Effect of pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds on DNA repair pathways in Ewing sarcoma cells
- Authors: Galembikova AR1, Boychuk SV1, Dunaev PD1, Khusnutdinov RR1, Zykova SS2
-
Affiliations:
- Kazan State Medical University
- Perm Penal Service Institute
- Issue: Vol 99, No 2 (2018)
- Pages: 245-248
- Section: Experimental medicine
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/8414
- DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2018-245
- ID: 8414
Cite item
Abstract
Aim. To examine deoxyribonucleic acid (DNA) damage repair and cell cycle regulatory mechanisms of Ewing sarcoma cells exposed to pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds.
Methods. The study was performed on A673 Ewing sarcoma cell line. The tumor cells were incubated for 48 h in the presence of pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds (compounds №20 and №24). Western blot analysis was utilized to examine expression of the markers of DNA single-strand (phosphorylated forms of ATR and Chk1) and double-strand breaks (phosphorylated forms of H2AX, АТМ, DNA-PK, BRCA-1, Chk-2). Analysis of the cell cycle phases was performed by flow cytometry (BD FacsCanto, USA).
Results. Pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds substantially increased the expression of histone 2A phosphorylated on serine 138 (γ-H2AX) that indicates DNA damage (double-strand breaks). Under exposure to pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds the studied cells increased expression of phosphorylated forms of ATM-kinase and BRCA-1. Also cell cycle disorders leading to substantial G2/M arrest and enhanced apoptosis of tumor cells were observed.
Conclusion. Pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds induced DNA double-strand breaks in A673 Ewing sarcoma cell line; in response to DNA damage in tumor cells, the mechanisms of DNA double-strand breaks repair were activated; despite activation of DNA repair mechanisms, A673 cells underwent cell cycle arrest in the G2/M-phase and apoptosis.
Full Text
Саркома Юинга — одна из наиболее распространённых злокачественных опухолей костной ткани у детей и подростков. Заболевание впервые описал в 1921 г. американский патолог Джеймс Юинг (1866–1943). Саркома Юинга чаще встречается у мальчиков, пик заболеваемости приходится на возраст от 10 до 15 лет [1].
Данная опухоль в основном поражает диафизы длинных трубчатых костей. Кроме того, саркома Юинга может локализоваться в рёбрах, тазовых костях, лопатке и ключице. Клинически данное заболевание, как правило, проявляется болевым синдромом и развитием отёка в области поражённой кости [2]. Опухоль характеризуется весьма агрессивным течением, и у 20–30% пациентов на момент постановки диагноза отмечают метастазы (лёгкие, костная ткань, лимфатические узлы) [3].
Общая стратегия лечения саркомы Юинга включает химиотерапию с последующей оперативной и/или лучевой местной терапией [4]. К основным группам химиопрепаратов, применяемых в лечении саркомы Юинга, относятся алкилирующие агенты (ифосфамид, циклофосфамид), антрациклины (адриамицин, доксорубицин), этопозид, актиномицин D и алкалоиды барвинка (винбластин) [5, 6]. Пациентам с плохим гистологическим ответом на обычные дозы химиотерапии назначают высокие дозы бусульфана и мелфалан. Благодаря комбинации химиотерапии и местного лечения 5-летняя выживаемость больных составляет более 70%. Тем не менее, у ряда больных развиваются рецидивы опухоли, характеризующиеся тяжёлым течением и плохим прогнозом (2-летняя выживаемость после рецидива составляет 20%) [7, 8].
В соответствии с вышеизложенным представляло интерес изучить механизмы активности синтезированных нами пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений (ПЗПГ) в отношении клеток саркомы Юинга. Ранее нами было установлено, что ПЗПГ вызывают в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей деполимеризацию белка тубулина. В результате этого клетки задерживаются в М-фазе клеточного цикла (митотическая катастрофа) и гибнут по механизму апоптоза [9].
Объектом исследования были опухолевые клетки саркомы Юинга линии А673 (ATCC, США). Клетки культивировали в стандартных условиях (37 °С, 5% CO2) в культуральный среде DMEM («ПанЭКО») с добавлением L-глутамина («ПанЭКО»), эмбриональной телячьей сыворотки («HyClone») и антибиотиков («ПанЭКО»). При достижении 70% конфлюентности к клеткам добавляли ПЗПГ №20 (ПЗПГ-20) и №24 (ПЗПГ-24) в количестве 5 мкмоль. Через 24 и 48 ч инкубации клетки подвергали лизису. Полученные клеточные лизаты методом электрофореза разделяли по молекулярной массе и детектировали с помощью биохимической реакции «антиген-антитело» методом иммуноблоттинга.
Были исследованы уровни экспрессии маркёров репарации однонитевых (ATR, Chk-1) и двунитевых (γ-H2AX, АТМ, DNA-PK, BRCA-1, Chk-2) повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). В качестве препаратов сравнения были использованы доксорубицин в дозе 0,25 мкг/мл и винбластин в дозе 1 нмоль (Sigma-Aldrich, США).
Доксорубицин является противоопухолевым антибиотиком антрациклинового ряда и по механизму действия относится к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа.Винбластин относится к митотическим ядам (так же, как и ПЗПГ, деполимеризует тубулин), является алкалоидом барвинка. Оба препарата используют в лечении саркомы Юинга.
Методом проточной цитометрии (BD FacsCanto, США) изучали влияние ПЗПГ-20, ПЗПГ-24 и химиопрепаратов на регуляцию фаз клеточного цикла опухолевых клеток линии А673, а также механизмы их гибели. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с помощью программ Microsoft Excel 2007 и Biostatistica (S.A. Glantz, McGraw Hill, США). Для оценки достоверности различий изучаемых выборок использовали t-критерий Стьюдента. При р <0,05 различия считали статистически значимыми.
Было обнаружено, что ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцируют фосфорилирование гистона 2 по серину 139 (γ-Н2AX) в клетках саркомы Юинга линии А673 (рис. 1). Эффект был более выражен через 48 ч инкубации клеток с исследуемыми соединениями. Подобный эффект также отмечен у доксорубицина и, в меньшей степени, у винбластина.
Рис. 1. Изучение способности химиопрепаратов (доксорубицина, винбластина) и пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений (ПЗПГ) индуцировать двунитевые разрывы ДНК в клетках саркомы Юинга линии А673 и их репарацию. Инкубация 24 и 48 ч. γ-H2AX — маркёр двунитевых разрывов ДНК; рАТМ S1981 — маркёр репарации двунитевых разрывов; рВRСА S1524 — маркёр активации гомологичной рекомбинации; Н2АХ, АТМ, ВRСА — общие (неактивированные) формы белков; актин отражает уровень белка в образцах. Доксорубицин (Докс) — 0,25 мкг/мл; винбластин (Вин) — 1 нмоль; ПЗПГ-20 — 5 мкмоль, ПЗПГ-24 — 5 мкмоль
Повышенная экспрессия в опухолевых клетках γ-Н2AX свидетельствует о появлении двунитевых разрывов ДНК. В пользу этого также свидетельствует активация соответствующих путей репарации ДНК, в частности белков ATM-киназы, и BRCA1 (см. рис. 1). Увеличение экспрессии фосфорилированной формы BRCA-1 свидетельствует об активации репарации двунитевых разрывов путём гомологичной рекомбинации.
Известно, что появление в клетках однонитевых разрывов ДНК сопровождается активацией соответствующих путей репарации повреждений ДНК, о чём может свидетельствовать гиперэкспрессия фосфорилированных форм ATR- и Chk1-киназы [10]. Результаты проведённых нами исследований показывают, что в клетках саркомы Юинга через 48 ч инкубации с соединениями ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 не повышалась экспрессия активированных (то есть фосфорилированных) вышеуказанных киназ, что свидетельствует о способности соединений ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировать в клетках линии А673 образование исключительно двунитевых разрывов ДНК.
Методом проточной цитометрии было установлено, что под влиянием ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 в опухолевых клетках линии А673 происходило нарушение регуляции фаз клеточного цикла, что проявлялось в виде накопления клеток в фазах G2/M клеточного цикла (табл. 1). Кроме того, соединения ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировали гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза (отмечалась повышенная экспрессия пропидия йодида, что указывает на наличие фрагментации молекул ДНК).
Таблица 1. Изучение влияния доксорубицина, винбластина, ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 на фазы клеточного цикла опухолевых клеток линии А673
Исследуемое вещество | Фазы клеточного цикла | Апоптоз, % | ||
G0/G1, % | S, % | G2/M, % | ||
Контроль | 77,1±1,0 | 4,8±1,6 | 15,4±1,6 | 2,1±0,9 |
Доксорубицин, 0,25 мкг/мл | 11,0±0,8* | 4,1±1,0 | 81,8±2,1* | 3,0±0,7 |
Винбластин, 1 нмоль | 14,8±0,9* | 1,3±0,6 | 54,0±1,2* | 30,0±1,2* |
ПЗПГ-20, 15 мкмоль | 36,6±1,1* | 8,0±0,7* | 36,0±1,1* | 19,4±1,1* |
ПЗПГ-24, 15 мкмоль | 40,3±1,2* | 9,4±0,7* | 33,5±0,9* | 16,8±1,0* |
Примечание: инкубация 48 ч; полученные результаты представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение; *различия относительно контроля статистически значимы (р <0,05); ПЗПГ — пивалоил-замещённые пиррол-содержащие гетероциклические соединения.
Таким образом, проведённые исследования свидетельствуют о способности ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировать в клетках саркомы Юинга образование двунитевых разрывов ДНК, что приводит к последующей активации АТМ-опосредованного пути репарации данных повреждений. Несмотря на активацию данной системы репарации повреждений ДНК, в опухолевых клетках происходила остановка клеточного цикла в фазе G2/M, а затем последующая их гибель по механизму апоптоза.
Выводы
1. Клетки саркомы Юинга линии А673 чувствительны к пивалоил-замещённым пиррол-содержащим гетероциклическим соединениям, индуцирующим образование двунитевых разрывов ДНК и последующую гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза.
2. Полученные нами результаты свидетельствуют о чувствительности клеток саркомы Юинга линии А673 к пивалоил-замещённым пиррол-содержащим гетероциклическим соединениям in vitro и открывают перспективы для более углублённого изучения механизмов цитотоксического действия данных соединений в отношении опухолевых клеток саркомы Юинга.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
(грант мол_а №16-34-01005).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.
About the authors
A R Galembikova
Kazan State Medical University
Author for correspondence.
Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia
S V Boychuk
Kazan State Medical University
Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia
P D Dunaev
Kazan State Medical University
Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia
R R Khusnutdinov
Kazan State Medical University
Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia
S S Zykova
Perm Penal Service Institute
Email: boichuksergei@mail.ru
Perm, Russia
References
- Delattre O., Zucman J., Melot T. et al. The Ewing-family of tumors - a subgroup of small-round-cell tumors defined by specific chimeric transcripts. N. Engl. J. Med. 1994; 331 (5): 294-299. doi: 10.1056/NEJM199408043310503.
- Le Deley M.C., Delattre O., Schäfer K.L. et al. Impact of EWS-ETS fusion type on disease progression in Ewing's sarcoma/peripheral primitive neuroectodermal tumor: prospective results from the cooperative Euro-E.W.I.N.G. 99 trial. J. Clin. Oncol. 2010; 28 (12): 1982-1988. doi: 10.1200/JCO.2009.23.3585.
- Van Doominck J.A., Ji L., Schaub B. et al. Current treatment protocols have eliminated the prognostic advantage of type 1 fusions in Ewing sarcoma: a report from the Children's Oncology Group. J. Clin. Oncol. 2010; 28 (12): 1989-1994. doi: 10.1200/JCO.2009.24.5845.
- Juergens C., Weston C., Lewis I. et al. Safety assessment of intensive induction with vincristine, ifosfamide, doxorubicin, and etoposide (VIDE) in the treatment of Ewing tumors in the EURO-E.W.I.N.G. 99 clinical trial. Pediatr. Blood Cancer. 2006; 47 (1): 22-29. doi: 10.1002/pbc.20820.
- Le Deley M.C., Paulussen M., Ian Lewis I. et al. Cyclophosphamide compared with ifosfamide in consolidation treatment of standard-risk Ewing sarcoma: results of the randomized noninferiority Euro-EWING99-R1 trial. J. Clin. Oncol. 2014; 32 (23): 2440-2448. doi: 10.1200/JCO.2013.54.4833.
- Womer R.B., West D.C., Krailo M.D. et al. Randomized controlled trial of interval-compressed chemotherapy for the treatment of localized Ewing sarcoma: a report from the Children's Oncology Group. J. Clin. Oncol. 2012; 30 (33): 4148-4154. doi: 10.1200/JCO.2011.41.5703.
- Wagner L.M., McAllister N., Goldsby R.E. et al. Temozolomide and intravenous irinotecan for treatment of advanced Ewing sarcoma. Pediatr. Blood Cancer. 2007; 48 (2): 132-139. doi: 10.1002/pbc.20697.
- Haeusler J., Ranft A., Boelling T. et al. The value of local treatment in patients with primary, disseminated, multifocal Ewing sarcoma (PDMES). Cancer. 2010; 116 (2): 443-450. doi: 10.1002/cncr.24740.
- Boichuk S., Galembikova A., Zykova S. et al. Ethyl-2-amino-pyrrole-3-carboxylates are novel potent anticancer agents that affect tubulin polymerization, induce G2/M cell-cycle arrest, and effectively inhibit soft tissue cancer cell growth in vitro. Anti-Cancer Drugs. 2016; 27 (7): 620-634. doi: 10.1097/CAD.0000000000000372.
- Kumagai A., Lee J., Yoo H.Y., Dunphy W.G. TopBP1 activates the ATR-ATRIP complex. Cell. 2006; 124 (5): 943-955. doi: 10.1016/j.cell.2005.12.041.
Supplementary files
