ДНК-цитометрические характеристики рецидивных сарком мягких тканей
- Авторы: Непомнящая Е.М.1, Ульянова Е.П.1, Новикова И.А.1, Селютина О.Н.1, Златник Е.Ю.1, Алиев Т.А.1, Ващенко Л.Н.1, Аушева Т.В.1, Андрейко Е.А.1, Золотарёва Е.И.1, Бондаренко Е.С.1
-
Учреждения:
- Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
- Выпуск: Том 99, № 3 (2018)
- Страницы: 415-420
- Тип: Теоретическая и клиническая медицина
- Статья получена: 28.05.2018
- Статья опубликована: 15.06.2018
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/8893
- DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2018-415
- ID: 8893
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель. Определить содержание дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и распределение клеток по фазам митотического цикла для оценки злокачественности процесса у пациентов с рецидивными саркомами мягких тканей.
Методы. Материалом исследования служила опухоль больных рецидивными саркомами мягких тканей. Методы исследования включали гистологический, ДНК-цитометрический, статистический.
Результаты. В зависимости от степени дифференцировки опухоли и стадии опухолевого процесса установлены различия в пролиферативной активности и индексе пролиферации рецидивных сарком. В каждой группе и между группами определены различия количества диплоидных, анеуплоидных и полиплоидных клеток в зависимости от фаз клеточного цикла. Параметры клеточного цикла были следующими: в 100% наблюдений опухоли были диплоидными при G1 (высокой степени дифференцировки), на долю диплоидных опухолей при G2 (умеренной степени) приходилось 33,3%, при G3 (низкой степени) - 15%. Преобладающими при G2 и G3 были анеуплодные опухоли, доля которых составляла 66,7 и 85% соответственно. Анализ кинетических параметров клеточного цикла позволил установить снижение количества клеток в фазе G1/G0 клеточного цикла от G1 к G3, что сопровождалось статистически значимым повышением доли клеток в S-фазе (р ˂0,05).
Вывод. Проведённое ДНК-цитометрическое исследование параметров клеточного цикла показало высокий биологический потенциал в рецидивных саркомах мягких тканей, который определялся двумя показателями - долей клеток в G2+M-фазе и фактором клеточных потерь; при высокой степени дифференцировки (G1) опухоли были диплоидными в 100% наблюдений, при умеренной (G2) - в 33,3%, при низкой (G3) - в 15%, при G2 и G3 преобладали анеуплодные опухоли.
Полный текст
Саркомы мягких тканей (СМТ) относят к числу наиболее злокачественных и наименее изученных опухолей: на них приходится приблизительно 15% всех злокачественных новообразований. СМТ занимают 4-е место среди причин смертности при онкологических заболеваниях [1]. Это обстоятельство свидетельствует о низкой эффективности лечения.
Наиболее яркая клиническая черта СМТ — их способность к рецидивированию [2]. Многие авторы склонны считать развитие рецидивов после эксцизии опухоли скорее правилом, чем исключением, и, несмотря на значительные успехи в лечении СМТ, частота возникновения локальных рецидивов после иссечения первичной опухоли сопоставима с данными полувековой давности [3].
Во всех значительных исследованиях, посвящённых злокачественным опухолям мягких тканей, указывают на высокую частоту рецидивов, варьирующую в широких пределах — от 25 до 60%. В зависимости от характера лечения первичной опухоли и особенностей течения заболевания этот показатель может достигать 90% [4]. Более 80% всех рецидивов развиваются в первые 2 года после лечения первичной опухоли [5].
Склонность к частому рецидивированию обусловлена биологическими свойствами сарком: мультицентрическим характером роста, формированием псевдокапсулы опухоли без чётких границ со здоровыми окружающими тканями. Последнее обстоятельство затрудняет выполнение радикальных операций, так как опухоль в связи с инфильтративным ростом распространяется по межмышечным и периневральным пространствам [2]. Возникновение локального рецидива не является показателем неадекватности проведённого лечения.
Изменение структуры и биологических свойств, характера роста, чувствительности к различным методам терапии, а также высокий риск возникновения местных рецидивов после хирургического и комбинированного лечения определяют важность поиска принципиально новых методик.
Скорость роста вторичных очагов рассматривают как производное сочетания двух параметров: доли клеток паренхимы опухоли в состоянии митоза и процента клеточных потерь — фактора клеточных потерь (ФКП). Высокая скорость роста рецидивных и метастатических очагов СМТ может быть обусловлена низкими показателями ФКП. Митотическая активность этого вида опухолей в среднем невысокая. Однако сочетание этих двух показателей (доли клеток, находящихся в митозе, и ФКП) определяет высокую скорость роста данного вида опухолей [6].
Локальный рецидив развивается из клеток паренхимы опухоли, которые переместились из периферии опухолевого очага в окружающие опухоль ткани. Периферию опухоли составляют наиболее пролиферативно активные клетки [7].
Известно, что при различных патологических состояниях, в том числе злокачественных процессах, количество дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) не бывает одинаковым (диплоидным) и отклоняется от нормального содержания (анеуплоидия) в сторону уменьшения или увеличения.
В настоящее время исследуют способ прогнозирования течения опухолевого процесса при различных новообразо-
ваниях с использованием метода лазерной ДНК-проточной цитометрии [8–10]. В результате выявлено, что диплоидные опухоли имеют более благоприятное течение, чем анеуплоидные. Анеуплоидия — неблагоприятный признак, у таких больных выше частота рецидивов, короче период клинической ремиссии.
Методом ДНК-проточной цитометрии изучали содержание ДНК в опухолевых клетках при раке различных локализаций [11, 12]. Данный метод позволяет определить плоидность опухолевых клеток, количество анеуплоидных клеток в опухоли, распределение по фазам клеточного цикла и индекс пролиферации. Сопоставление с клиническими данными, а также известными факторами прогноза позволяет рассматривать данный показатель как независимый прогностический признак [10, 13]. Содержание ДНК в клетках и интенсивность клеточной пролиферации, темп деления опухолевых клеток являются важными составляющими, которые характеризуют агрессивность злокачественного процесса, биологические свойства опухоли и определяют течение заболевания [13].
Таким образом, изучение ДНК-цитометрических параметров опухоли перспективно в оценке прогноза заболевания, а также способствует индивидуализации лечения больных.
Ранее нами были изучены ДНК-цитометрические показатели первичных СМТ [14], поэтому целью данного исследования было определение содержания ДНК и распределения клеток по фазам митотического цикла у больных с рецидивными СМТ методом проточной цитометрии.
Изучено и проанализировано содержание ДНК в опухолевой ткани 30 пациентов с рецидивами СМТ. Поскольку для каждого гистологического подтипа сарком тенденция к метастазированию и рецидиву напрямую зависит от размера и степени злокачественности первичной опухоли, изначально было проведено распределение по гистологическому типу и локализации первичной опухоли. Сроки возникновения рецидивов составляли от 3 мес до 3 лет.
Основным методом лечения служил хирургический. В последующем его дополняли лучевой терапией в суммарной очаговой дозе от 40 до 50 Гр. В наблюдениях с низкодифференцированными и недифференцированными саркомами применяли курсы химиотерапии по общепринятым стандартам.
ДНК-исследование проводили на проточном цитометре FACS Canto II (Becton Dickinson, USA) с использованием Cycle TESTTMPLUS DNA ReagentKit. С помощью компьютерной программы ModFit LT обрабатывали полученные данные, анализируя плоидность и распределение клеток опухоли по фазам клеточного цикла.
Долю клеток с различным содержанием ДНК на гистограмме вычисляли как процент от общего числа исследованных клеток. Опухоль считали диплоидной, если выявлялся один пик, который соответствовал нормальному содержанию ДНК в ядрах клеток. При наличии пиков, отличающихся от диплоидного, опухоль расценивали как анеуплоидную. Для оценки степени анеуплоидии определяли индекс ДНК (ИДНК), который представляет собой соотношение между значением канала пика G0/G1 опухолевого образца и значением канала пика G0/G1 нормального (диплоидного) образца. ИДНК диплоидных клеток соответствовал 1,0, следовательно, ИДНК анеуплоидных клеток был больше или меньше 1,0. Индекс пролиферации вычисляли как суммарное число клеток опухоли, находящихся в S- и G2+М-фазах клеточного цикла. Верификацию опухолей осуществляли с помощью гистологического метода на светооптическом уровне.
Статистический анализ результатов исследования выполнен с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft, США), определяли t-критерий Стьюдента для независимых выборок.
