Некоторые клинико-морфологические и молекулярно-генетические аспекты у пациенток с клиническими признаками наследственного рака молочной железы

Полный текст

Рак молочной железы (РМЖ) среди многочисленных заболеваний у представительниц женского пола представляет очень серьёзную проблему из-за очень высокой заболеваемости и смертности от него [1]. На современном этапе РМЖ нельзя рассматривать как единообразное заболевание [2]. Существуют данные о корреляции ­известных клинических и фенотипических различий на уровне экспрессии генов [3].

Ещё в 1980-х годах «наследственный РМЖ» (НРМЖ) был выделен как особая нозологическая единица. Этиопатогенетический механизм развития НРМЖ опосредован нарушениями в генах репарации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) различной степени пенетрантности [4]. По полученным ранее данным, большинство случаев клинически НРМЖ ассоциировано с мутациями в генах BRCA1/2 [5, 6].

Кроме того, выделена стандартная панель исследования, включающая тестирование определённых экзонов, мутации в которых наиболее часто встречаются среди европейцев. Разработаны методики полногеномного секвенирования, однако их рутинное применение ограничено высокой стоимостью исследования [7, 8]. Нерешёнными остаются и вопросы применения прогностических маркёров и предикторов у больных клинически НРМЖ в ежедневной практике онколога [9, 10].

В исследование была включена 191 пациентка с верифицированным РМЖ I–IIа стадии и клиническими признаками НРМЖ, которые проходили лечение в Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте. Учитывали такие клинические признаки НРМЖ, как первично-множественный процесс (РМЖ и рак яичника — синхронные и метахронные), семейный онкологический анамнез (РМЖ, рак яичника), молодой возраст начала заболевания (до 50 лет), тройной негативный подтип опухоли [11].

В целях выявления мутаций в генах ВRCA1/2 выполняли молекулярно-генетический анализ ДНК из лейкоцитов периферической крови. Для исследования у пациенток забирали периферическую венозную кровь в объёме 5 мл в вакуумные пробирки GreenVac-Tube (Корея) с антикоагулянтом ЭДТА-К2. Лейкоциты выделяли из цельной крови путём гемолиза эритроцитов добавлением 0,84% раствора NH4Cl в сочетании с последовательным центрифугированием и отмывкой 0,9% раствором NaCl [12]. Геномную ДНК экстрагировали с использованием лизирующего SDS-содержащего буфера в присутствии протеиназы-К и последующей фенол-хлороформной экстракции [13].

Концентрацию полученных препаратов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0 (Invitrogen, США) с использованием набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity AssayKit (Invitrogen, США). Для наработки ампликонов концентрацию образцов ДНК нормализовывали до величины 2 нг/мкл. Детекцию мутаций проводили с использованием набора «BRCA-скрин» (Интерлабсервис, Россия) методом пиросеквенирования на оборудовании PyroMark Q24 (Qiagen, Germany).

Определяемые мутации в генах BRCA1/BRCA2 представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Исследуемые мутации

Локус	Полиморфизм
BRCA1	185delAG
BRCA1	300T>G (C61G)
BRCA1	2080delA
BRCA1	4153delA
BRCA1	5382insC
BRCA2	6174delT

 

По результатам тестирования первую клиническую группу составили 27 больных, у которых была подтверждена мутация генов BRCA1/2. Во вторую группу были отобраны 33 пациентки, у которых не была подтверждена мутация генов BRCA1/2. Обе группы были сопоставимы по клиническим признакам. Третья группа (контрольная) была сформирована из 30 больных спорадическим РМЖ. Эти группы в дальнейшем изучали в сравнительном аспекте.

Исследования соответствовали установленным этическим стандартам. Для уточнения анамнестических данных осуществляли индивидуальное анкетирование больных. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей, которые предназначались для выполнения стандартного морфологического исследования. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по отработанной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-Link Thermo. Для визуализации ИГХ-реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System.

Срезы докрашивали ­гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount. Оценку полученных результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа Leica (Германия) под увеличением ×10, ×20, ×40. При помощи Nottingham grading system (Elston and Ellis, 1991) определяли ­гистологическую степень злокачественности опухоли, а также рецепторы прогестерона, эстрогенов, андрогенов, нормальный и мутантный типы р53, Е-кадгерин, Bсl-2, Ki67 и Topo2α.

Материалом для проведения ДНК-проточной цитометрии служили образцы опухолей больных, вошедших в исследование. Для ДНК-анализа в ткани опухоли использовали CycleTESTTMPLUS DNA Reagent Kit. При помощи компьютерной программы ModFit LT, которая позволяет анализировать плоидность и распределение клеток опухоли по фазам клеточного цикла и детализировать число клеток в фазах S и G2+М, обрабатывали полученные результаты.

Долю клеток с различным содержанием ДНК на гистограмме вычисляли как процент общего числа исследованных клеток. Опухоль считали диплоидной, если выявлялся один пик, который соответствовал нормальному содержанию ДНК в ядрах клеток. При наличии пиков, отличающихся от диплоидного, опухоль расценивали как анеуплоидную. Для оценки степени анеуплоидии определяли индекс ДНК (ИДНК). Он представляет собой соотношение между значением канала пика G0/G1 ­опухолевого образца и значением канала пика G0/G1 нормального (диплоидного) образца. ИДНК диплоидных клеток соответствовал 1,0, следовательно, ИДНК анеуплоидных клеток был больше или меньше 1,0.

Индекс пролиферации вычисляли как суммарное число клеток опухоли, находящихся в S- и G2+М-фазах клеточного цикла [14].

Определение белков СА 15-3 и sHER-2 neu в сыворотке крови проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Для подготовки образцов, постановки и учёта реакции использовали инструкцию к диагностическому набору для определения sHER-2 neu производства Platinum ELISA BMS 207, eBiocience (Австрия) и Вектор-Бест для СА-15-3. Для встряхивания проб использовали орбитальный шейкер для микропланшетов, скорость 600–800 об./мин (Stat FAX 2000, USA), для промывания лунок — автоматическое устройство Аквамарин (Россия), для учёта — фотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм (Униплан, Россия).

Частота герминальных мутаций в исследуемой группе пациенток с клинически НРМЖ составила 27 (13,1%) случаев: BRCA1 5382 insC — 25 случаев, BRCA1 300T >G — 2 случая. Таким образом, частота и спектр выявленных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных РМЖ в Ростовской области соответствует общероссийским показателям (p >0,05). Нужно отметить, что обе группы больных клинически НРМЖ в сравнении со спорадическим характеризовались достаточно высокой частотой самого неблагоприятного подтипа с клинической точки зрения — тройного негативного подтипа опухоли (рис. 1, а). При этом в первой группе он определялся в 3 раза чаще, чем во второй, а люминальные подтипы — наоборот, в 1,5 раза реже. Также не было выявлено и ассоциации с HER2-neu+-статусом опухоли (рис. 1, б).

 

Рис. 1. Распределение больных: а — основных и контрольной групп по биотипу опухоли; б — люминальным раком молочной железы (РМЖ) основных и контрольной групп в зависимости от HER2-neu-статуса; статистически значимые различия (p <0,05) относительно: ¹первой группы; *второй группы; •третьей группы; THP — тройной негативный подтип опухоли

 

Далее освещены только полученные статистически значимые различия. В обеих группах клинически НРМЖ был отмечен относительно высокий уровень бесплодия, как первичного, так и вторичного (табл. 2).

 

Таблица 2. Частота бесплодия в анамнезе у больных клинических групп

Признак	Первая группа (n=27), абс. (%)	Вторая группа (n=33), абс. (%)	Третья группа (n=30), абс. (%)	р
Всего	6 (22,2%)	2 (6,1%)	—	<0,05
Первичное бесплодие	3 (11,1%)	1 (3%)	—	>0,05
Вторичное бесплодие	3 (11,1%)	1 (3%)	—	>0,05

 

Клинически НРМЖ отличался от спорадического и по ИГХ-показателям: частота гиперэкспрессии p53 выше в 1,3–1,4 раза, рецепторов андрогенов — в 1,9–2,1 раза (р <0,05; рис. 2).

 

Рис. 2. Частота гиперэкспрессии р53 и рецепторов андрогенов (РА) в опухолях больных клинических групп; *различия достоверны в отношении третьей группы (р <0,05)

 

Установлены статистически значимые различия ДНК-цитометрических характеристик клинически НРМЖ и спорадического: снижение среднего содержания анеуплоидных клеток (33,8±6,7 и 31,7±7,1% — ­против 58,6±6,5% соответственно), снижение индекса пролиферации и диплоидных, и анеуплоидных опухолей: 4,9±1,1 и 13,6±2 клинически НРМЖ BRCA+ и 3,3±0,9 и 10,6±2,8 клинически НРМЖ BRCA– против 7,9±1,7 и 21,5±5,8.

Интересен тот факт, что несмотря на общие черты обеих групп клинически НРМЖ, они имели и ряд отличий по клинико-анамнестическим характеристикам и по ИГХ-данным. Частота бесплодия в первой группе в 3,5 раза превышала аналогичный показатель во второй группе (см. табл. 1), отмечено сниженное количество беременностей и медицинских абортов, более старший возраст на момент первой беременности (табл. 3).

 

Таблица 3. Репродуктивный анамнез больных клинических групп

Показатель	Первая группа (n=27) M±m	Вторая группа (n=33) M±m	Третья группа (n=30) M±m	р
Количество беременностей	3,0±0,39	4,24±0,46	4,3±0,38	p1–2 <0,05 p1–3 <0,05 p2–3 >0,05
Возраст при первой беременности, годы	25,5±0,67	21,2±0,41	22,4±0,74	p1–2 <0,05 p1–3 <0,05 p2–3 >0,05
Количество абортов	1,5±0,47	2,41±0,49	2,63±0,40	p1–2 <0,05 p1–3 <0,05 p2–3 >0,05

 

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что больные первой группы достоверно чаще отметили в анамнезе факт приёма пероральных контрацептивов, а также более длительное их применение по сравнению с другими группами (табл. 4). На наш взгляд, эти данные необходимо учитывать при динамическом наблюдении за здоровыми женщинами-носительницами BRCA-мутаций, которым, видимо, стоит отказаться от подобной терапии.

 

Таблица 4. Особенности приема пероральных контрацептивов у больных клинических групп

Показатели	Первая группа (n=27)	Вторая группа (n=33)	Третья группа (n=30)	р
Приём гормональных контрацептивов, абс. (%)	9 (33,4%)	3 (9,1%)	1 (3,3%)	p1–2 <0,05 p1–3 <0,05 p2–3 >0,05
Длительность приёма контрацептивов, годы	6,7±0,9	2,5±0,9	1,3±0,7	p1–2 <0,05 p1–3 <0,05 p2–3 >0,05

 

При ИГХ-исследовании выявлены различия по уровню экспрессии BCL2 в BRCA+ опухоли: повышение в 1,8 раза по сравнению со второй группой (рис. 3).

 

Рис. 3. Частота гиперэкспрессии BCL2 в опухолях больных клинических групп; статистически значимые различия (p <0,05) относительно: ¹первой группы, *второй группы, •третьей группы

 

Наличие мутации в гене BRCA у больных РМЖ с большей частотой ­сопровождалось присутствием sHER-2/neu (18,62±2,35 нг/мл), чем при клинически НРМЖ BRCA– (9,78±0,99 нг/мл) и спорадическом РМЖ (12,09±2,78 нг/мл), и при этом не зависело от подтипа опухоли. С учётом статистически недостоверно более высокой частоты подтипа HER-2/neu+ и отсутствия подтипа HER-2/neu+люминального В среди больных первой группы происхождение его экстрацеллюлярного домена в сыворотке крови не вполне ясно. Однако по данным литературы можно предположить, что повышение уровня sHER2 способно предшествовать метастазированию, а также является прогностическим фактором более низкой бессобытийной и общей выживаемости и предиктивным фактором слабого ответа на гормонотерапию и некоторые режимы химиотерапии [15].

Выводы

1. По ряду клинико-морфологических и молекулярно-генетических показателей (молодой возраст на момент манифестации заболевания, высокая частота ­тройного ­негативного подтипа опухоли, наличие бесплодия в анамнезе, повышенный уровень экспрессии р53 и рецепторов андрогенов, сниженное содержание анеуплоидных клеток и индекса пролиферации в опухоли) клинически наследственный рак молочной железы отличается от спорадического рака молочной железы.

2. Данные показатели могут быть в перспективе использованы как критерии для отбора больных клинически наследственным раком молочной железы без подтверждённой мутации BRCA1/2 по стандартной панели для более углублённого генетического обследования.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Об авторах

Юлиана Сергеевна Шатова

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт

Автор, ответственный за переписку.
Email: doctor-ea@mail.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия

Елизавета Александровна Чеботарёва

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт

Email: doctor-ea@mail.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия

Елена Юрьевна Златник

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт

Email: doctor-ea@mail.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия

Инна Арнольдовна Новикова

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт

Email: doctor-ea@mail.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия

Дмитрий Игоревич Водолажский

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт

Email: doctor-ea@mail.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия

Елена Алексеевна Дженкова

Ростовский научно-исследовательский онкологический институт

Email: doctor-ea@mail.ru
г. Ростов-на-Дону, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы