Антииммуносупрессивное действие глюконатов 3d-металлов при экспериментальном иммунодефиците

Полный текст

Иммуносупрессивное действие химио­терапевтических препаратов — весьма существенный негативный фактор, снижающий эффективность их применения. В связи с этим изучение действия иммуномодуляторов различной природы при восстановлении резистентности организма после приёма экзотоксикантов является актуальной задачей медицины и биохимии.

Одним из широко применяемых в онкологии препаратов служит цитостатик алкилирующего действия циклофосфамид, представляющий собой фосфорилированное циклическое производное иприта [1, 2]. Известно, что при его попадании в организм млекопитающих ­развивается выраженная супрессия пролиферации В-лимфоцитов и, как следствие, снижение уровня иммуноглобулинов, а также нарушения в системе комплемента, который служит важным звеном врождённого гуморального иммуни­тета [3, 4].

В качестве корректоров иммунных нарушений в данной работе были рассмотрены глюконаты 3d-элементов, обладающие способностью корректировать иммунные нарушения [5]. Соединения 3d-металлов характеризуются многообразием направлений взаимодействия с биологическими мишенями [6]. Введение этих металлов в организм в виде неорганических солей проявляется выраженной токсичностью [7–10], поскольку они воспринимаются иммунной системой слизистой оболочки тонкой кишки как гаптены, активирующие моноцитарно-макрофагальную систему по механизму незавершённого фагоцитоза [11]. В результате происходит индуцирование перекисных процессов, которые приводят к повреждению клеточных мембран. Однако в составе координационных соединений с рядом хелатирующих лигандов 3d-элементы в значительной степени теряют токсичность и способны проявлять иммунокорригирующие свойства [6, 12, 13].

В этом плане представляет интерес изу­чение комплексных соединений 3d-металлов с полиоксикислотами, в частности с D-глюконовой кислотой. Было показано, что эти соединения имеют более низкую токсичность по сравнению с неорганическими соединениями [12]. Возможно, хелатирующий эффект D-глюконовой кислоты препятствует реализации индуцирования перекисных процессов, и 3d-элементы могут формировать стабильный ­биодоступный пул, не оказывающий ­выраженного цитотоксического действия.

Инициация классического пути системы комплемента начинается с взаимодействия субкомпонента первого фактора комплемента C1q, который находится в сыворотке крови в виде мультимолекулярного комплекса C1q-2C1r-2C1s с активатором, которым является главным образом иммуноглобулин G (IgG) в составе комплекса антиген-антитело. Комплексы C1q-IgG-антиген формируются постоянно в результате иммунного ответа организма, так как они запускают каскад биохимических реакций системы комплемента по классическому пути и стимулируют активацию натуральных киллеров, привлекающих фагоциты и лимфоциты [14].

Целью настоящей работы было изучение влияния глюконатов 3d-металлов на комплемент-фиксирующую функцию IgG и функциональную активность комплемента.

Эксперимент проведён на 2,5–3-месячных белых беспородных мышах с массой тела 25–28 г, самцах. Иммунодефицит индуцировали путём однократного внутрибрюшинного введения цитостатика циклофосфамида (эндоксана; Бакстер АГ, Швейцария) в дозе 50 мг/кг. Контролем служили две группы: интактные и иммунодефицитные животные («без лечения»), которым вводили дистиллированную воду.

Влияние глюконатов Mn, Co, Cu, Zn, синтезированных по методике, описанной в [12], изучали в сравнении с двумя группами: (1) введение препарата ликопид — [4-O-(2-ацетиламино-2-дезокси-β-D-глюкопиранозил)-N-ацетилмурамил]-L-аланил-D-α-глутамиламид, который относится к фармакотерапевтической группе иммуностимулирующих средств, являясь синтетическим аналогом бактериальных гликопептидов, и (2) глюконата кальция (CaGl).

Дозы обоих препаратов рассчитывали по инструкциям: ликопид — 0,17 мг/кг (0,14–0,28 мг/кг), глюконат кальция — 50 мг/кг (28–71 мг/кг). Пероральное введение всех препаратов начинали через 24 ч после инъекции циклофосфамида и далее ежедневно в течение 2 нед в дозе 1/10 полулетальной дозы (LD50) [12]. На 15-е сутки у животных забирали кровь и отделяли сыворотку, в которой методом иммуноферментного анализа с помощью специфических мышиных моноклональных антител против C1q и поликлональных кроличьих антител против IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой (ГНЦ НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург), определяли уровень IgG и комплексов C1q-IgG.

Оценку влияния глюконатов металлов на функциональную активность комплемента по классическому пути выпо­лняли с использованием сенсибилизированных гемолитической сывороткой (ФГУП НПО «Микроген» МЗ России) эритроцитов барана. В качестве источника комплемента использовали донорскую сыворотку в разведении от 1:2 до 1:128. Глюконаты 3d-металлов в изотоническом растворе натрия хлорида (10–2 М) по 50 мкл вносили в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 30 мин при 4 °C. После этого добавляли сенсибилизированные эритроциты барана в вероналовом буферном растворе (по 50 мкл) и инкубировали при 37 °C в течение часа.

Оптическую плотность надосадочной жидкости, перенесённой в новый планшет, измеряли в той же последовательности при длине волны 450 нм (иммуноферментный анализатор Stat Fax-2100, США). Фиксацию комплемента (С%) сенсибилизированными эритроцитами в присутствии глюконатов металлов рассчитывали по формуле:

С%=(Ео–Ек)/Ео×100%,

где Ео — оптическая плотность в присутствии препарата; Ек — оптическая плотность контрольной пробы.

Манипуляции с лабораторными мышами проводили в соответствии с положением Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, которое соответствует положениям, принятым в Российской Федерации (МЗ РФ от 19 июня 2003 г. №267).

Результаты статистически обрабатывали с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 10,0. Для описания количественных признаков в малых выборках применяли медиану (Ме) и интерквартильный размах (Q1–Q3). Для расчёта статистической значимости различий между группами использовали непараметрический критерий Манна–Уитни для двух независимых групп. Статистически значимыми считали значения при р <0,05.

Представленные результаты исследования (табл. 1, 2) показывают, что введение циклофосфамида вызывает у мышей снижение уровня IgG на 53%, а комплексов C1q-IgG — на 31,5% относительно группы интактных мышей, что указывает на побочное действие цитостатика, который вызывает изменения в системе лимфопоэза, вследствие чего происходит угнетение синтеза IgG. С другой стороны, препарат в результате своего цитотоксического действия неселективно угнетает митотическую активность клеток различных тканей, способствуя их дискомплексации, дистрофическим и дегенеративным изменениям, приводящим к гибели по пути некроза, или же потенцируя апоптоз. Образующиеся вследствие этого «осколки» и метаболиты распада, которые не могут полностью инактивироваться угнетённой макрофагально-фагоцитарной системой, связываются с Fc-фрагментами IgG, конкурируя с C1q, тем самым снижая долю связывания C1q с IgG. Кроме того причиной снижения образования комплексов может быть гепатотоксическое действие циклофосфамида, которое обусловливает недостаточный синтез компонентов комплемента или их некомпетентность [1].

 

Таблица 1. Влияние глюконатов 3d-металлов на уровень иммуноглобулинов G (IgG) в сыворотке крови иммунодефицитных мышей

Статистический показатель	IgG, мг/мл
	1 — интактные (n=12)	2 — ИД без лечения (n=12)	3 — ИД + ликопид (n=12)	4 — ИД + CaGl (n=12)	5 — ИД + MnGl (n=12)	6 — ИД + CoGl (n=12)	7 — ИД + CuGl (n=12)	8 — ИД + ZnGl (n=12)
M±σ	1,48±0,23	0,69±0,09	0,84±0,12	0,7±0,09	0,94±0,11	1,07±0,16	1,02±0,15	1,16±0,14
Me	1,51	0,71	0,86	0,72	0,96	1,09	1,04	1,18
[Q1–Q3]	[1, 34–1, 72]	[0, 63–0, 76]	[0, 74–0, 93]	[0, 63–0, 78]	[0, 89–0, 99]	[0, 98–1, 21]	[0, 92–1, 12]	[1, 07–1, 24]
p	—	p1,2=0,00003	p2,3=0,003	p2,4=0,00729 p3,4=0,0130	p2,5=0,0004 p3,5=0,00003 p4,5=0,0005	p2,7=0,00006 p3,7=0,0009 p4,7=0,00006	p2,8=0,0002 p3,8=0,0066 p4,8=0,0002	p2,9=0,00003 p3,9=0,00005 p4,9=0,00003

Примечание: IgG — иммуноглобулин G; ИД — иммунодефицит.

 

Таблица 2. Влияние глюконатов 3d-металлов на уровень комплексов C1q-IgG в сыворотке крови иммунодефицитных мышей

Статистический показатель	C1q-IgG, ед. экстинкции
	1 — интактные (n=12)	2 — ИД без лечения (n=12)	3 — ИД + ликопид (n=12)	4 — ИД + CaGl (n=12)	5 — ИД + MnGl (n=12)	6 — ИД + CoGl (n=12)	7 — ИД + CuGl (n=12)	8 — ИД + ZnGl (n=12)
M±σ	1,99±0,31	1,34±0,20	1,65±0,24	1,41±0,18	1,86±0,20	1,69±0,23	1,76±0,19	1,93±1,36
Me	2	1,37	1,66	1,43	1,87	1,74	1,77	1,95
[Q1–Q3]	[1, 72–2, 24]	[1, 28–1, 42]	[1, 54–1, 77]	[1, 31–1, 53]	[1, 73–2, 02]	[1, 6–1, 83]	[1, 65–1, 87]	[1, 94–1, 44]
p	—	p1,2=0,0002	p2,3=0,0093	p2,4=0,2726 p3,4=0,011	p2,5=0,0001 p3,5=0,0282 p4,5=0,0002	p2,7=0,0038 p3,7=0,4357 p4,7=0,0051	p2,8=0,0005 p3,8=0,2040 p4,8=0,0011	p2,9=0,00003 p3,9=0,00005 p4,9=0,00003

Примечание: IgG — иммуноглобулин G; ИД — иммунодефицит.

 

Введение глюконатов 3d-металлов в течение 2 нед приводило к существенному повышению концентрации IgG в сыворотке крови (см. табл. 1) по сравнению с животными контрольной группы «без лечения» (p <0,05). При введении глюконата цинка зарегистрировано наибольшее повышение концентрации IgG — на 31%, далее в порядке убывания следуют кобальт — на 25%, медь — на 22%. В меньшей степени эффект проявлялся под действием глюконата марганца — на 17%.

Аналогичная картина отмечена и в содержании комплексов C1q-IgG (см. табл. 2). Здесь выраженное увеличение было отмечено в группах мышей, получавших глюконат цинка (на 28,5%), глюконат марганца (на 25%) и глюконат меди (на 20%), в меньшей степени — при введении глюконата кобальта (на 18,5%). Не исключено, что такое действие глюконатов 3d-металлов может быть связано со стимулированием дополнительного синтеза IgG, а также, возможно, с конкурирующим взаимодействием этих соединений с метаболитами распада, смещающим равновесие реакции C1q с IgG в сторону увеличения доли образования комплексов.

Поскольку в группе животных, получавших глюконат кальция, зафиксировано лишь незначительное повышение уровня IgG (на 0,4%) и комплексов C1q-IgG (на 3%) относительно группы «без лечения», можно предположить, что определяющее влияние на изменение приведённых показателей оказывают 3d-элементы.

Из указанных в таблицах данных также видно, что глюконаты 3d-металлов превосходят по корректирующему действию препарат сравнения ликопид (p <0,05).

 

Таблица 3. Влияние глюконатов 3d-металлов на фиксацию комплемента в тесте с сенсибилизированными эритроцитами барана

Показатель	Контроль (n=12)	CaGl (n=12)	MnGl (n=12)	CoGl (n=12)	CuGl (n=12)	ZnGl (n=12)
E450	0,92±0,09	0,95±0,1	1,13±0,13	1,89±0,2	0,85±0,09	0,91±0,09
Фиксация комплемента (С%), %	0	3,2±0,3	18,6±1,9	51,3±5,2	–8,2±0,9	1,1±0,12

 

Результаты определения влияния глюконатов 3d-металлов на функциональную активность субкомпонента C1q по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана представлены в табл. 3. Из них видно, что способностью активировать комплемент обладают CoGl и (в меньшей степени) MnGl. Узнавание C1q субкомпонентом активаторов патологического процесса — ключевое событие в запуске каскада реакций классического пути комплемента, приводящего к образованию мембраноатакующего комплекса и уничтожению опознанных клеток.

Выводы

1. Глюконаты 3d-металлов (Mn, Co, Cu, Zn) обладают иммунокорригирующими свойствами: повышают содержание иммуноглобулинов G и их комплексов с субкомпонентом первого фактора комплемента C1q, значительно снижающееся в результате действия циклофосфамида.

2. Глюконаты кобальта и марганца оказывают стимулирующее действие на функциональную активность комплемента по классическому пути, что свидетельствует о различных механизмах иммунокорригирующего действия исследуемых глюконатов металлов и требует дальнейшего изучения.

 

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Ольга Александровна Князева

Башкирский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: olga_knyazeva@list.ru
г. Уфа, Россия

Сабина Ильясовна Уразаева

Башкирский государственный медицинский университет

Email: olga_knyazeva@list.ru
г. Уфа, Россия

Ирина Григорьевна Конкина

Уфимский институт химии Российской академии наук

Email: olga_knyazeva@list.ru
г. Уфа, Россия

Лилиана Минкаировна Саптарова

Башкирский государственный медицинский университет

Email: olga_knyazeva@list.ru
г. Уфа, Россия

Луиза Мавлетовна Газдалиева

Башкирский государственный медицинский университет

Email: olga_knyazeva@list.ru
г. Уфа, Россия

Юрий Ильич Муринов

Уфимский институт химии Российской академии наук

Email: olga_knyazeva@list.ru
г. Уфа, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы