Влияние дооперационной секреции α-гранул тромбоцитов на показатели гемостаза и кровопотерю при эндопротезировании крупных суставов

Полный текст

Актуальность

В настоящее время доказано, что роль тромбоцитов не ограничивается формированием сгустка, купирующего кровопотерю и обеспечивающего репарацию сосудистой стенки [1]. Тромбоцит признают также ключевой эффекторной клеткой, принимающей участие в регуляции иммунологических реакций и воспаления [2, 3]. При проведении обширных ортопедических операций, сопряжённых с введением имплантата, таких как эндопротезирование тазобедренного сустава (ЭТС), роль тромбоцитов особенно важна, поскольку необходимо не только справиться с последствиями массивного повреждения сосудов, но и создать условия для эффективной остеоинтеграции протеза [4].

Взаимодействуя как с субэндотелием, так и с имплантатом, тромбоциты быстро активируются и высвобождают содержимое своих гранул. Три основных типа гранул тромбоцитов — α-гранулы, плотные гранулы и лизосомы [5]. Их своевременное высвобождение необходимо для осуществления адекватного эффективного ответа организма на обширное хирургическое вмешательство [6]. Секреция гранул имеет решающее значение не только для регулирования «канонических» функций тромбоцитов, компоненты гранул опосредуют действие тромбоцитов на другие клетки [5].

Наиболее многочисленны α-гранулы тромбоцитов, в которых хранятся факторы, способствующие активации кровяных пластинок (фактор фон Виллебранда, фибриноген), коагуляции (факторы V, XI, XIII, протромбин), антикоагуляции (ингибитор пути тканевого фактора, протеин S), фибринолиза (плазминоген, плазмин) [7]. В α-гранулах находятся адгезивные рецепторы: от половины до двух третей общего αIIbβ3-тромбоцитарного рецептора для фибриногена, и более трети рецепторов GPVI для коллагена, которые переносятся на поверхность тромбоцитов после их активации, дополнительно усиливая адгезивно-агрегационные свойства [8]. В α-гранулах содержатся также факторы роста и цитокины, контролирующие регенеративные процессы, способствующие восстановлению тканей и стабильности установленного имплантата [9, 10].

Один из специфических тромбоцитарных белков — β-тромбоглобулин (β-ТГ), являющийся промежуточным продуктом протеолиза основного белка тромбоцитов (PBP — от англ. Platelet Basic Protein). β-ТГ обладает выраженной хемоаттрактивной активностью, стимулирует миграцию фибробластов и нейтрофилов в зоны воспаления и повреждения сосудов [11]. Данный белок признан в качестве маркёра активности секреции тромбоцитарных факторов из α-гранул [12, 13].

Известно, что циркулирующие в крови тромбоциты гетерогенны. Факторами, определяющими неоднородность, могут быть различия между мегакариоцитами и старение тромбоцитов. Кроме того, циркулирующие тромбоциты находятся под активирующим и ингибирующим влиянием различных биомолекул и биомеханических условий кровотока, эти воздействия модулируют тромбоцитарную реакцию на последующий стимул, то есть происходит положительное или отрицательное праймирование тромбоцитов [14, 15].

Эндопротезирование крупных суставов — травматичная операция, которая сопряжена с высоким риском как значительной кровопотери, так и тромбоэмболических осложнений [16, 17]. Важность определения функциональных особенностей тромбоцитов у пациентов, перенёсших такие операции, не вызывает сомнения, однако работы, посвящённые этой проблеме немногочисленны.

Цель

В связи с этим целью нашей работы стало определение влияния дооперационного уровня секреторной активности α-гранул на изменение параметров гемостаза и объём кровопотери при ЭТС.

Материал и методы исследования

В исследование были включены 58 пациентов, поступивших в стационар для проведения им первичного ЭТС. Критерии включения: возраст от 40 до 75 лет, наличие коксартроза III–IV стадии. Критерии исключения: наличие хронических заболеваний в стадии декомпенсации, патология системы гемостаза, приём антикоагулянтных или антитромбоцитарных препаратов в течение 2 нед до операции.

Работа одобрена локальным комитетом по биомедицинской этике ФГУ «Уральский институт травматологии и ортопедии им. В.Д. Чаклина» (протокол № 6 от 03.07.2011).

Всем пациентам была проведена операция ЭТС. Все включённые в исследование пациенты получали стандартную антикоагулянтную профилактику низкомолекулярным гепарином — эноксапарином натрия. Антикоагулянт вводили подкожно в дозе 40 мг/сут в течение 14 дней после операции.

Отбор образцов крови для исследования проводили из вены в утренние часы за 1 сут до операции, по окончании операции (через 30 мин), на 1-е, 3-и, 7-е и 14-е сутки после ЭТС. Для определения количества тромбоцитов забор крови производили в пробирки с калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты, для тромбоэластографических исследований — в пробирки с 3,8% (0,129 М) раствором цитрата натрия в стандартном соотношении 1:9 по отношению к забираемой крови, для определения β-ТГ — в STAD-пробирки в том же соотношении крови и антикоагулянта. Бедную тромбоцитами плазму получали центрифугированием со скоростью 3000 об./мин в течение 15 мин. Для последующего проведения иммуноферментного анализа образцы плазмы крови замораживали и хранили при температуре –20 °C.

Количество тромбоцитов определяли в цельной крови на гематологическом анализаторе Сell-Dyn 170 (Abbot Laoratories, США). Тромбоэластографические исследования выполняли на компьютеризированном тромбоэластографе TEG-5000 (Haemoscope Corporation, США), определяли показатели R и МА. R — реакционное время от начала анализа образца до достижения уровня детекции сгустка, уменьшение R происходит в условиях гиперкоагуляции. МА — максимальная амплитуда, характеризует максимум прочности сформированного сгустка, в физиологических условиях бывает результатом действия двух компонентов: умеренный вклад фибрина и наиболее существенный вклад тромбоцитов [18].

Активность β-ТГ определяли количественно, методом иммуноферментного анализа, наборами Asserachrom β-ТГ, Diagnostica Stago (France). Калибровочные растворы получали путём последовательного разведения (1; 1:2; 1:4; 1:8; 1:16) коммерческой стандартной плазмы. Контроль качества осуществляли на низком и высоком уровнях.

D-димер — специфический продукт деградации поперечно сшитого фибрина в процессе его плазминовой деградации. Он служит одним из наиболее важных маркёров активации свёртывающей и фибринолитической систем. Определение D-димера проводили иммуноферментным методом реактивами Technozym D-dimer ELISA, Technoclone (Austria).

Объём интраоперационной кровопотери определяли гравиметрически, послеоперационную кровопотерю — как потерю крови по ­дренажам.

Для того чтобы установить влияние до­операционного уровня секреции из α-гранул на послеоперационную активность их высвобождения, на коагуляцию, параметры формирования сгустка и уровень кровопотери, все пациенты были разделены на две группы в соответствии с дооперационным уровнем высвобождения β-ТГ. Группу с низким содержанием β-ТГ (НТГ) составили 30 пациентов, концентрация β-ТГ в крови у которых была <30 МЕ/мл, группу с высоким уровнем β-ТГ (ВТГ) — 28 пациентов, имевших содержание β-ТГ ≥30 МЕ/мл.

Характеристика групп представлена в табл. 1, они не различались по возрасту, полу, типу используемого протеза, виду анестезиологического пособия, времени проведения хирургического вмешательства.

 

Таблица 1. Характеристика групп пациентов, перенёсших эндопротезирование тазобедренного сустава и имеющих низкий и высокий исходный уровень β-тромбоглобулина

Показатель	Группа НТГ	Группа ВТГ	р
Возраст, годы1	59,4±11,2	58,8±9,6	0,663
Пол, мужчины/женщины, абс.	12/18	14/14	0,617
Вид анестезии, общая/регионарная, абс.	8/22	5/23	0,299
Тип протеза, цементный/бесцементный, абс.	11/19	7/21	0,638
Время операции, мин1	116±25	119±24	0,817

Примечание: 1результаты представлены как среднее значение±стандартное отклонение; НТГ — группа с низким уровнем β-тромбоглобулина; ВТГ — группа с высоким уровнем β-тромбоглобулина.

 

Обработку полученных данных проводили в рамках правил вариационной статистики с использованием пакета программ Statistica 8.0. Характер распределения вариационных рядов оценивали с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. При изучении динамики показателей использовали критерий Фридмана, сравнение с исходным значением осуществляли с применением критерия Уилкоксона, сравнение показателей между изучаемыми группами проводили с помощью теста Манна–Уитни, для оценки связи между показателями применяли корреляционный анализ с вычислением коэффициента Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p <0,05.

Результаты и обсуждение

Определение концентрации β-ТГ перед ЭТС и в динамике послеоперационного периода показало, что реакция тромбоцитов на оперативное вмешательство стереотипна, но различается по выраженности у клеток с разной исходной активностью. Максимальный уровень данного белка зарегистрирован непосредственно по окончании операции, с 1-х суток происходит постепенное снижение количества β-ТГ в крови в обеих исследуемых группах (рис. 1). Однако в группе НТГ концентрация β-ТГ сохраняется на повышенном относительно ­исходного уровне до конца периода наблюдения (β-ТГисх=22,4 [17, 7; 26, 6]; β-ТГ14сут=31,0 [27, 7; 43, 4], pβТГ14сут–βТГисх=0,0001, критерий Уилкоксона), в то время как в группе ВТГ возвращается к дооперационным значениям (β-ТГисх=40,0 [34, 2; 61, 5]; β-ТГ14сут=41,5 [31, 7; 61, 0], pβТГ14сут–βТГисх=0,581, критерий Уилкоксона).

 

Рис. 1. Концентрация β-тромбоглобулина в крови при эндопротезировании тазобедренного сустава. Результаты представлены как медиана [интерквартильный размах]; *различия между группами имеют статистическую значимость (p <0,05 в тесте Манна–Уитни); НТГ — группа с низким уровнем β-тромбоглобулина, ВТГ — группа с высоким уровнем β-тромбоглобулина

 

Обнаружен сходный характер изменений маркёра тромбоцитарной секреции в обеих группах, однако если в группе НТГ выраженность этих изменений относительно исходного уровня имеет статистическую значимость (критерий Фридмана p=0,0001), то в группе ВТГ динамика менее выражена (критерий Фридмана p=0,269) (см. рис. 1).

Нами было обнаружено, что в случае низкого дооперационного уровня тромбоцитарной секреции выброс β-ТГ при операции был значительно более интенсивным, чем при высоком дооперационном уровне высвобождения данного белка: 35,6 [10, 5; 78, 0] МЕ/мл и 19,0 [0; 41, 3] МЕ/мл в группах НТГ и ВТГ соответственно (р=0,027).

В результате различий в секреции β-ТГ в ответ на хирургическую операцию по окончании ЭТС происходит нивелирование уровней данного белка в крови в обеих группах. Выравнивание концентраций β-ТГ в группах по окончании операции можно объяснить тем, что пул данного белка в гранулах ограничен и сопоставим по количеству у всех пациентов, включённых в исследование, различия касались лишь способа и скорости его высвобождения.

Ранее было выявлено, что кинетика и степень экзоцитоза тромбоцитов варьируют [19]. В недавно опубликованной работе K. Karolczak и соавт. (2021) было показано, что белки α-гранул могут высвобождаться разными способами и в течение различных отрезков времени [20].

С 1-х суток после операции на фоне постепенного снижения концентрации β-ТГ в крови различия между группами вновь становятся значимыми (см. рис. 1). Это может свидетельствовать о сохранении исходной тромбоцитарной неоднородности даже после мощного хирургического воздействия на организм. Ограничение данного исследования — невозможность установить, связана данная неоднородность с генетическими факторами либо с особенностями течения заболевания, что требует дальнейшего исследования.

В нашем исследовании выраженность секреторной активности тромбоцитов не зависела от пола и возраста (см. табл. 1). Для пациентов, имеющих тяжёлый артроз тазобедренного сустава, тяжесть патологии, по-видимому, становится ведущим фактором, определяющим степень положительного праймирования тромбоцитов. Это наблюдение согласуется с данными, полученными ранее в работе B. Savage и соавт., где было показано, что различия в содержании α-гранул тромбоцитов не были следствием возрастных изменений [21], а также в работе G. Weibrich и соавт., которая доказывала, что ни возраст, ни пол не влияют на уровни высвобождения факторов роста, продуцируемых тромбоцитами [22].

Эффективность репаративной регенерации после травмирования тканей, в том числе и после крупных хирургических вмешательств, во многом определяется наличием оптимального уровня факторов роста и молекул, обеспечивающих привлечение, пролиферацию, дифференциацию стволовых клеток [23]. В α-гранулах тромбоцитов содержатся все основные факторы роста, поэтому важно понимать, каков уровень секреции из данных гранул, не только в период формирования сгустка, но и в более позднем послеоперационном периоде. Наше исследование показало, что повышенный уровень секреции сохраняется не менее 2 нед после операции (см. рис. 1).

Важно подчеркнуть, что активность послеоперационного высвобождения α-гранул в значительной степени определяется исходной активностью секреции, что позволяет предположить возможность определения специфических тромбоцитарных белков для прогнозирования течения репарационных процессов при крупных ортопедических хирургических вмешательствах.

Динамика количества циркулирующих тромбоцитов после ЭТС отличается от динамики секреции β-ТГ (рис. 2).

Количество тромбоцитов снижается в раннем послеоперационном периоде и повышается с 7-х послеоперационных суток (критерий Фридмана p <0,001 для обеих групп). До операции значимых различий между группами нет, в раннем послеоперационном периоде большее количество тромбоцитов зарегистрировано в группе ВТГ. С 1-х суток количество тромбоцитов в крови вновь не имеет значимых различий между группами (см. рис. 2). Корреляционной связи между количеством тромбоцитов и уровнем β-ТГ в крови не обнаружено ни в одной из временных точек.

 

Рис. 2. Концентрация тромбоцитов в крови при эндопротезировании тазобедренного сустава. Результаты представлены как медиана [интерквартильный размах]; *различия между группами имеют статистическую значимость (p <0,05 в тесте Манна–Уитни); НТГ — группа с низким уровнем β-тромбоглобулина, ВТГ — группа с высоким уровнем β-тромбоглобулина

 

Таким образом, уровень секреции β-ТГ тромбоцитами ни до, ни после ЭТС не связан с их количеством. Отсутствие связи между количеством тромбоцитов и концентрацией высвобождаемого ими β-ТГ в крови подтверждает положение о наличии у разных людей различных популяционных спектров тромбоцитов, обладающих различными секреторной активностью и степенью активации в ответ на патологические воздействия. В настоящее время доказано, что и в норме, и при патологии можно выделить популяции тромбоцитов с разными спектрами ответа в гемостатических и сосудистых процессах [14, 15].

Исходное повышение концентрации β-ТГ в крови ассоциировано с повышенным уровнем маркёра фибринообразования D-димера, а также со скоростью латентного периода формирования сгустка крови, которую отражает тромбоэластографический показатель R (табл. 2). Ассоциированность более высокой исходной концентрации β-ТГ с более высоким уровнем D-димера, отражающего активность формирования фибрина, а также со скоростью начального этапа процесса свёртывания крови свидетельствует о наличии существенной связи между дооперационной активностью секреции тромбоцитами компонентов α-гранул и коагуляционной активностью у обследованных пациентов.

 

Таблица 2. Коагуляционные показатели до и после эндопротезирования тазобедренного сустава

Показатель	Группа	До операции	После операции
			Через 30 мин	1-е сутки	3-и сутки	7-е сутки	14-е сутки
D-димер, нг/мл	НТГ	79 [37; 123]	945 [488; 1496]	1025 [500; 2380]	364 [266; 648]	1540 [1111; 2232]	1650 [1018; 2448]
	ВТГ	132 [73; 191]*	1020 [505;1815]	1202 [612;1589]	408 [266; 644]	1430 [842; 2483]	1995 [1061; 576]
	p	0,024	0,655	0,957	0,875	0,728	0,398
R, мин	НТГ	15,5 [13, 0; 18, 1]	12,9 [9, 3; 16, 5]	15,1 [12, 4; 20, 2]	14,1 [9, 6; 19, 0]	15,1 [11, 2; 21, 2]	17,1 [12, 5; 20, 0]
	ВТГ	13,7 [11, 5; 15, 3]*	11,7 [9, 7; 15, 1]	13,0 [10, 7; 16, 2]	11,7 [9, 6; 15, 3]	12,5 [9, 2; 17, 8]	17,0 [10, 1; 22, 3]
МА, мм	НТГ	56,5 [51, 0; 59, 4]	57,6 [52, 5; 59, 9]	61,2 [58, 7;64, 8]	70,1 [66, 5; 73, 0]	70,6 [68, 8; 73, 3]	67,7 [63, 0; 72, 2]
	ВТГ	54,2 [49, 9; 59, 2]	57,8 [52, 2; 60, 0]	59,0 [56, 5; 62, 0]	66,3 [64, 0; 70, 3]	71,6 [67, 8; 73, 2]	68,0 [63, 8; 71, 1]
	p	0,048	0,555	0,327	0,234	0,237	0,900

Примечание: результаты представлены как медиана [интерквартильный размах]; *различия между группами имеют статистическую значимость (p <0,05 в тесте Манна–Уитни); НТГ — группа с низким уровнем β-тромбоглобулина; ВТГ — группа с высоким уровнем β-тромбоглобулина.

 

Хирургическая операция индуцирует мощную активацию коагуляционного процесса даже на фоне применения антикоагулянтов [24]. В данном исследовании мы также обнаружили резкое повышение концентрации D-димера в крови (критерий Фридмана, p <0,001), сокращение латентного периода (до достижения уровня детекции) формирования сгустка крови (тромбоэластографический показатель R, критерий Фридмана, p <0,05), повышение плотности сгустка (тромбоэластографический показатель МА, критерий Фридмана, p <0,05) (см. табл. 2). В послеоперационном периоде различия по данным показателям между группами были, но статистической значимости не достигали; возможно, это связано с их значительной вариабельностью.

Высокую вариабельность концентрации D-димера можно объяснить тем, что данный показатель отражает два процесса: образование фибрина и его плазминовую деградацию [25]. Вариабельность тромбоэластографических показателей также, по-видимому, определяется многофакторным влиянием на параметры формирования сгустка [18].

Корреляционная связь между уровнем β-ТГ и концентрацией D-димера в крови обнаружена в самом раннем послеоперационном периоде (через 30 мин после операции): коэффициенты корреляции Спирмена в группах НТГ и ВТГ — r=0,575 (p <0,01) и r=0,481 (p <0,02) соответственно. Значимой корреляционной связи между количеством тромбоцитов и концентрацией D-димера в крови не выявлено, коэффициенты корреляции Спирмена в группах НТГ и ВТГ — r=0,065 и r=0,187 соответственно.

В то же время по окончании операции обнаружена корреляционная связь между количеством тромбоцитов и показателем МА: коэффициенты корреляции Спирмена в группах НТГ и ВТГ — r=0,391 (p <0,05) и r=0,467 (p <0,04) соответственно.

Данные корреляционного анализа позволяют сделать заключение, что в раннем послеоперационном периоде количество образующегося фибрина в большей степени связано с интенсивностью высвобождения компонентов гранул, тогда как прочность формирующейся фибриновой матрицы будет в большей мере определяться количеством тромбоцитов.

Наличие выявленной нами в раннем послеоперационном периоде связи активности фибринообразования с уровнем специфического компонента α-гранул, а параметров прочности сгустка — с количеством тромбоцитов свидетельствует о важности как количества, так и функциональной активности тромбоцитов для эффективного формирования сгустков, которые не только купируют кровопотерю, но и служат первичной матрицей для процесса регенерации [26].

Сравнение интраоперационной кровопотери в двух изучаемых группах пациентов показало, что потеря крови была выше в группе НТГ по сравнению с группой ВТГ: 350 [250; 550] мл и 250 [200; 400] мл соответственно (p=0,031). Общая кровопотеря также была больше в группе НТГ, чем в группе ВТГ: 850 [550; 1050] мл и 600 [500; 850] мл соответственно (p=0,041).

Исходное количество тромбоцитов было сходным в обеих группах, но в группе ВТГ была выше их предоперационная активация с выходом компонентов α-гранул. Можно предположить, что у пациентов, нуждающихся в ЭТС, дооперационное положительное праймирование тромбоцитов совместно с повышенной коагуляционной активностью, с одной стороны, приводит к частичному истощению секреторного пула циркулирующих тромбоцитов с выходом компонентов α-гранул в кровоток, с другой стороны, создаёт более благоприятные условия для срочного формирования сгустков в условиях массивного повреждения сосудов при хирургической операции и обеспечивает меньшую потерю крови.

Выводы

1. У пациентов, нуждающихся в тотальной замене тазобедренного сустава, коагуляционный потенциал крови имеет прямую связь с активностью высвобождения α-гранул тромбоцитов: при усилении секреции повышается активность фибринообразования, сокращается латентный период формирования сгустка.
2. При эндопротезировании тазобедренного сустава уровень специфического белка α-гранул тромбоцитов β-тромбоглобулина коррелирует с продолжительностью латентного периода формирования сгустка и интенсивностью фибринообразования. Активность секреторной активности тромбоцитов оказывает влияние на объём кровопотери.
3. Послеоперационная активность высвобождения α-гранул имеет зависимость от исходного уровня секреции. Содержание в данных гранулах основных факторов роста даёт основание предположить возможность прогнозирования не только потери крови, но и течения репарационного процесса с использованием тромбоцитарных маркёров у пациентов, нуждающихся в протезировании крупных суставов, что требует дальнейших исследований.

 

Участие авторов. И.П.А. — планирование, сбор и анализ результатов; Б.Г.Ю. — планирование, анализ и обсуждение результатов; С.М.К. — руководитель работы.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке государственного задания «Разработка технологий применения аутологичных биоматериалов из тромбоцитарной массы в качестве оптимизирующей среды для улучшения процессов остеорегенерации и остеоинтеграции при хирургическом лечении костных дефектов, несращений и нестабильности имплантатов у больных травматолого-ортопедического и онкологического профиля», номер регистрации 121031900054-8 от 2021 г.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии интересов по представленной статье.

Об авторах

Ирина Петровна Антропова

Уральский государственный медицинский университет; Институт высокотемпературной электрохимии Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: aip.hemolab@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9957-2505

докт. биол. наук, вед. науч. сотруд., ФГБОУ ВО Уральский ГМУ Минздрава России; зав., лаборатория медицинского материаловедения и биокерамики, Институт высокотемпературной электрохимии, УрО РАН

Россия, г. Екатеринбург, Россия; г. Екатеринбург, Россия

Борис Германович Юшков

Уральский государственный медицинский университет; Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук

Email: b.yushkov@iip.uran.ru
ORCID iD: 0000-0001-8780-9889

чл.-кор. РАН, проф., зав., лаборатория иммунофизиологии и иммунофармакологии, Институт иммунологии и физиологии УрО РАН; проф., каф. патологической физиологии, ФГБОУ ВО Уральский ГМУ Минздрава России

Россия, г. Екатеринбург, Россия; г. Екатеринбург, Россия

Сергей Михайлович Кутепов

Уральский государственный медицинский университет

Email: kcm@usma.ru
ORCID iD: 0000-0002-3069-8150

чл.-кор. РАН, проф., главн. науч. сотруд., ФГБОУ ВО Уральский ГМУ Мин­здрава России

Россия, г. Екатеринбург, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы