Biochemical changes in rat muscle tissue with prolonged use of simvastatin

Full Text

Атеросклероз — опасное и коварное забо­левание, так как патологические изменения происходят внутри сосудов, и на ранних стадиях клинические проявления могут отсутствовать. Кроме того, атероскле-
роз — фактор риска развития сложных сердечно-сосудистых заболеваний и нередко представляет угрозу жизни больного.

На сегодняшний день препаратами выбора при лечении нарушений липидного обмена служат статины. Практически все исследователи отмечают высокую гиполипидемическую активность статинов и хорошую их переносимость при длительном лечении. Однако неоднократно были зарегистрированы случаи, когда у больных, получающих статины, резко возникают мышечные боли, иногда даже при повторном приёме одного и того же лекарственного препарата. В данном случае речь идёт о специфическом побочном эффекте данной группы препаратов — статиновой миопа-
тии [1]. Несмотря на различные версии, чёткое понимание её патогенеза до сих пор отсутствует.

В связи с этим целью работы был анализ биохимических изменений в мышечной ткани после длительного приёма симвастатина.

Исследование проведено на беспородных крысах-самцах в возрасте 12–14 мес. Содержание животных соответствовало требованиям Приказа Минздрава РФ №708 от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики» и санитарным правилам СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014.

В процессе эксперимента животные бы­ли разделены на три группы.

Контрольную группу составили 35 животных, которые содержались на общем рационе вивария и в течение 3 мес получали через пищеводный зонд 0,5 мл дистиллированной воды 1 раз в сутки.

У животных экспериментальной группы индуцировали эссенциальную гиперхолестеринемию путём содержания в течение 3 мес на рационе, обогащённом животными жирами (топлённым сливочным маслом) и легко усваиваемыми углеводами (тростниковым сахаром, манной крупой). По истечении 3 мес у животных определяли уровень общего холестерина на анализаторе «Bayer» (Германия). После подтверждения гиперхолестеринемии животные были разделены на две группы:
– группа 1 (сравнения) — 35 животных, в течение 2 мес получавших рацион без добавления лекарственных веществ и 0,5 мл дистиллированной воды 1 раз в сутки через пищеводный зонд;
– группа 2 (экспериментальная) — 35 животных, получавших в течение 2 мес симвастатин (Zocor, 20 мг) по 0,0012 г/100 г массы тела 1 раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд.

По окончании срока эксперимента животных забивали путём декапитации. Все манипуляции выполняли в соответствии с общепринятыми этическими нормами (протокол ЛНЭК ГБОУ ВПО «Ростовского государственного медицинского университета» МЗ РФ №21/15 от 10.12.2015).

Для исследования отбирали фрагменты скелетных мышц с задней лапы животного. Гомогенат мышечной ткани готовили в соотношении 1 г ткани на 9 мл охлаждённого изотонического раствора натрия хлорида, центрифугировали при 3000 об./мин.

В надосадочной жидкости определяли концентрацию восстановленного глутатиона [2], активность супероксиддисмутазы [2], каталазы [2], глутатионредуктазы [3] и глутатионпероксидазы [3].

Концентрацию пировиноградной кислоты определяли по реакции с 2,4-динитрофенилгидрозином [4]. Концентрацию лактата определяли по реакции уксусного альдегида, образующегося из молочной кислоты в присутствии серной, фосфорной кислот и ионов меди, с параоксидифенилом [4].

Выделение изоформ тайтина и небулина проводили по методике, разработанной в Институте теоретической и экспериментальной биофизики (г. Пущино) [5, 6]. Содержание изоформ тайтина (NT- и N2A-) и небулина определяли в пересчёте на содержание тяжёлых цепей миозина.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. Статистически значимыми считали различия, соответствующие оценке ошибки вероятности р <0,05.

Введение симвастатина животным группы 2 (экспериментальной группы) способствовало снижению уровня холестерина в сыворотке крови до 1,637±0,136 ммоль/л, что достоверно отличалось от показателей группы животных, не получавших симвастатин, доказывая гиполипидемическое действие статинов (табл. 1).

Таблица 1. Уровень холестерина в сыворотке крови животных исследуемых групп (M±m)

Примечание: р — статистическая значимость различий относительно контрольной группы; р1 — относительно группы сравнения.

Косвенным показателем эффективности утилизации молекулярного кислорода при внутриклеточном метаболизме служит уровень пирувата и лактата. Нами было показано, что содержание животных на высокожировом рационе способствует формированию гипоксии, о чём свидетельствует накопление пирувата и лактата в мышечной ткани и эритроцитах [2].

После введения симвастатина в мышцах животных группы 2 (экспериментальной) выявлено снижение концентрации пировиноградной кислоты на 58% (p₁ <0,001) и лактата на 32,36% (p₁ <0,001) относительно группы 1 (сравнения; табл. 2).

Таблица 2. Концентрация метаболитов гликолиза (M±m)

Примечание: р — статистическая значимость различий относительно контрольной группы; р₁ — относительно группы сравнения.

Полученные данные, с одной стороны, свидетельствуют о снижении тяжести гипоксического повреждения клетки. С другой стороны, можно полагать, что подавление биосинтеза эндогенного холестерина вследствие ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А редуктазы (ГМГ-КоА редуктазы), несмотря на сохраняющийся характер питания, способствовало нивелированию гиперметаболизма глюкозы.

В ранее проведённых нами экспериментах в мышцах животных с экспериментальной гиперхолестеринемией были выявлены разнонаправленные изменения актив­ности ферментов антиоксидантной защиты. У данной группы животных было отмечено значительное увеличение активности глутатионредуктазы, каталазы и содержания восстановленного глутатиона (более чем в 2 раза) по сравнению с животными, находящимися на общем рационе. В то же время активность супероксиддисмутазы достоверно не отличалась от показателей контрольной группы, а глутатионпероксидазы — была снижена на 50% [1] (табл. 3).

Таблица 3. Активность ферментов антиоксидантной защиты в мышцах животных с экспериментальной гиперхолестеринемией до и после введения симвастатина

Примечание: р — статистическая значимость различий относительно контрольной группы; р₁ — относительно группы сравнения.

Выявленные нами изменения согласуются с данными литературы, согласно которым длительное содержание животных на высокожировом рационе способствует снижению буферной ёмкости антиоксидантной защиты, нарушению её мобилизации в ответ на повышение активности прооксидантной системы [7].

Введение симвастатина экспериментальным животным (группа 2) способствовало снижению активности супероксиддисмутазы на 56,2% (p₁ <0,001), активность каталазы осталась без изменений относительно показателей животных группы сравнения (группы 1; см. табл. 3).

В исследуемой группе выявлены значительные изменения активности глутатионзависимых ферментов: дальнейшее снижение активности глутатионпероксидазы на 63,13% (p₁ <0,001), глутатионредуктазы — на 37,5% (p₁ <0,001), концентрации восстановленного глутатиона — на 49,83% (p₁ <0,001) относительно показателей группы 1.

Анализируя полученные, данные можно отметить, что метаболический ответ мышечной ткани на введение высокой дозы симвастатина проявляется резким снижением активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы.

Полученные нами данные согласуются с результатами В.З. Ланкина и соавт. [8], согласно которым статины ­обладают ­прооксидантным действием, о чём свидетельствуют повышение окисляемости биомембран и снижение сократительной активности миокарда в эксперименте при моделировании окислительного стресса путём введения водорода пероксида. В то же время снижение уровня восстановленного глутатиона относительно группы сравнения может быть обусловлено влиянием гипоксии, которая способствует истощению восстановленного глутатиона как в цитозоле, так и в митохондриях, увеличивая оксидативное повреждение [9]. Комплекс биохимических изменений в мышечной ткани способствует её деградации, что подтверждается выявленными структурными изменениями.

У животных экспериментальной группы (группа 2), было зарегистрировано снижение содержания NT-изоформы тайтина до 0,019 и более, N2A-изоформы — до 0,091 и более, практически полное отсутствие небулина по сравнению с животными группы сравнения (группы 1). При этом регистрировали увеличение содержания протеолитических фрагментов тайтина (Т2) в 1,3 раза (рис. 1).

Рис. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле; ТЦМ — тяжёлые цепи миозина

Исследования последних десятилетий показали, что сократительная активность саркомера зависит от полноценности гигантского белка поперечнополосатых мышц тайтина, выполняющего полифункциональную роль в саркомере. Тайтин имеет ключевое значение в обеспечении высокоупорядоченной структуры саркомера поперечнополосатых мышц, регуляции актин-миозинового взаимодействия, внутри­клеточных взаимодействиях [10]. Уменьшение содержания тайтина обусловлено преобладанием процессов протеолиза этого белка над его синтезом, что приводит к нарушению упорядоченной структуры мышечного волокна.

Поскольку нарушение структуры тайтина развивается при различной патологии мышечной ткани [10], можно полагать, что снижение уровня тайтина служит показателем, информативно отражающим наличие дистрофических процессов в мышце, и является критерием диагностики миопатии.

Выводы

1. Анализируя полученные данные, можно полагать, что один из молекулярных механизмов, лежащих в основе миотоксичности статинов при их длительном применении, — дезинтерация ферментов антиоксидантной защиты, что обусловливает усиление прооксидантных процессов, активации протеолиза важнейших макромолекул, лежащих в основе структурно-функциональной деградации мышечного волокна.

2. Полученные результаты дают основание использовать их как теоретическую основу для разработки схем метаболической коррекции при применении высокодозовой терапии статинами для поддержания функционального состояния скелетной мускулатуры. Определение уровня тайтина в биоптатах можно использовать как выявление раннего маркёра мышечной дистрофии.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

E V Vinogradova

Author for correspondence.
Email: mod8792@mail.ru
Rostov-on-Don, Russia

References

Supplementary files