (рис. 2). Перед проведением терапии медианы для этого показателя превышали медианы в группе здоровых доноров в 6,8 раз и стали приближаться к нормальным показателям к окончанию терапии (превышение составило 1,7 раза).

 

Рис. 2. Концентрации хемокина CXCL10/IP-10 на разных этапах терапии для групп с фиброзом F0 и F3–4 в сравнении с верхней границей нормы (UN).

 

У пациентов второй группы (F3–4) наблюдалось уменьшение концентраций CXCL10/IP-10 к окончанию лечения (p=0,00015) (рис.2). Перед проведением терапии медиана этого показателя в 11,4 раза превышала медиану в контрольной группе. К окончанию терапии превышение снизилось до 3,7 раз. А также в этой группе к окончанию терапии наблюдалась тенденция к уменьшению концентрации CCL3/MIP-1α (p=0,09).

По данным проточной цитометрии в первой группе наблюдалась тенденция к увеличению относительного содержания T-лимфоцитов (p=0,065), а во второй группе — достоверное увеличение относительного содержания TNKCCR6+ (p=0,02) в процессе лечения (рис. 3). На старте терапии этот показатель был в 10 раз меньше, чем в норме, а к окончанию терапии различие сократилось до 5 раз.

 

Рис. 3. Относительное содержание CD3+ лимфоцитов для группы с фиброзом F0 (слева) и TNKCCR6+ для группы с фиброзом F3–4 (справа) на разных этапах терапии в сравнении с нормой (светло-серым показана область, ограничивающая интерквартильный размах, а пунктир соответствует медиане для показателей нормы).

 

Обсуждение

В результате полученных нами данных во время проведения ПВТ в безинтерфероновом режиме у всех пациентов был достигнут УВО, что подтверждает литературные данные о высокой эффективности безинтерфероновой терапии [5].

Согласно научным сведениям CXCL10/­IP-10 является предиктором отсутствия ответа на ПВТ. В статьях ряда авторов [9, 10] сообщается о положительной корреляции между уровнем CXCL10/IP-10 и ответом на лечение пролонгированными интерферонами и рибавирином. Известно, что уровень CXCL10/IP-10 в крови пациентов увеличивается в ответ на введение в организм экзогенного интерферона. В статье Prinapori R. и соавторов исследовалось изменение уровня CXCL10/IP-10 у 8 пациентов через 48 часов после первого ­введения интерферона. ­Показано, что у всех ­пациентов повышался уровень данного хемокина, была обнаружена слабая взаимосвязь между наступлением раннего вирусологического ответа и увеличением уровня CXCL10/IP-10 через 48 часов после начала интерфероновой терапии [11].

В данном исследовании мы проанализировали изменения биомаркеров воспаления печени во времени у пациентов с HCV-инфекцией, получавших ПВТ в безинтерфероновом режиме. В результате анализа изменения концентраций различных воспалительных цитокинов/хемокинов оказалось, что уровень CXCL10/IP-10 значительно снижался к окончанию лечения. Это полностью совпадает с данными Mascia C. и соавторов [12], в статье которых сообщается о снижении уровня CXCL10/IP-10 у пациентов, развивших после лечения УВО уже к концу 1 месяца. Это наблюдалось как в группе пациентов, получавших пролонгированные ­интерфероны, рибавирин и один из препаратов прямого ­противовирусного действия (телапривир или боцепривир), так и в группе пациентов, получавших терапию в безинтерфероновом режиме.

Также в статье Serti E. и соавторов [13] сообщается о понижении сывороточного уровня CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAK в процессе терапии у пациентов, ответивших на ПВТ, с использованием даклатасвира и асунапревира. Однако к моменту окончания терапии уровни этих хемокинов не снижались до значений нормы. В нашем исследовании содержание данных хемокинов также превышает нормальные значения к окончанию лечения.

Нами не было выявлено различий в степени снижения сывороточного уровня CXCL10/IP-10 у пациентов с разной степенью фиброза, что соответствует данным Diago M. и соавторов [14].

Выводы

Эффективность ПВТ в безинтероновом режиме по данным настоящего исследования составила 100 %. Среди изученных показателей основным биомаркером, характеризующим снижение воспалительного процесса в печени во время проведения ПВТ, является хемокин CXCL10/IP-10. Снижение сывороточного уровня хемокина CXCL10/IP-10 во время ПВТ не зависело от степени фиброза печени.

Во время ПВТ наблюдались повышение относительного содержания TNKCCR6+-клеток у пациентов с выраженным фиброзом печени и тенденция к повышению относительного содержания T-лимфоцитов, что, вероятно, может играть ведущую роль в элиминации ВГС.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Валентина Владимировна Басина

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: v.basina@mail.ru
г. Санкт-Петербург, Россия

Анастасия Александровна Сухорук

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет; Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Email: v.basina@mail.ru
г. Санкт-Петербург, Россия; г. Санкт-Петербург, Россия

Наталья Александровна Арсентьева

Санкт-Петербургский научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Email: v.basina@mail.ru
г. Санкт-Петербург, Россия

Наталья Евгеньевна Любимова

Санкт-Петербургский научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Email: v.basina@mail.ru
г. Санкт-Петербург, Россия

Александр Владимирович Семенов

Санкт-Петербургский научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Email: v.basina@mail.ru
г. Санкт-Петербург, Россия

Елена Владимировна Эсауленко

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет; Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Email: v.basina@mail.ru
г. Санкт-Петербург, Россия; г. Санкт-Петербург, Россия

Арег Артемович Тотолян

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Email: v.basina@mail.ru
г. Санкт-Петербург, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы