Fibronectin content and cellular composition of peritoneal exudate in peritonitis

Full Text

Не отрицая большого значения общей резистентности организма при перитоните, в последнее время многие исследователи склонны рассматривать перитонит как разновидность местного воспаления с вытекающими из такого подхода новыми патогенетическими и терапевтическими концепциями [8]. Известно, что течение и исход микробного воспаления в значительной степени определяются выраженностью местной противомикробной защиты, которая обусловлена прежде всего антибактериальными свойствами воспалительного экссудата. Среди реакций обезвреживания бактерий ведующую роль отводят фагоцитозу, протекающему при участии нейтрофилов и макрофагов. Эффективность фагоцитоза, в свою очередь, зависит, во-первых, от количества и качества (то есть функционального состояния) фагоцитирующих клеток и, во-вторых, от активности гуморальных факторов фагоцитоза, называемых опсонинами. К числу главных опсонинов относят иммуноглобулины и СЗ-компонент комплемента. В последние годы в группу неспецифических опсонинов широкого спектра действия включают также фибронектин (ФН) [3]. Несмотря на некоторую противоречивость мнений о механизме его действия, роль фибронектина в противомикробной защите и воспалении не вызывает у исследователей никаких сомнений.

Думается, что эти общие положения могут быть применимы и в случае такого выраженного бактериального воспаления как перитонит. Есть веские основания считать, что наряду с клеточными элементами перитонеального экссудата и другими опсонинами, фибронектин может влиять на течение и исход перитонита. Это предположение получило косвенное подтверждение в единичных работах по изучению связи между уровнем данного белка в крови и течением воспаления брюшины [13, 17]. Если такая связь действительно существует, то содержание фибронектина в экссудате (вместе с данными о клеточном составе) может иметь не только патогенетическое, но и прогностическое значение, определяя напряженность фагоцитарной реакции и вероятность затяжного или осложненного течения перитонита.

Целью настоящей работы было динамическое изучение содержания фибронектина и клеточного состава перитонеального экссудата в зависимости от клинических форм, стадий и вариантов течения перитонита.

Обследовано 66 больных перитонитом различной распространенности: с местным— у 40, с разлитым — у 26. Возраст больных колебался от 15 до 79 лет. Мужчин было 30, женщин — 36. Перитонит был вызван острым аппендицитом (35), острым холециститом (9), перфоративной язвой желудка или двенадцатиперстной кишки (10) и травмой живота (12). В реактивной стадии перитонита обследовано 33 пациента, в токсической — также 33. Умерли 5 больных. Причинами смерти были неразрешившийся перитонит (у 3) и острая почечная недостаточность (у 2). Все больные были прооперированы. После устранения причины перитонита производили санацию и дренирование брюшной полости. Больным в послеоперационном периоде проводили комплексное лечение: назначали антибиотики, кардиальные средства, корректировали водно-электролитный баланс, по показаниям выполняли хирургическую детоксикацию (плазмаферез, гемосорбция).

Исследования осуществляли в динамике на 1, 2, 3 и 5-й дни после операции. Перитонеальный экссудат брали в 1-й день из брюшной полости во время операции, в последующие дни — через дренажи. Сразу после взятия экссудат центрифугировали при 2000 об./мин в течение 30 мин при комнатной температуре. Из осадка готовили мазки для подсчета форменных элементов. Изучали процентное содержание нейтрофилов, лимфоцитов и макрофагов в расчете не менее чем на 200 клеток. Наряду с относительным содержанием разных клеток, рассчитывали лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) по следующей формуле:

$\mathrm{ЛИИ}=\frac{4•ми+2•n+c+3•ю+4•cn• (\mathrm{пл}. \mathrm{кл}.+1)}{(э+1)•л•м}$,

где ми, п, с, ю, сп — относительное содержание (%) соответственно миелоцитов, палочкоядерных, сегментоядерных, юных нейтрофилов; пл. кл.— доля плазматических клеток (активированных лимфоцитов), э, л, м — доля эозинофилов, лимфоцитов и макрофагов.

Выражение для расчета ЛИИ представляет собой формулу Кальф-Калифа [2], предложенную им для крови и модифицированную нами для перитонеального экссудата. Значение ЛИИ состоит в том, что он характеризует качественный состав клеточных элементов и отражает степень их токсического раздражения и повреждения.

Надосадочную жидкость (0,5 мл) стабилизировали добавлением 10% оксалата натрия (0,1 мл) и замораживали при температуре не выше —10° С до момента исследования. Содержание иммунореактивного растворимого фибронектина в экссудате определяли иммуноферментным методом с помощью аффинных кроличьих антител к фибронектину человека, конъюгированных с пероксидазой. Для иммунизации и калибровки использовали фибронектин из плазмы крови человека, полученный аффинной хроматографией на желатин-целлюлозе с последующей доочисткой на ДЕАЕ-целлюлозе. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента на ЭВМ «Электроника ДЗ-28».

Результаты динамического исследования количества нейтрофилов, ЛИИ и уровня фибронектина в перитонеальном экссудате при местном и разлитом перитоните представлены на рисунке.

 

 

Рис. 1. Изменение содержания фибронектина, полиморфноядерные лейкоциты и ЛИИ перитонеального экссудата при местном (а) и разлитом перитоните (б) с благополучным исходом.

 

Из гистограмм видно, что как при местном, так и при разлитом перитоните на фоне неосложненного течения происходят прогрессивное снижение количества нейтрофилов и связанное с ним уменьшение значений ЛИИ (коэффициент корреляции между ними равен 0,76 при местном и 0,90 при разлитом перитоните). Несколько иначе изменяется концентрация фибронектина в экссудате: в день операции, то есть на высоте воспалений его концентрация максимальна, на 2-й день, она снижается, на 3-й — вновь возрастает, не достигая первоначальных величин, а к 5-му дню снова уменьшается. Несмотря на различную динамику, корреляция уровня фибронектина с содержанием нейтрофилов выражена отчетливо (r=0,61), что позволяет предполагать существование взаимосвязи между этим белком и нейтрофилами при перитоните.

Приведенное описание динамики содержания нейтрофилов, ЛИИ и уровня фибронектина в экссудате характерно для неосложненного течения перитонита, когда к 5-му дню после операции наблюдаются стихание воспаления и уменьшение токсического синдрома. Однако в тех случаях, когда течение перитонита, несмотря на проводимое лечение, осложняется или прогрессирует, изучаемые показатели имеют аномально высокие значения. В группе из 7 больных с внутрибрюшными гнойными осложнениями содержание нейтрофилов на 5-й день после операции составляло в среднем 72,5+4,5%, значение ЛИИ— 15,1±2,4, уровень фибронектина — 275,0±29,8 мкг/мл, что достоверно превышало соответствующие значения группе больных с неосложненным течением разлитого перитонита (содержание нейтрофилов — 51,5±2,7%, фибронектина — 40,4±14,9 мкг/мл, ЛИИ — 4,46±0,62; лимфоциты встречались редко, макрофаги не обнаруживались совсем).

Существенные отличия изучаемых параметров были выявлены в зависимости от стадии перитонита (см. табл.). В токсической стадии клеточный состав характеризовался, во-первых, резким снижением доли лимфоцитов и сопряженным с ним увеличением относительного содержания нейтрофилов, во-вторых, появлением макрофагов, которые в реактивной стадии воспаления не обнаруживались. Рост числа нейтрофилов являлся, скорее всего, не абсолютным, а относительным и вряд ли указывал на возрастание роли нейтрофилов в токсической стадии перитонита. Что же касается появления макрофагов в экссудате, то оно, без сомнения, имело абсолютный характер и должно рассматриваться как благоприятный признак, поскольку именно макрофагам принадлежит ведущая роль в детоксикации, то есть элиминации фрагментов клеток и тканей и других патологических микрочастиц, образующихся на реактивной стадии перитонита [10]. Важно отметить, что в токсической стадии параллельно изменению клеточного состава существенно возрастал уровень фибронектина в экссудате. Если пик его концентрации в реактивной стадии совпадал с максимальным содержанием нейтрофилов, то в токсической стадии — с появлением макрофагов, что определенно свидетельствовало о непосредственном отношении фибронектина к реакциям фагоцитоза при перитоните.

 

Таблица. Содержание фибронектина и клоточный состав перитонеального экссудата в зависимости от стадии перитонита.

Изучаемые параметры	Стадии перитонита		Р
	реактивная	токсическая
Нейтрофилы, %	56,3±3,9	76,6±2,0	<0,05
ЛИИ	6,6±1,2	16,2±1,2	<0,05
Лимфоциты, %	43,0±4,0	21,9±1,2	<0,05
Макрофаги, %	0	3,4±1;	<0,05
ФН, мкг/мл	54,5±13,8	182,6±29,9	<0,05

 

Обсуждение и интерпретация полученных результатов возможны в двух аспектах: теоретическом и прикладном.

Патофизиологическая сторона вопроса сводится к роли фибронектина и фагоцитов в патогенезе перитонита. Полученные данные подтверждают известное существование тесных функциональных взаимосвязей между фибронектином и фагоцитами (как нейтрофилами, так и макрофагами) и, следовательно, указывают на специфическое участие этого белка в реакциях фагоцитоза, протекающих в брюшной полости при перитоните. Нужно подчеркнуть, что в разных фазах перитонита фагоцитоз направлен на разные объекты и осуществляется различными клетками. В частности, в фазе альтерации и ранней экссудации (которые по срокам развития примерно соответствуют реактивной стадии перитонита) фагоцитоз направлен преимущественно против микроорганизмов, вызвавших воспаление, и осуществляется почти исключительно нейтрофилами. Поскольку фибронектин способен стимулировать фагоцитоз бактерий нейтрофилами in vitro [11, 16] благодаря наличию рецепторов к фибронектину [1], можно предполагать, что фибронектин участвует в данном процессе и в том случае, если фагоцитоз протекает в брюшной полости. В пользу этого свидетельствует высокая степень корреляции между содержанием нейтрофилов и фибронектина в экссудате, особенно отчетливо проявляющаяся в первые сутки после операции, то есть в разгаре воспаления. Очевидно, фибронектин и нейтрофилы имеют общий источник — кровь, откуда они проникают в очаг воспаления — брюшную полость. Впрочем, не исключено, что часть фибронектина может синтезироваться нейтрофилами in situ, поскольку они обладают такой способностью [12]. В любом случае достаточно высокая локальная концентрация фибронектина в экссудативной фазе перитонита повышает напряженность фагоцитоза и антибактериальную активность «первой линии защиты», какими являются брюшина и перитонеальный экссудат.

Способность фибронектина взаимодействовать с микроорганизмами имеет еще одно следствие, не связанное с фагоцитозом: фибронектин вызывает прикрепление бактерий к тканям в месте их проникновения в организм, что некоторые авторы рассматривают как благоприятный фактор, препятствующий диссеминации инфекта и ограничивающий область воспаления. Другие, напротив, считают такое взаимодействие нежелательным, так как оно способствует пенетрации бактерий в ткани и усиливает их патогенность. Действительно, обнаруживается прямая связь между способностью микробов связывать фибронектин и их инвазивностью [15]. Эта дилемма особенно актуальна для перитонита и однозначного решения пока не имеет. Однако, по нашим сведениям, уровень фибронектина в экссудате при местном перитоните отчетливо выше на всех сроках исследования (рис. а, б), что косвенно свидетельствует в пользу его положительной локализующей роли. Разумеется, данное заключение имеет сугубо предварительный характер, однако вопрос настолько важен, что заслуживает специального изучения.

На 2-й день после операции уровень фибронектина в экссудате уменьшается, что, по нашему мнению, объясняется его потреблением и (или) разрушением под действием протеаз. Потребление предполагает связывание фибронектина с микробами, тканевым детритом, погибшими нейтрофилами, другими клетками и их фрагментами, которые осаждаются при центрифугировании экссудата. Кроме того, фибронектин может вступать в комплексообразование со многими растворимыми биополимерами, образующимися при воспалении, нейтрализуя их, осаждая и препятствуя всасыванию через брюшину. При этом все, с чем связывается фибронектин в экссудате,— это опсонизируемые им потенциальные объекты фагоцитоза.

Особый интерес представляет возможность разрушения фибронектина под действием протеолитических ферментов гноя, активность которых очень высока [7]. Значение расщепления фибронектина состоит в том, что образующиеся фрагменты его молекул обладают не менее, а иногда и более выраженной биологической активностью, чем интактный фибронектин [9]. Среди разнообразных биологических свойств фрагментов фибронектина с точки зрения патогенеза перитонита самым важным является то, что они служат положительными хемотаксинами (хемоаттрактантами) для моноцитов [14]. Другими словами, моноциты мигрируют к месту наибольшей концентрации продуктов расщепления фибронектина, то есть в эпицентр воспаления. Если все это происходит при перитоните, то фибронектин и его фрагменты, наряду с другими хемотаксинами, подготавливают и обеспечивают выход в экссудат моноцитов и их трансформацию в перитонеальные макрофаги. С этого времени начинается принципиально новый этап патологического процесса: идет борьба не с причиной, а с последствиями воспаления. Происходят элиминация и разрушение всевозможных патологических микрочастиц, образовавшихся на предыдущей стадии и обладающих токсическим действием на организм, то есть детоксикация. Удалению с помощью макрофагов подлежат и погибшие нейтрофилы, которые превращаются из субъекта в объект фагоцитоза. Содержание фибронектина в экссудате вновь возрастает, достигая в отдельных случаях первоначальных значений и даже их превышая. При этом, как нам кажется, макрофаги становятся основным источником фибронектина, так как они могут синтезировать и секретировать его в большом количестве [18]. Маловероятно, чтобы источником фибронектина была кровь, так как к этому времени объем экссудации уменьшается. В токсической стадии перитонита фибронектин проявляет себя как неспецифический, неиммунный, небактериальный опсонин, поскольку он связывается с самыми разнообразными макромолекулами и надмолекулярными образованиями, стимулируя их взаимодействие с макрофагами, опять благодаря наличию на их поверхности цепторов к фибронектину [5]. Возможно в данной стадии, когда микробные тела в основном разрушены и удалены, фибронектин становится ведущим, если не единственным, гуморальным фактором фагоцитоза, поскольку иммуноглобулины и комплемент с неантигенными частицами не взаимодействуют.

По мере стихания воспалительного процесса, исчезновения из экссудата клеточных элементов, изменения его характера с гнойного на серозный и уменьшения объема экссудации, постепенно исчезают источники «перитонеального» фибронектина и его концентрация прогрессивно падает. В противном случае, когда экссудативная фаза перитонита затягивается и процесс приобретает осложненное или затяжное течение, уровень фибронектина в экссудате сохраняется высоким и колеблется в зависимости от соотношения процессов его экссудации, местного синтеза, потребления в результате связывания и расщепления. Такой в самых общих чертах представляется роль фибронектина и фагоцитов в патогенезе инфекционного воспаления брюшины.

Существуют и другие, сугубо практические вопросы, вытекающие из проведенного исследования. Можно ли использовать определение уровня фибронектина в экссудате и изучение его клеточного состава для оценки характера воспаления и степени его тяжести? Позволяют ли эти показатели прогнозировать развитие внутрибрюшных осложнений или помочь в их ранней диагностике? Наконец, дают ли полученные результаты основание для новых подходов к патогенетической терапии перитонита?

При сравнении средних величин содержания нейтрофилов и значения ЛИИ в экссудате при местном и разлитом перитоните (см. рис.) оказывалось, что различия между ними недостоверны. Другими словами, данные параметры мало зависят от площади поражения брюшины и объема экссудации. Что касается содержания фибронектина, то оно выше при местном, чем при разлитом перитоните, особенно на 3-й день после операции. Такое различие, как отмечалось, возможно, указывает на локализующую функцию фибронектина при воспалении брюшины, однако это обстоятельство может быть следствием не ограничения перитонита, а снижения уровня фибронектина в результате более выраженного связывания и разрушения. В любом случае складывается впечатление, что чем выше уровень фибронектина в экссудате в разгаре перитонита (первые 1–3 дня после операции), тем более благоприятно его клиническое течение. Однако ценность этого общего заключения существенно снижается тем, что мы не можем отчетливо обозначить абсолютный уровень, фибронектина в экссудате, отклонение от которого в ту или иную сторону в каждом конкретном случае можно было бы расценить как хороший или плохой признак. С этой точки зрения однократное определение концентрации фибронектина в экссудате (как и количества нейтрофилов) само по себе не позволяет сделать вывод о характере воспаления и его выраженности.

Другое дело, если указанные параметры определяются в динамике на протяжении всего острого периода перитонита. Поскольку неосложненное течение характеризуется закономерными изменениями количества нейтрофилов и содержания фибронектина в экссудате, отклонение от этой закономерности будет указывать на аномальное течение заболевания. По нашим данным, при неосложненном течении разлитого перитонита количество нейтрофилов в экссудате на 5-й день после операции составляло в среднем 70% от его значения на 1-й день, показатель ЛИИ — около 25%, а содержание фибронектина — порядка 30%. Видимо, эти цифры можно считать нормой (впрочем, очень приблизительной), отклонение от которой свидетельствует об осложненном или прогрессирующем течении перитонита, если понятие нормы вообще применимо в данном случае. Не абсолютизируя приведенные цифры, важно подчеркнуть, что речь идет о снижении значений изучаемых параметров в динамике от 1 к 5-му дню после операции. Как показывают наши исследования, при гнойных внутрибрюшных осложнениях перитонита среднее количество нейтрофилов и значение ЛИИ на 5-й день после операции не отличаются от их значений в 1-й день, а концентрация фибронектина превышает первоначальные величины почти в 2 раза. Иначе говоря, при осложненном течении перитонита, в отличие от неосложненного, на 5-й день после операции количество фагоцитов и уровень фибронектина в экссудате по сравнению с таковыми в 1-й день не уменьшаются или увеличиваются. Такой вывод позволяет считать динамику содержания фибронектина и клеточного состава перитонеального экссудата прогностическими показателями, указывающими на угрозу осложненного или прогрессирующего течения острого разлитого перитонита. Конечно, эти параметры ни в коей мере не заменяют, а лишь дополняют другие известные клинические и лабораторные признаки неблагоприятного течения перитонита.

Полученные данные представляют интерес для клиницистов еще в одном аспекте. Известно, что деление перитонита на реактивную и токсическую стадии имеет не вполне отчетливые критерии и проводится с помощью труднодоступных физиологических методов исследования [8]. Между тем диагностика стадий, особенно определение момента перехода реактивной в токсическую, поможет хирургу выбрать наиболее рациональные методы лечения. При сравнении клеточного состава перитонеального экссудата в реактивной и токсической стадиях нами выявлен веский дифференциальнодиагностический признак: появление в составе экссудата перитонеальных макрофагов. Мы считаем этот симптом решающим, так как другие характерные для токсической стадии изменения (уменьшение доли нейтрофилов, увеличение содержания лимфоцитов, ЛИИ и уровня фибронектина) носят не качественный, а количественный характер, что затрудняет их использование в диагностических целях в каждом конкретном случае. В отличие от этих параметров, отсутствие в экссудате макрофагов в реактивной стадии и их появление в токсической служат надежным и достоверным критерием перехода воспаления из одной стадии в другую. Обнаружение макрофагов в экссудате информативно еще и потому, что их возникновение показывает включение в процесс воспаления нового мощного инструмента детоксикации — клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Что касается других изменений клеточного состава и увеличения концентрации фибронектина, то они могут иметь вспомогательное значение для распознавания токсической стадии перитонита в сочетании с поиском макрофагов в перитонеальном экссудате.

Совокупность полученных результатов убедительно свидетельствует о большой роли фибронектина и фагоцитов в реакциях воспаления брюшины и наводит на мысль о возможности их искусственного регулирования путем экзогенного воздействия на процесс воспаления в брюшной полости. Реальная перспектива создания отечественных препаратов фибронектина [4] позволяет их использовать для лечения перитонита. В отличие от швейцарских авторов [13], которые предприняли небезуспешную попытку лечить перитонит внутривенным введением фибронектина, мы считаем перспективным местное интраперитонеальное его применение. Не исключено, что, как и в случае стимуляции заживления ран введением экзогенного фибронектина, наиболее эффективным будет его комбинированное использование [6].

ВЫВОДЫ

1. Изменения клеточного состава и уровня фибронектина в перитонеальном экссудате в динамике неосложненного перитонита (как местного, так и разлитого) имеют закономерный характер и коррелируют между собой: относительное содержание нейтрофилов максимально в разгаре воспаления (в день операции), затем оно прогрессивно уменьшается, достигая к 5-му дню в среднем 70% от первоначального значения. Аналогично изменяется и концентрация фибронектина с той разницей, что она уменьшается волнообразно и достигает к 5-му дню в среднем 30% от первоначального уровня.

2. При осложненном и прогрессирующем течении разлитого перитонита описанный характер изменений клеточного состава и концентрации фибронектина нарушается: относительное содержание нейтрофилов на 5-й день после операции в среднем не отличается от исходного уровня, а содержание фибронектина превышает их почти в 2 раза, что позволяет использовать эти параметры для прогнозирования и ранней диагностики осложнений острого перитонита.

3. Содержание фибронектина и клеточный состав перитонеального экссудата существенно зависят от стадии перитонита: при переходе из реактивной стадии в токсическую в экссудате появляются макрофаги, уменьшается доля лимфоцитов и соответственно возрастает доля нейтрофилов, существенно увеличивается концентрация фибронектина.

About the authors

O. S. Kochnev

Lenin Kazan Institute for Advanced Medical Training; Kurashov Kazan Order of the Red Banner of Labor Medical Institute; Kazan Research Institute

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan; Kazan; Kazan

N. A. Veliyev

Lenin Kazan Institute for Advanced Medical Training; Kurashov Kazan Order of the Red Banner of Labor Medical Institute; Kazan Research Institute

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan; Kazan; Kazan

A. F. Harrasov

Lenin Kazan Institute for Advanced Medical Training; Kurashov Kazan Order of the Red Banner of Labor Medical Institute; Kazan Research Institute

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan; Kazan; Kazan

R. I. Litvinov

Lenin Kazan Institute for Advanced Medical Training; Kurashov Kazan Order of the Red Banner of Labor Medical Institute; Kazan Research Institute

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan; Kazan; Kazan

O. D. Zinkevich

Lenin Kazan Institute for Advanced Medical Training; Kurashov Kazan Order of the Red Banner of Labor Medical Institute; Kazan Research Institute

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan; Kazan; Kazan

References

Supplementary files