Клинико-патогенетические взаимосвязи молекулярной регуляции апоптоза и клеточной дифференцировки при остеоартрите

Полный текст

Остеоартрит (ОА) — распространённое заболевание соединительной ткани, затрагивающее все ткани сустава. Субхондральная кость и суставной хрящ — ключевые участники патологического процесса при ОА [1]. Одна из гипотез объясняет развитие ремоделирования и деградации хрящевой и костной тканей при ОА нарушением пролиферации, дифференцировки и апоптозом хондроцитов и остеобластов [2]. Есть основания полагать, что нарушению нормальной архитектуры сустава способствует активация матриксных протеиназ, цитокинов [3].

В последние годы большое значение в изучении патогенеза ОА отводят роли факторов транскрипции, которые запус­кают экспрессию патологических генов, приводя к нарушениям клеточной дифференцировки, пролиферации и фенотипичес­ким перестройкам [1]. Так, была доказана патогенетическая роль ядерного фактора транскрипции-κB, ядерно-цитоплазматического фактора 2, митоген-активированной киназы и других факторов активации транскриптома [4].

Активация факторов транскрипции служит, с одной стороны, защитой клеток-участников патогенеза ОА от оксидативного стресса и провоспалительных цитокинов [5], с другой — поддерживает патологические фенотипы клеточной дифференцировки и запускает апоптоз [6]. В ряде исследований было показано, что при ОА есть тенденция к усилению проапоптотических и антипролиферативных процессов в костной ткани. [3]. Принято считать, что апоптоз при ОА реализуется через сис­тему Fas-лиганда (FasL), известную также как Apo-1 и CD95 [7]. При этом Fas может принимать участие одновременно в рецепции проапоптотических внешних сигналов и быть участником формирования апоптосомы в комплексе FasL-Fas-FADD-прокаспаза-8 [7].

Нарушениям процессов клеточной дифференцировки в современной научной литературе уделяют всё большее внимание. Изучение факторов роста и дифференцировки [например, трансформирующего фактора роста β1 и mTOR (от англ. Mammalian Target Of Rapamycin — мишень для рапамицина у млекопитающих)] позволило установить их связь с провоспалительным статусом больных ОА, интенсивностью молекулярных процессов деградации внеклеточного матрикса [8]. Было показано, что низкие уровни факторов роста связаны с высоким уровнем боли у больных ОА [9].

В этом контексте актуальным представляется изучение роли фактора роста и дифференцировки 5 (GDF5 — от англ. Growth Differentiation Factor 5), который обеспечивает клеточные коммуникации и синхронизацию в процессе хондрогенной дифференцировки стволовой клетки [10]. Кроме того, высказано предположение, что GDF5 участвует в восстановлении тканей суставов [11], ингибирует апоптоз совместно с белком морфогенеза костной ткани 2 (BMP2 — от англ. Bone Morphogenetic Protein 2) через его рецептор (BMPR2) [12], стимулирует хондрогенез, активирует синтез белков внеклеточного матрикса — глюкозаминогликанов и коллагена II типа [13].

Другой потенциальный участник патогенеза ОА — ингибитор роста 1, индуцированный оксидативным стрессом (OSGIN1 — от англ. Oxidative Stress induced Growth INhibitor 1). Эффекты OSGIN1 заключаются в угнетении клеточного рост и пролиферации под влиянием активных форм кислорода [14]. OSGIN1 активирует апоптоз через зависимый от ядерно-цитоплазматического фактора 2 сигнальный каскад [15].

Научный и практический интерес современной ревматологии представляет изучение механизмов управления дифференцировкой и клеточным циклом в плане расшифровки патогенетических паттернов ОА, разработки перспективных таргетных лекарственных препаратов.

Цель исследования — установить клинико-патогенетические закономерности между уровнями апоптоза и регуляторами роста и дифференцировки (OSGIN1, GDF5) при ОА.

В условиях ревматологического кабинета Владивостокской поликлиники №3 были обследованы 65 пациентов (7 мужчин и 58 женщин) с ОА коленных суставов I–IV стадий по Kellgren в возрасте 66,5±8,0 лет. В качестве группы сравнения в исследование были включены 25 добровольцев, сопоставимых с основной группой по полу и возрасту, не имевших клиничес­ких и рентгенологических проявлений ОА.

Критерием исключения было наличие у пациента следующих заболеваний: ревматоидный артрит, системные воспалительные суставные заболевания, подагра, псевдоподагра, болезнь Педжета, охроноз, акромегалия, гемохроматоз, болезнь Вильсона, первичный синовиальный ­хондрохроматоз, хондрокальциноз, асептический некроз головки бедренной кости или костей голени, хирургические операции на коленном суставе, заболевания почек, острые соматические или хронические заболевания в стадии обострения, травмы коленных суставов и/или длительная иммобилизация в период 24 мес до включения в исследование, переломы мыщелков бедренных и проксимального отдела большеберцовых костей, а также отсутствие согласия на участие в настоящем исследовании.

Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом Тихоокеанского государственного медицинского университета. Все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании.

Для оценки суставного статуса использовали опросник WOMAC (от англ. Western Ontario and McMaster University Arthritis Index — индекс остеоартрита университетов Западного Онтарио и Макмастера) — для самостоятельной оценки больным выраженности боли (в покое и при ходьбе — 5 вопросов) и функциональной недостаточности в повседневной деятельности (сумма вопросов). Общая характеристика больных представлена в табл. 1.

 

Лабораторные методы исследования включали клинический анализ крови и мочи, биохимический анализ крови. Для определения концентраций искомых молекул в крови пациентов, включённых исследование, использовали иммуноферментный анализ. Применяли коммерческие наборы для определения Fas, GDF5, OSGIN1 (производитель: Cloud-Clone Corp., США).

Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0 (StatSoft, США). Количественные данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Достоверность различий распределения непрерывных переменных в разных группах определяли, используя непараметрический z-критерий Манна–Уитни. Связь между непрерывными переменными выявляли с помощью коэффициентов ранговой корреляции Спирмена. Статистически значимыми считали различия показателей при p <0,05.

У больных ОА (табл. 2) по сравнению с группой сравнения наблюдали статистически значимые повышения уровней Fas (z=2,5, p <0,05), GDF5 (z=3,8, p <0,05) и соотношения GDF5/OSGIN1 (z=2,6, p <0,05). Уровень OSGIN1 и соотношение GDF5/Fas были выше у больных ОА, но не имели значимых различий с контролем. У больных женского пола по сравнению с мужчинами в группе ОА выявлено достоверно более высокое содержание Fas (z=2,1, p <0,05) и значимо более низкие показатели GDF5 (z=–2,3, p <0,05). В контрольной группе различий в изучаемых показателях не было (p >0,05).

 

 

Корреляционный анализ показал, что в группе больных ОА уровень Fas обратно коррелировал с возрастом (r=–0,31, p <0,05). Соотношение GDF5/Fas прямо пропорционально возрастало по мере увеличения возраста больных ОА (r=0,39, p <0,05). У лиц без ОА выявлена прямая корреляционная закономерность между соотношением GDF5/Fas и возраста (r=0,32, p <0,05), уровень Fas не имел значимой связи с возрастом (r=–0,1, p >0,05).

Изучаемые показатели изменялись по мере прогрессирования рентгенологических симптомов ОА. Так, уровень Fas и соотношение GDF5/OSGIN1 обратно коррелировали с размерами краевых остеофитов (соответственно r=–0,32, p <0,05 и r=–0,29, p <0,05). Показатели Fas были ниже на «поздних» III–IV стадиях ОА (табл. 3) по сравнению с I и II стадиями (соответственно z=–2,0, p <0,05 и z=–2,4, p <0,05).

 

 

Уровни OSGIN1 и соотношение GDF5/Fas статистически значимо не менялись по мере прогрессирования ОА (p >0,05). Уровень GDF5 имел более низкие значения у больных с III–IV стадиями ОА по ­сравнению с I и II стадиями (соответс­твенно z=–2,1, p <0,05 и z=–2,6, p <0,05). По мере прогрессирования рентгенологических симптомов ОА происходило снижение соотношения GDF5/OSGIN1, которое было ниже на II и III стадиях по сравнению с I стадией (соответственно z=–2,0, p <0,05 и z=–2,4, p <0,05).

У всех больных ОА на момент включения в исследование присутствовали боль и функциональный дефицит, которые оценивались по русскоязычной версии анкеты WOMAC и статистически значимо коррелировали со стадией (соответственно r=0,68, p <0,05 и r=0,44, p <0,05) и продолжительностью заболевания (соответственно r=0,62, p <0,05 и r=0,87, p <0,05). Уровень боли и функционального дефицита в группе больных ОА не коррелировал с возрастом больных (соответственно r=0,08, p >0,05 и r=0,20, p >0,05).

Для оценки роли апоптоза и механизмов его регуляции в патогенезе боли при ОА все больные были разделены по уровню боли на три группы: «низкий» (5–15 баллов по WOMAC), «умеренный» (16–30 баллов), «высокий» (31–50 баллов). ­Концентрация OSGIN1, как показано в табл. 4, была статистически значимо больше у больных с «высоким» уровнем боли по сравнению с группой «низкой» боли (z=2,4, p <0,05). Уровни Fas, GDF5 и соотношение GDF5/OSGIN1 имели тенденцию к уменьшению по мере усиления боли и были достоверно ниже у больных с «высоким» уровнем боли по сравнению с больными, имевшими «низкую» боль (соответственно z=–2,3, p <0,05; z=–2,0, p <0,05 и z=–2,6, p <0,05).

 

В ряде исследований было показано, что активация ядерного фактора транскрипции­-κB — ключевой путь реализации апо­птоза при ОА [16]. Данный сигнальный каскад, как известно, инициируется внешними факторами (цитокинами, активными формами кислорода) через Fas-лиганд.

В нашем исследовании показано, что у больных OA происходит увеличение содержания Fas в плазме крови, что характеризует значимую проапоптотическую активность. Однако уровень Fas у больных ОА снижается по мере увеличения возраста пациентов, что не характерно для лиц без ОА. Подобная динамика прослеживается по мере увеличения рентгенологических симп­томов ОА. Очевидно, что по мере старения у больных ОА снижается проапоптотический потенциал.

Можно предположить, что снижение угнетения запрограммированной клеточной гибели на поздних стадиях заболевания характеризует сформированный клеточный фенотип клеток-мишеней — гипертрофичес­кую остеогенную дифференцировку хондроцитов суставного хряща и остеоподобную ­дифференцировку остеоцитов субхондральной кости [12]. Этим можно объяснить обратную корреляционную связь уровня Fas и размеров краевых остеофитов.

Фактор роста и дифференцировки GDF5 регулирует экспрессию коннексина, обес­печивает клеточные коммуникации и синхронизацию в процессе хондрогенной дифференцировки стволовой клетки [10]. GDF5 — внеклеточная сигнальная молекула, член семейства трансформирующего фактора роста β. Она участвует в развитии, поддержании и восстановлении тканей суставов [11].

GDF5 ингибирует апоптоз совместно с BMP2 через BMPR2 в стенке сосудов и не участвует в сигнальных путях активации транскрипции митоген-активированной киназы и Smad [17]. GDF5 принимает участие в нейротрофических функциях и секретируется в серотонин- и дофаминергических нейронах мозга [18]. GDF5 стимулирует хондрогенез, активирует синтез белков внеклеточного матрикса — глюкозаминогликанов и коллагена II типа [13].

Результаты нашего исследования позволяют судить о том, что по мере прогрессирования ОА снижается уровень GDF5. Этот феномен служит свидетельством депрессии регенераторных и антиапоптотических потенциалов суставного хряща и субхондральной кости. Однако нельзя исключить, что на поздних стадиях ОА регуляция апоптоза осуществляется по внутреннему пути, при этом реактивность клеток на внешние стимулы слабеет. С большой уверенностью можно предположить, что фенотипические особенности хондроцитов и остеобластов, наблюдаемые на поздних стадиях ОА, формируются на фоне снижения уровней регуляторов направления дифференцировки.

OSGIN1 угнетает клеточный рост и пролиферацию под влиянием активных форм кислорода [14]. Активация апоптоза с учас­тием данного ингибитора роста происходит через путь фактора транскрипции ядерно-цитоплазматического фактора 2 [15]. Предполагают, что активация OSGIN1 способствует угнетению клеточного цикла с целью защиты от провоспалительных атак цитокинов и оксидативного стресса [19].

Клеточное повреждение сопровождается активацией активных форм кислорода и повреждением мембран митохондрий и лизосом, то есть формированием оксидативного стресса [20]. Активные формы кислорода в свою очередь инициируют апоптоз хондроцитов, приводя к боли и дисфункции сус­тавов [21].

Результаты нашего исследования не показали достоверных различий уровня OSGIN1 у больных ОА по сравнению с контролем и по мере прогрессирования заболевания. Можно предположить, что регуляция клеточного цикла при ОА реализуется без ключевого участия фактора транскрипции — ядерно-цитоплазматичес­кого фактора 2. Однако изучение соотношения фактора роста и ингибитора (GDF5/OSGIN1) показало, что по мере прогрессирования ОА преобладают эффекты OSGIN1 по сравнению с GDF5. Это даёт основание предположить, что в условиях оксидативного стресса, наблюдаемого при ОА, OSGIN1 обеспечивает замедление дифференцировки клеток-мишеней. На начальных стадиях действует GDF5 с антагонистическим эффектом, однако соотношение GDF5/OSGIN1 изменяется по мере прогрессирования в пользу преобладания тормозных влияний OSGIN1.

Выводы

1. Активность Fas-зависимого апоптоза при остеоартрите меняется в зависимости от уровня боли: при низком и умеренном уровнях боли обнаружены более высокие уровни Fas.

2. Можно предположить, что внешний путь апоптоза имеет большое значение при формировании болевого синдрома, а его поддержание реализуется по другим механизмам. К таким механизмам можно ­отнести влияние оксидативного стресса ­через опосредованное ингибитором роста 1, индуцированным оксидативным стрессом, угнетение клеточного цикла, снижение участия фактора роста и дифференцировки 5 в процессах дифференцировки и регуляции синтеза белков внеклеточного матрикса хрящевой ткани. Однако патогенетическую роль этих медиаторов ещё предстоит уточнить.

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов, связанных с публикацией данной статьи.

Об авторах

Максим Александрович Кабалык

Тихоокеанский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: Maxi_maxim@mail.ru
г. Владивосток, Россия

Наталья Геннадьевна Плехова

Тихоокеанский государственный медицинский университет

Email: Maxi_maxim@mail.ru
г. Владивосток, Россия

Александра Викторовна Лагурева

Тихоокеанский государственный медицинский университет

Email: Maxi_maxim@mail.ru
г. Владивосток, Россия

Алексей Борисович Суняйкин

Тихоокеанский государственный медицинский университет

Email: Maxi_maxim@mail.ru
г. Владивосток, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы