Роль белков О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы и р53 в ответе клеток нейробластомы на воздействие алкилирующего агента темозоломида
- Авторы: Хуснутдинов Р.Р.1, Бойчук С.В.1
-
Учреждения:
- Казанский государственный медицинский университет
- Выпуск: Том 99, № 1 (2018)
- Страницы: 47-53
- Тип: Экспериментальная медицина
- Статья получена: 06.02.2018
- Статья опубликована: 15.02.2018
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/7808
- DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2018-047
- ID: 7808
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Цель. Изучить роль белка р53 и О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы в чувствительности клеток нейробластомы к действию темозоломида.
Методы. Исследование проводили на клеточной линии нейробластомы SK.N.SH, культивируемой в среде DMEM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков пенициллина-стрептомицина в стандартных условиях (37 °C и 5% СО2). Клетки инкубировали с алкилирующим агентом темозоломидом в течение 48-72 ч. В ряде случаев осуществляли преинкубацию клеток в течение 2 ч с О6-бензилгуанином (ингибитором О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы) или нутлином-3а (реактиватором р53). Пролиферативную активность оценивали с помощью системы многопараметрического анализа клеточных культур (RTCA iCELLigence), а также колориметрического MTS-теста. Экспрессию белков определяли методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих моноклональных антител.
Результаты. Реактивация белка р53 приводила к значительному снижению скорости пролиферации клеток линии SK.N.SH. Цитотоксический эффект данного препарата более выражен по сравнению с темозоломидом, считающимся препаратом выбора при проведении химиотерапии пациентам с мультиформной глиобластомой и нейробластомой. Ингибирование О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы также приводило к усилению цитотоксического эффекта темозоломида, тем не менее, цитотоксический эффект химиопрепарата был менее выраженным по сравнению с действием темозоломида на фоне реактивации белка р53.
Вывод. Для оценки чувствительности клеток нейробластомы к действию алкилирующего препарата темозоломида функциональное состояние белка р53 в опухолевых клетках служит более важным прогностическим критерием по сравнению с уровнем экспрессии О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы; кроме того, реактивация белка р53 приводит к снижению скорости пролиферации клеток нейробластомы линии SK.N.SH и их гибели по механизму апоптоза.
Ключевые слова
Полный текст
Нейробластомы — разновидность сόлидных злокачественных новообразований, возникающих из эмбриональных нейробластов симпатической нервной системы. Это наиболее частая экстракраниальная солидная бластома, встречающаяся у детей, составляющая до 14% всех новообразований детского возраста [1]. Агрессивный характер роста опухоли и её резистентность к большинству современных химиопрепаратов — главные факторы, определяющие неблагоприятный прогноз заболевания. Выживаемость детей с тяжёлой формой нейробластомы составляет всего 34%, несмотря на применение агрессивных форм лечения [2].
Темозоломид (ТМЗ) — алкилирующий агент, представляющий собой липофильное пролекарство. Служит препаратом выбора для проведения химиотерапии пациентам с некоторыми типами злокачественных новообразований, например мультиформной глиобластомой, а также нейробластомой. Это обусловлено, в частности, способностью препарата проходить через гематоэнцефалический барьер и индуцировать повреждения (алкилирование) молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), в результате чего происходит образование одно- и двунитевых разрывов, приводящих в конечном счёте к запуску программы апоптоза и/или клеточного старения в опухолевых клетках [3].
Внедрение данного препарата в практическую онкологию позволило улучшить прогноз заболевания и повысить медиану выживаемости у пациентов с мультиформной глиобластомой. К примеру, было показано, что медиана выживаемости для пациентов, в отношении которых применяли лучевую терапию в сочетании с ТМЗ, составляла 15 мес, в то время как без лечения данный показатель обычно не превышает 5–6 мес [4, 5]. Аналогичным образом были получены данные, подтверждающие высокую эффективность использования ТМЗ у пациентов с рецидивирующими и рефрактерными формами нейробластом [6, 7].
Тем не менее, неоднородность ответа вышеуказанных злокачественных новообразований на воздействие данного алкилирующего агента, обусловленная отсутствием чётко обозначенных молекулярных диагностических маркёров, определяющих чувствительность/резистентность вышеназванных опухолей в ответ на проведение химиотерапии ТМЗ, продолжает оставаться актуальной проблемой как для экспериментальной, так и для практической онкологии.
В настоящее время существует несколько точек зрения о формировании молекулярных механизмов резистентности нейробластом к действию ТМЗ. Одним из наиболее общепризнанных является уровень экспрессии в опухоли фермента О6-метилгуанин-ДНК-метилтранферазы (MGMT), способной перемещать ТМЗ-индуцированный алкильный радикал с гуанина на остаток цистеина в своём активном центре, тем самым обеспечивая эффективную репарацию вышеуказанных повреждений ДНК [8]. Тем не менее, результаты исследований последних лет показали отсутствие выраженной корреляции между уровнем экспрессии MGMT в опухолевых клетках и их ответом на воздействие алкилирующих агентов, в частности ТМЗ [9].
Другой фактор, способный оказать влияние на формирование резистентности опухолевых клеток к ТМЗ, — функциональная активность системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов ДНК (MMR-mismatch repair), включающей целый спектр белков, в первую очередь MSH2 и MSH6. Данная система репарации повреждений ДНК имеет большое значение для поддержания контроля «правильности» процессов репликации ДНК и активации соответствующих сигнальных путей при повреждении ДНК. В исследованиях некоторых авторов была обнаружена корреляционная зависимость между нарушениями в данной системе репарации повреждений ДНК и повышением устойчивости клеток глиобластом к воздействию ТМЗ [10].
Кроме того, важным диагностическим маркёром, способным, на наш взгляд, определять характер ответа опухолевых клеток на воздействие ТМЗ, служит функциональная активность гена-онкосупрессора ТР53. Белок р53, кодируемый одноимённым геном, является ключевым регулятором множества клеточных процессов, в числе которых апоптоз, активация так называемых «чек-пойнтов» и остановка клеток в одной из фаз клеточного цикла, клеточное старение [11]. К примеру, у пациентов с мультиформной глиобластомой мутации данного онкосупрессора бывают достаточно частой находкой и обнаруживаются более чем у трети пациентов [12], что, на наш взгляд, может являться фактором, определяющим гетерогенность ответа пациентов с данным заболеванием на проведение химиотерапии ТМЗ.
Целью нашего исследования было определение прогностической значимости уровней экспрессии и функционального состояния всех вышеуказанных факторов (МGMT, элементов системы MMR и функционального состояния белка р53) в ответе опухолевых клеток нейробластомы на воздействие алкилирующого агента ТМЗ.
Исследования проведены на клеточной линии SK.N.SH (ATCC, США). Клетки культивировали в стандартных условиях (37 °C и 5% СО2) в культуральной среде DMEM (ПанЭко) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco) и антибиотиков пенициллина-стрептомицина (Sigma). Клетки подвергали воздействию алкилирующого агента ТМЗ (Sigma) в отдельности, а также в комбинации со специфическим ингибитором MGMT — О6-бензилгуанином (Sigma) и реактиватором р53 — нутлином-3а (Sigma) в концентрациях 30 и 10 мкМ соответственно.
Уровень экспрессии белков определяли методом вестерн-блоттинга. Клеточные экстракты получали посредством лизиса клеток в радиоиммунопреципитационном буфере с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз. Образцы (30 мкг) разделяли в 7,5 и 12% полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану посредством влажного трансфера. Инкубацию с первичными моноклональными антителами к белку р53 (общей и фосфорилированной формах; Santa Cruz Biotechnology), MGMT (Abcam), MSH2, MSH6 и маркёру апоптоза (расщеплённой форме каспазы-3; Cell Signaling) проводили при 4 °C в течение 16 ч. Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой (Santa Cruz Biotechnology), добавляли в концентрации 1:1000, после чего мембраны инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и визуализировали с посредством хемилюминесценции (Vilber Lourmat).
Для оценки жизнеспособности клетки засевали в 96-луночный планшет в концентрации 3,2×104 в лунку и через 24 ч подвергали инкубации с вышеуказанными соединениями в отдельности, а также в комбинации с химиопрепаратом ТМЗ. Спустя 48–72 ч культивирования клеток проводили колориметрический MTS-тест с использованием реагента CellTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder (Promega) на планшетном анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific).
Пролиферативную активность опухолевых клеток оценивали с помощью системы многопараметрического анализа клеточных культур RTCA iCELLigence (ACEA, Biosciences). Для этого клетки в концентрации 5×104 засевали в 8-луночные планшеты и подвергали дальнейшему анализу.
На начальном этапе нашего исследования была проанализирована пролиферативная активность опухолевых клеток в условиях инкубации с вышеуказанными препаратами в отдельности, а также при их комбинированном использовании. Ожидаемо ТМЗ оказывал умеренный ингибирующий эффект в отношении роста опухолевых клеток (рис. 1). Примечательно, что ингибирование MGMT при помощи О6-бензилгуанина приводило к усилению эффекта ТМЗ, при этом сам O6-BG ингибирующего эффекта на пролиферативную активность опухолевых клеток не оказывал (см. рис. 1, А). Было обнаружено значительное подавление скорости пролиферации опухолевых клеток в условиях реактивации белка-онкосупрессора р53 с помощью нутлина-3а (см. рис. 1, Б).
Рис. 1. Пролиферативная активность клеток в условиях преинкубации в течение 2 ч с О6-бензилгуанином (О6BG; А) и нутилином (NTL; Б) и последующим добавлением темозоломида (TMZ) в концентрации 200 мкМ
Результаты колориметрического MTS-теста подтвердили значительное усиление гибели клеток нейробластомы в условиях реактивации белка р53. Также было показано усиление цитотоксического эффекта ТМЗ в отношении клеток нейробластомы на фоне предварительного ингибирования активности MGMT в опухолевых клетках (рис. 2).
Рис. 2. Цитотоксичность алкилирующего агента темозоломида (TMZ) в отдельности и в сочетании с ингибитором О6-метилгуанин-ДНК-метилтранферазы (О6-бензилгуанином — O6BG) и реактиватором р53 (нутилином — NTL)
Следующим этапом исследования было изучение уровней экспрессии вышеуказанных факторов в опухолевых клетках. Результаты иммуноблоттинга выявили значительное увеличение уровня экспрессии общей формы белка р53, что коррелировало с уменьшением скорости пролиферации клеток (рис. 3). Экспрессия белков MGMT, MSH2 и MSH6, напротив, уменьшалась.
Рис. 3.Уровни экспрессии белка О6-метилгуанин-ДНК-метилтранферазы (MGMT), р53 и его фосфорилированной формы (pP53Ser15), белков системы MMR (MSH2 и MSH6), расщеплённой формы каспазы-3 (сl.casp3) в условиях инкубации с темозоломидом (TMZ), нутлином-3а (NTL), О6-бензилгуанином (O6BG), а также их комбинацией в течение 72 ч
Примечательно, что при воздействии химиопрепарата ТМЗ в отдельности и, особенно, на фоне комбинированного воздействия данного химиопрепарата и ингибитора MGMT происходила выраженная активация белка р53, о чём свидетельствовало повышение уровня экспрессии фосфорилированной формы данного белка. При этом различия в уровнях экспрессии вышеуказанных факторов не были обусловлены различной «белковой нагрузкой» в исследуемых лизатах опухолевых клеток, что подтверждалось одинаковым уровнем экспрессии белка актина во всех исследованных образцах.
Важно отметить, что нами также было обнаружено значительное усиление гибели опухолевых клеток по механизму апоптоза в условиях реактивации белка р53
и/или ингибирования MGMT при наличии повреждений ДНК, индуцированных ТМЗ. Об этом свидетельствовало усиление уровня экспрессии расщеплённой формы каспазы-3, служащей общепризнанным маркёром гибели клеток по механизму апоптоза. При этом максимальное усиление гибели клеток происходило в условиях комбинированного воздействия химиопрепарата и реактиватора белка р53 (см. рис. 3).
Полученные нами результаты свидетельствуют о высокой цитотоксической активности нутлина-3а в отношении опухолевых клеток нейробластомы линии SK.N.SH. Важно отметить, что цитотоксический эффект данного препарата был более выражен по сравнению с эффектом алкилирующего агента ТМЗ, рассматриваемого в настоящее время в качестве «золотого стандарта» при проведении химиотерапии больным с некоторыми типами злокачественных новообразований нервной системы, в частности мультиформной глиобластомой. Более того, нами было обнаружено усиление гибели опухолевых клеток по механизму апоптоза в условиях комбинированного воздействия вышеуказанных препаратов.
Известно, что основным механизмом действия нутлина-3а является реактивация р53, что в условиях повреждений ДНК может приводить к остановке клеточного цикла в фазах G1 и G2. Это, по мнению некоторых авторов, может оказывать цитопротективное действие на нетрансформированные клетки при проведении химио- и радиотерапии [13–15]. При этом одним из механизмов, регулирующих продвижение клеток по фазам клеточного цикла, считается активация ингибитора пан-циклин-зависимой киназы р21 [16].
Кроме того, некоторыми исследователями в опухолевых клетках глиобластом при воздействии ТМЗ были обнаружены признаки активации программы клеточного старения, о чём, в частности, свидетельствовал высокий уровень экспрессии β-галактозидазы, служащей общепризнанным маркёром данного процесса. По мнению большинства исследователей, остановка клеточного цикла и реализация программы клеточного старения в условиях реактивации белка р53 являются наиболее вероятными по сравнению с запуском программы апоптоза [17–18].
Тем не менее, результаты наших исследований показывают отсутствие морфологических признаков, характерных для клеточного старения, в клетках, подвергнутых воздействию алкилирующего агента ТМЗ как в отдельности, так и в условиях реактивации белка р53. Более того, усиление уровня экспрессии расщеплённой формы каспазы-3 свидетельствует об обратном: запуск программируемой клеточной гибели является преобладающим процессом по сравнению с остановкой процессов клеточного деления и старения. Подобные различия могут быть обусловлены молекулярно-фенотипическими особенностями различных клеточных линий глио- и нейробластом, используемых различными исследовательскими группами.
В настоящем исследовании была использована клеточная линия SK.N.SH, которая имеет «дикий» тип р53 и MGMT, что, на наш взгляд, позволило наиболее корректно оценить влияние данных факторов в отношении чувствительности опухолевых клеток к алкилирующему соединению ТМЗ.
Таким образом, в результате проведённых исследований были получены данные о том, что опухолевые клетки нейробластомы линии SK.N.SH в малой степени чувствительны к воздействию ТМЗ. При этом преинкубация клеток со специфическим ингибитором белка MGMT приводила к усилению эффекта химиопрепарата. Важно отметить, что наиболее выраженное подавление роста опухолевых клеток происходило в условиях реактивации белка р53, при которых клетки практически теряли свою пролиферативную активность. Нами также было отмечено значительное снижение уровня экспрессии белка МGMT в данных экспериментальных условиях, что может свидетельствовать об отрицательной обратной связи между данными факторами.
Вывод
Основным выводом, полученным в результате проведённых исследований, следует считать получение доказательств о преобладающей роли оценки функционального статуса белка р53 в качестве предиктора ответа опухолевых клеток нейробластом на воздействие алкилирующего агента темозоломида. В свою очередь уровень экспрессии и функциональную активность фермента О6-метилгуанин-ДНК-метилтранферазы следует расценивать как менее значимые параметры для оценки восприимчивости нейробластом к действию темозоломида.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.
Исследования выполнены при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (РНФ) №14-15-00342.
Об авторах
Рамиль Рамисович Хуснутдинов
Казанский государственный медицинский университет
Автор, ответственный за переписку.
Email: boichuksergei@mail.ru
г. Казань, Россия
Сергей Васильевич Бойчук
Казанский государственный медицинский университет
Email: boichuksergei@mail.ru
г. Казань, Россия
Список литературы
- Schwab M., Westermann F., Hero B., Berthold F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 2003; 4 (8): 472-480. doi: 10.1016/S1470-2045(03)01166-5.
- Brodeur G.M. Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma. Nat. Rev. Cancer. 2003; 3 (3): 203-216. doi: 10.1038/nrc1014.
- Günther W., Pawlak E., Damasceno R. et al. Temozolomide induces apoptosis and senescence in glioma cells cultured as multicellular spheroids. Br. J. Cancer. 2003; 88 (3): 463-469. doi: 10.1038/sj.bjc.6600711.
- Johnson D.R., O’Neill B.P. Glioblastoma survival in the United States before and during the temozolomide era. J. Neuro-Oncol. 2012; 107 (2): 359-364. doi: 10.1007/s11060-011-0749-4.
- Krex D., Klink B., Hartmann C. et al. Long-term survival with glioblastoma multiforme. Brain. 2007; 130 (Pt. 10): 2596-2606. doi: 10.1093/brain/awm204.
- De Sio L., Milano G.M., Castellano A. et al. Temozolomide in resistant or relapsed pediatric solid tumors. Pediatr. Blood Cancer. 2006; 47 (1): 30-36. doi: 10.1002/pbc.20516.
- Rubie H., Chisholm J., Defachelles A.S. et al. Société Françaisedes Cancers de l’Enfant, United Kingdom Children Cancer Study Group-New Agents Group Study: Phase II study of temozolomide in relapsed or refractory high-risk neuroblastoma: a joint Société Française des Cancers de l’Enfant and United Kingdom Children Cancer Study Group-New Agents Group Study. J. Clin. Oncol. 2006; 24: 5259-5264. doi: 10.1200/JCO.2006.06.1572.
- Pegg A.E. Properties of mammalian O6-alkylguanine-DNA transferases. Mutat. Res. 1990; 233: 165-175. doi: 10.1016/0027-5107(90)90160-6.
- Ramalho-Carvalho J., Pires M., Lisboa S. et al. Altered Expression of MGMT in high-grade gliomas results from the combined effect of epigenetic and genetic aberrations. PLoS One. 2013; 8 (3): e58206. doi: 10.1371/journal.pone.0058206.
- Goellner E.M., Grimme B., Brown A.R. et al. Overcoming temozolomide resistance in glioblastoma via dual inhibition of NAD+ biosynthesis and base excision repair. Cancer Res. 2011; 71 (6): 2308-2317. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-3213.
- Itahana K., Dimri G., Campisi J. Regulation of cellular senescence by p53. Eur. J. Biochem. 2001; 268: 2784-2791. doi: 10.1046/j.1432-1327.2001.02228.x.
- Chin L., Meyerson M., The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 2008; 455: 1061-1068. doi: 10.1038/nature07385.
- Ingeborg M.M. van Leeuwen, Bhavya Rao, Marijke C.C. Sachweh, Laín S. An evaluation of small-molecule p53 activators as chemoprotectants ameliorating adverse effects of anticancer drugs in normal cells. Cell Cycle. 2012; 11 (9): 1851-1861. doi: 10.4161/cc.20254.
- Apontes P., Leontieva O.V., Demidenko Z.N. et al. Exploring long-term protection of normal human fibroblasts and epithelial cells from chemotherapy in cell culture. Oncotarget. 2011; 2: 222-233. doi: 10.18632/oncotarget.248.
- Carvajal D., Tovar C., Yang H. et al. Activation of p53 by Mdm2 antagonists can protect proliferating cells from mitotic inhibitors. Cancer Res. 2005; 65: 1918-1924. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-04-3576.
- Xiong Y., Hannon G.J., Zhang H. et al. p21 is a universal inhibitor of cyclin kinases. Nature. 1993; 366 (6456): 701-704. doi: 10.1038/366701a0.
- Tovar C., Rosinski J., Filipovic Z. et al. Small-molecule MDM2 antagonists reveal aberrant p53 signaling in cancer: Implications for therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103 (6): 1888-1893. doi: 10.1073/pnas.0507493103.
- Villalonga-Planells R., Coll-Mulet L., Martínez-Soler F. et al. Activation of p53 by nutlin-3a induces apoptosis and cellular senescence in human glioblastoma multiforme. PLoS One. 2011; 6 (4): e18588. doi: 10.1371/journal.pone.0018588.
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)