По гистологическому типу первичных опухолей преобладали пациенты с липосаркомой — 12 (40%) человек. Плеоморфная саркома диагностирована у 9 (30%), лейомиосаркома — у 4 (13,3%), синовиальная саркома — у 3 (10%), злокачественная мезенхимома — у 2 (6,7%) человек. Распределение по локализации было следующим: у 20 (66,7%) пациентов первичная опухоль встречалась на нижних конечностях, у 9 (30%) — на верхних конечностях, у 1 (3,3%) — на туловище.
Изучение ДНК-цитометрических параметров в рецидивах СМТ выявило преобладание анеуплоидных опухолей в данной группе в 70% случаев (21 из 30 опухолей) — против 30% диплоидных (9 из 30). Среднее содержание анеуплоидных клеток в рецидивных опухолях составило 39,9±5,3%. В среднем ИДНК был равен 2,3±0,2. Отмечено отсутствие опухолей с ИДНК менее 1,0. Анеуплоидия в пределах митотического цикла (ИДНК=1,1–1,84) была выявлена в 52,4% случаев (11 из 21), в 19% отмечены тетраплоидные (ИДНК=1,85–2,15) опухоли (4 из 21), в 28,6% случаев — многоклоновые (6 из 21).
В целом для рецидивных опухолей характерными были высокое содержание доли клеток в G2+M-фазе клеточного цикла (5,2±1,1%), умеренные темпы пролиферации и индекс пролиферации (12,6±2,4 и 17,9±3,7% соответственно). Доля клеток в фазе G0/G1 составила 82,2±3,6%.
Достоверных различий значений параметров клеточного цикла диплоидных и анеуплоидных рецидивных СМТ выявлено не было, однако по темпам пролиферации и индексу пролиферации анеуплоидные опухоли в 1,3 и 1,6 раза превосходили диплоидные. Полученные данные представлены в ~~~~~~~~табл. 1.
Таблица 1. Распределение клеток по фазам клеточного цикла рецидивных диплоидных
и анеуплоидных сарком мягких тканей (%)
Тип опухоли | G0/G1-фаза клеточного цикла | G2+M-фаза клеточного цикла | S-фаза клеточного цикла | Индекс пролиферации |
Диплоидные опухоли | 88,9±4,5 | 1,8±0,5 | 10,1±4,3 | 11,9±4,1 |
Анеуплоидные опухоли | 81,1±4,1 | 5,4±2,2 | 13,5±2,7 | 19,1±3,4 |
Проведённый анализ параметров клеточного цикла рецидивных СМТ в зависимости от степени дифференцировки выявил в 100% случаев диплоидные опухоли при высокой степени дифференцировки (G1; 4 из 4). На долю диплоидных опухолей при G2 приходилось 33,3%, при G3 — 15%. При G2 и G3 преобладали анеуплоидные опухоли, которые составляли 66,7 и 85% соответственно. Среди анеуплоидных опухолей многоклоновые выявлены при G2 в 50% (2 из 4), при G3 — в 23,5% случаев (4 из 17). Тетраплоидные опухоли при G2 составляли 25% (1 из 4), при G3 — 17,6% (3 из 17).
Достоверных различий значений среднего содержания анеуплоидных клеток в рецидивных опухолях в зависимости от степени дифференцировки выявлено не было. При G2 они составили 36,9±5,9%, при G3 — 43,4±6,3%.
Анализ кинетики клеточного цикла позволил выявить ряд достоверных отличий в зависимости от степени дифференцировки рецидивных СМТ. Полученные результаты представлены в ~~~~~~~~табл. 2.
Таблица 2. Распределение клеток по фазам клеточного цикла рецидивных сарком мягких тканей в зависимости от различной степени дифференцировки (%)
Степень дифференцировки опухоли | G0/G1-фаза клеточного цикла | G2+M-фаза клеточного цикла | S-фаза клеточного цикла | Индекс пролиферации |
G1 | 95,6±6,4 | 2,03±0,9 | 2,39±1.2 | 4,42±1,6 |
G2 | 95,7±4,2 | 0,31±0,2 | 4,1±3,9 | 4,3±2,2 |
G3 | 81,9±3,9°↓ | 2,1±0,8°↑ | 16,2±3,8°↑*↑ | 18,4±3,7°↑*↑ |
Примечание: *различия показателей достоверны по отношению к G1 (p <0,001); °различия показателей достоверны по отношению к G2 (p <0,001).
При распределении клеток по фазам клеточного цикла в рецидивных СМТ высокой и умеренной степени дифференцировки не выявлено достоверных различий показателей, тогда как при G3 отмечены достоверные различия по всем проанализированным показателям. Так, рецидивные СМТ низкой степени дифференцировки (G3) характеризовались увеличением в 6,8 раза (р <0,001) и 4 раза (р <0,001) темпов пролиферации опухоли, повышением в 4,2 раза (р <0,001) и 4,3 раза (p <0,001) индекса пролиферации по сравнению с опухолями G1 и G2. Отмечено достоверно значимое снижение доли клеток в фазе G0/G1 (р <0,001) и повышение доли клеток в G2+M-фазе (р <0,001) по сравнению с рецидивными опухолями умеренной степени дифференцировки.
При анализе содержания ДНК в опухолевых клетках рецидивных СМТ в зависимости от стадии выявлено снижение доли диплоидных опухолей от IIa к III стадии. Так, опухоли с ИДНК=1,0 при IIa стадии составили 50%, при IIb стадии — 28,6%, при III стадии — 26,3%. При IIa стадии анеуплоидные опухоли составили 50% (2 из 4) и находились в пределах митотического цикла (ИДНК=1,1–1,84). На долю анеуплоидных опухолей при IIb стадии приходилось 71,4% (5 из 7), из которых 40% (2 из 5) соответствовали многоклоновым; при III стадии — 72,7% (14 из 19), из них 28,6% случаев приходилось на тетраплоидные (ИДНК=1,85–2,15) и многоклоновые опухоли (7 из 16).
Анеуплоидные рецидивные СМТ характеризовались достоверно значимым повышением среднего содержания анеуплоидных клеток в опухоли при IIb стадии (36,9±4,6; р <0,001) и III стадии (41,5±4,3; р <0,001) по сравнению со стадией IIa (15,64±3,9).
Повышение пролиферативной активности рецидивных СМТ сопровождалось снижением количества клеток в G0/G1-фазе клеточного цикла, что наиболее выражено при III и IIb стадиях. Так, при снижении доли клеток в фазе G0/G1 при IIb и III стадиях в 1,2 раза по сравнению с IIa стадией выявлено достоверно значимое увеличение индекса пролиферации в 3,9 и 4,2 раза соответственно (р <0,001). Результаты полученных изменений представлены в табл. 3.
Таблица 3. Распределение клеток по фазам клеточного цикла рецидивных сарком мягких тканей различных стадий (%)
Стадия заболевания | G0/G1-фаза клеточного цикла | G2+M-фаза клеточного цикла | S-фаза | Индекс пролиферации |
IIа | 95,7±2,4 | 0,9±0,2 | 3,5±1,3 | 4,6±1,4 |
IIb | 82,1±6,4*↓ | 1,1±0,2 | 16,9±4,1*↑ | 17,9±5,4*↑ |
III | 81,7±5,9*↓ | 7,8±2,8*↑°↑ | 11,4±4,3 | 19,2±3,7*↑ |
Примечание: *различия показателей достоверны по отношению к стадии IIa (p <0,001); °различия показателей достоверны по отношению к стадии IIb (p <0,001).
Таким образом, максимальная доля клеток в G2+M-фазе митотического цикла выявлена при III стадии, результат достоверно отличается от стадий IIa и IIb. Темпы пролиферации клеток опухоли (доля клеток в S-фазе клеточного цикла) при IIb стадии достоверно значимо превышали аналогичный показатель IIa стадии (р <0,001). При этом различия значений темпов пролиферации IIb и III стадий не имели достоверных различий.
Проведённое ДНК-цитометрическое исследование рецидивных СМТ позволяет определить их особенности и может служить одним из дополнительных методов углублённой диагностики. Нам представляется, что изменения содержания ДНК при рецидивных СМТ вписываются в модель кинетики популяции опухолевых клеток, описанную Р. Гут и соавт. (2009) [15].
Выводы
1. Проведённое ДНК-цитометрическое исследование параметров клеточного цикла показало высокий биологический потенциал рецидивных опухолей.
2. В зависимости от степени дифференцировки сарком мягких тканей параметры клеточного цикла были следующими: при высокой степени дифференцировки (G1) опухоли были диплоидными в 100% наблюдений, при умеренной (G2) — в 33,3%, при низкой (G3) — в 15%. Преобладали при G2 и G3 анеуплодные опухоли.
3. Изучение ДНК-цитометрических параметров сарком мягких тканей можно считать перспективным дополнительным методом в оценке рецидивирования и степени злокачественности процесса.
В представленной статье конфликт интересов отсутствует.
Об авторах
Евгения Марковна Непомнящая
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Автор, ответственный за переписку.
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Елена Петровна Ульянова
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Инна Арнольдовна Новикова
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Олеся Николаевна Селютина
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Елена Юрьевна Златник
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Тимур Арсенович Алиев
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Лариса Николаевна Ващенко
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Татьяна Валерьевна Аушева
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Елена Анатольевна Андрейко
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Екатерина Игоревна Золотарёва
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Елена Сергеевна Бондаренко
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт
Email: iftrnioi@yandex.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия
Список литературы
- Siegel R.L., Miller K.D., Jemal A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 2016; 66 (1): 7-30. doi: 10.3322/caac.21332.
- Зиновьев Г.В., Гафтон Г.И., Бусько Е.А. и др. Выявление и лечение местных рецидивов сарком мягких тканей конечностей. Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. 2017; (1): 32-41.
- Зиновьев Г.В., Гафтон Г.И., Бусько Е.А. и др. Выявление рецидивов сарком мягких тканей конечностей. Сибирский онкол. ж. 2017; 16 (2): 82-89. doi: 10.21294/18144861-2017-16-2-82-89.
- Алиев М.Д., Мень Т.Х. Заболеваемость саркомами мягких тканей в России. Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. 2013; (3): 3-9.
- Stojadinovic A., Leung D.H., Hoos A. et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Ann. Surg. 2002; 235: 424-434. doi: 10.1097/00000658-200203000-00015.
- Базанов К.В. Исследование скорости роста рецидивных и метастатических сарком мягких тканей. Соврем. пробл. науки и образования. 2014; (6): 1227.
- Колобов А.В., Полежаев А.А. Влияние случайной подвижности злокачественных клеток на устойчивость фронта опухоли. Компьютерн. исслед. и моделирование. 2009; 1 (2): 225-232.
- Неродо Г.А., Новикова И.А., Никитина В.П. и др. Клиническое значение ДНК-проточной цитометрии при раке яичников. Соврем. пробл. науки и образования. 2016; (3): 35.
- Теврюкова Н.С., Богатырёв В.Н. Значение лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии в дифференциальной цитологической диагностике и прогнозе рака предстательной железы. Рос. онкол. ж. 2013; (1): 10-19.
- Abdalla F., Buhmeida A., Alshrad M. et al. Prognostic significance of DNA image cytometry in libyan breast cancer. Oncology. 2012; 83: 165-176. doi: 10.1159/000339788.
- Gazic B., Pizem J., Bracko M. et al. S-phase fraction determined on fine needle aspirates is an independent prognostic factor in breast cancer - a multivariate study of 770 patients. Cytopathology. 2008; 19 (5): 294-302. doi: 10.1111/j.1365-2303.2007.00528.x.
- Кравец О.А., Богатырёв В.Н. Значение лазерной проточной ДНК-цитофлюориметрии при лучевой терапии рака шейки матки. Эффективн. фармакотерап. 2012; (2): 42-47.
- Susini T., Olivieri S., Molino C. et al. DNA ploidy is stronger than lymph node metastasis as prognostic factor in cervical carcinoma: 10-year results of a prospective study. Int. J. Gynecol. Cancer. 2011; 21 (4): 678-684. doi: 10.1097/IGC.0b013e3182126f85.
- Новикова И.А., Непомнящая Е.М., Ульянова Е.П. и др. ДНК-цитометрические характеристики первичных сарком мягких тканей. Казанский мед. ж. 2017; 98 (4): 509-513. doi: 10.17750/KMJ2017-509.
- Гут Р., Жаринов Г.М., Якубов Э. Упрощённая модель кинетики популяции опухолевых клеток. Вопр. онкол. 2009; 55 (1): 83-88.
Дополнительные файлы
