Влияние пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений на механизмы репарации повреждений ДНК клеток саркомы Юинга

Полный текст

Саркома Юинга — одна из наиболее распространённых злокачественных опухолей костной ткани у детей и подростков. Заболевание впервые описал в 1921 г. американский патолог Джеймс Юинг (1866–1943). Саркома Юинга чаще встречается у мальчиков, пик заболеваемости приходится на возраст от 10 до 15 лет [1].

Данная опухоль в основном поражает диафизы длинных трубчатых костей. Кроме того, саркома Юинга может локализоваться в рёбрах, тазовых костях, лопатке и ключице. Клинически данное заболевание, как правило, проявляется болевым синдромом и развитием отёка в области поражённой кости [2]. Опухоль характеризуется весьма агрессивным течением, и у 20–30% пациентов на момент постановки диагноза отмечают метастазы (лёгкие, костная ткань, лимфатические узлы) [3].

Общая стратегия лечения саркомы Юинга включает химиотерапию с последующей оперативной и/или лучевой местной терапией [4]. К основным группам химиопрепаратов, применяемых в лечении саркомы Юинга, относятся алкилирующие агенты (ифосфамид, циклофосфамид), антрациклины (адриамицин, доксорубицин), этопозид, актиномицин D и алкалоиды барвинка (винбластин) [5, 6]. Пациентам с плохим гистологическим ответом на обычные дозы химиотерапии назначают высокие дозы бусульфана и мелфалан. Благодаря комбинации химиотерапии и местного лечения 5-летняя выживаемость больных составляет более 70%. Тем не менее, у ряда больных развиваются рецидивы опухоли, характеризующиеся тяжёлым течением и плохим прогнозом (2-летняя выживаемость после рецидива составляет 20%) [7, 8].

В соответствии с вышеизложенным представляло интерес изучить механизмы активности синтезированных нами пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений (ПЗПГ) в отношении клеток саркомы Юинга. Ранее нами было установлено, что ПЗПГ вызывают в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей деполимеризацию белка тубулина. В результате этого клетки задерживаются в М-фазе клеточного цикла (митотическая катастрофа) и гибнут по механизму апоптоза [9].

Объектом исследования были опухолевые клетки саркомы Юинга линии А673 (ATCC, США). Клетки культивировали в стандартных условиях (37 °С, 5% CO2) в культуральный среде DMEM («­ПанЭКО») с добавлением L-глутамина («­ПанЭКО»), эмбриональной телячьей сыворотки («HyClone») и антибиотиков («ПанЭКО»). При достижении 70% конфлюентности к клеткам добавляли ПЗПГ №20 (ПЗПГ-20) и №24 (ПЗПГ-24) в количестве 5 ­мкмоль. Через 24 и 48 ч инкубации клетки подвергали лизису. Полученные клеточные лизаты методом электрофореза разделяли по молекулярной массе и детектировали с помощью биохимической реакции «антиген-антитело» методом иммуноблоттинга.

Были исследованы уровни экспрессии маркёров репарации однонитевых (ATR, Chk-1) и двунитевых (γ-H2AX, АТМ, ­DNA-PK, BRCA-1, Chk-2) повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). В качестве препаратов сравнения были использованы доксорубицин в дозе 0,25 мкг/мл и винбластин в дозе 1 нмоль (Sigma-Aldrich, США).

Доксорубицин является противоопухолевым антибиотиком антрациклинового ряда и по механизму действия относится к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа.Винбластин относится к митотическим ядам (так же, как и ПЗПГ, деполимеризует тубулин), является алкалоидом барвинка. Оба препарата используют в лечении саркомы Юинга.

Методом проточной цитометрии (BD FacsCanto, США) изучали влияние ­ПЗПГ-20, ПЗПГ-24 и химиопрепаратов на регуляцию фаз клеточного цикла опухолевых клеток линии А673, а также механизмы их гибели. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с помощью программ Microsoft Excel 2007 и Biostatistica (S.A. Glantz, McGraw Hill, США). Для оценки достоверности различий изучаемых выборок использовали t-критерий Стьюдента. При р <0,05 различия считали статистически значимыми.

Было обнаружено, что ПЗПГ-20 и ­ПЗПГ-24 индуцируют фосфорилирование гистона 2 по серину 139 (γ-Н2AX) в клетках саркомы Юинга линии А673 (рис. 1). Эффект был более выражен через 48 ч инкубации клеток с исследуемыми соединениями. Подобный эффект также отмечен у доксорубицина и, в меньшей степени, у винбластина.

 

Рис. 1. Изучение способности химиопрепаратов (доксорубицина, винбластина) и пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений (ПЗПГ) индуцировать двунитевые разрывы ДНК в клетках саркомы Юинга линии А673 и их репарацию. Инкубация 24 и 48 ч. γ-H2AX — маркёр двунитевых разрывов ДНК; рАТМ S1981 — маркёр репарации двунитевых разрывов; рВRСА S1524 — маркёр активации гомологичной рекомбинации; Н2АХ, АТМ, ВRСА — общие (неактивированные) формы белков; актин отражает уровень белка в образцах. Доксорубицин (Докс) — 0,25 мкг/мл; винбластин (Вин) — 1 нмоль; ПЗПГ-20 — 5 мкмоль, ПЗПГ-24 — 5 мкмоль

 

Повышенная экспрессия в опухолевых клетках γ-Н2AX свидетельствует о появлении двунитевых разрывов ДНК. В пользу этого также свидетельствует активация соответствующих путей репарации ДНК, в частности белков ATM-киназы, и BRCA1 (см. рис. 1). Увеличение экспрессии фосфорилированной формы BRCA-1 свидетельствует об активации репарации двунитевых разрывов путём гомологичной реком­бинации.

Известно, что появление в клетках однонитевых разрывов ДНК сопровождается активацией соответствующих путей репарации повреждений ДНК, о чём может свидетельствовать гиперэкспрессия фосфорилированных форм ATR- и Chk1-киназы [10]. Результаты проведённых нами исследований показывают, что в клетках саркомы Юинга через 48 ч инкубации с соединениями ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 не повышалась экспрессия активированных (то есть фосфорилированных) вышеуказанных киназ, что свидетельствует о способности соединений ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировать в клетках линии А673 образование исключительно двунитевых разрывов ДНК.

Методом проточной цитометрии было установлено, что под влиянием ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 в опухолевых клетках линии А673 происходило нарушение регуляции фаз клеточного цикла, что проявлялось в виде накопления клеток в фазах G2/M клеточного цикла (табл. 1). Кроме того, соединения ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировали гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза (отмечалась повышенная экспрессия пропидия йодида, что указывает на наличие фрагментации молекул ДНК).

 

Таблица 1. Изучение влияния доксорубицина, винбластина, ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 на фазы клеточного цикла опухолевых клеток линии А673

Исследуемое вещество	Фазы клеточного цикла			Апоптоз, %
	G0/G1, %	S, %	G2/M, %
Контроль	77,1±1,0	4,8±1,6	15,4±1,6	2,1±0,9
Доксорубицин, 0,25 мкг/мл	11,0±0,8*	4,1±1,0	81,8±2,1*	3,0±0,7
Винбластин, 1 нмоль	14,8±0,9*	1,3±0,6	54,0±1,2*	30,0±1,2*
ПЗПГ-20, 15 мкмоль	36,6±1,1*	8,0±0,7*	36,0±1,1*	19,4±1,1*
ПЗПГ-24, 15 мкмоль	40,3±1,2*	9,4±0,7*	33,5±0,9*	16,8±1,0*

Примечание: инкубация 48 ч; полученные результаты представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение; *различия относительно контроля статистически значимы (р <0,05); ПЗПГ — пивалоил-замещённые пиррол-содержащие гетероциклические соединения.

 

Таким образом, проведённые исследования свидетельствуют о способности ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировать в клетках саркомы Юинга образование двунитевых разрывов ДНК, что приводит к последующей активации АТМ-опосредованного пути репарации данных повреждений. Несмотря на активацию данной системы репарации повреждений ДНК, в опухолевых клетках происходила остановка клеточного цикла в фазе G2/M, а затем последующая их гибель по механизму апоптоза.

Выводы

1. Клетки саркомы Юинга линии А673 чувствительны к пивалоил-замещённым пиррол-содержащим гетероциклическим соединениям, индуцирующим образование двунитевых разрывов ДНК и последующую гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза.

2. Полученные нами результаты свидетельствуют о чувствительности клеток саркомы Юинга линии А673 к пивалоил-замещённым пиррол-содержащим гетероциклическим соединениям in vitro и открывают перспективы для более углублённого изучения механизмов цитотоксического действия данных соединений в отношении опухолевых клеток саркомы Юинга.

 

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
(грант мол_а №16-34-01005).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Айгуль Рафиковна Галембикова

Казанский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: boichuksergei@mail.ru
г. Казань, Россия

Сергей Васильевич Бойчук

Казанский государственный медицинский университет

Email: boichuksergei@mail.ru
г. Казань, Россия

Павел Дмитриевич Дунаев

Казанский государственный медицинский университет

Email: boichuksergei@mail.ru
г. Казань, Россия

Рамиль Рамисович Хуснутдинов

Казанский государственный медицинский университет

Email: boichuksergei@mail.ru
г. Казань, Россия

Светлана Сергеевна Зыкова

Пермский институт ФСИН России

Email: boichuksergei@mail.ru
г. Пермь, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы