Анализ плазменного гемостаза и роли микровезикул в процессе коагуляции у пациентов с COVID-19

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Коронавирусная инфекция COVID-19 (от англ. COronaVIrus Disease 2019 — коронавирусная инфекция 2019 г.) проявляется в разных формах и отличается степенью поражения и вовлечённости в процесс органов и тканей у пациентов [1]. Несмотря на то обстоятельство, что 5 мая 2023 г. Всемирная организация здравоохранения отменила статус пандемии для COVID-19, по сей день осложнения, связанные с COVID-19, остаются актуальными, и нет ответа на вопрос, как можно гарантированно их предотвратить. COVID-19 протекает по-разному — от практически бессимптомного течения до крайне тяжёлого, вплоть до подключения пациентов к искусственной вентиляции лёгких [2].

С первых месяцев изучения вируса SARS-CoV-2 (от англ. Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus-2 — второй коронавирус тяжёлого острого респираторного синдрома) и заболевания, которое он вызывает, стало очевидно, что в патогенез активно вовлекается свёртывающая система крови [3]. Наиболее частой причиной смерти больных COVID-19 становятся тромботические осложнения: венозные и артериальные тромбозы, тромбозы глубоких вен, тромбоэмболия лёгочной артерии, артериальная тромбоэмболия, тромбозы на уровне микроциркуляторного русла и инсульты [4]. Частота тромботических осложнений зависит от тяжести течения заболевания, с более высокой распространённостью у пациентов в отделении реанимации и интенсивной терапии [5].

Нарушение работы свёртывающей системы при COVID-19 — важный аспект в патофизиологических механизмах, клинической картине заболевания и, что немаловажно, в возникновении отсроченных осложнений [6]. Крайне необходимо выявлять риск развития тромботических и геморрагических осложнений, используя верную интерпретацию показателей стандартной коагулограммы, а также данных дополнительных видов исследований системы гемостаза, таких как изучение процессов формирования фибриновых сгустков методом турбидиметрии и исследование плазменного гемостаза методом тромбоэластографии.

Эти методы способны дать дополнительную информацию при формировании корректной тактики лечения и назначении адекватной терапии. Благодаря комплексной оценке патогенетических нарушений системы свёртывания у пациентов с COVID-19 возрастает вероятность назначения эффективной терапии с благоприятным прогнозом.

Первые исследования, доказывающие прокоагулянтные свойства микровезикул (МВ), опубликованы в 60–70-х годах XX века [7, 8].

Опубликованы данные, где описано значительное влияние в развитии гиперкоагуляции при COVID-19, связанное с МВ [9–11]. В исследованиях H.A. Hamali и соавт. у пациентов с COVID-19 был отмечен значительно повышенный уровень прокоагулянтных МВ и МВ, несущих тканевой фактор, по сравнению с контрольной здоровой группой (p <0,001). Сделано предположение о возможной роли повышенного содержания прокоагулянтных МВ и МВ, несущих тканевой фактор, у пациентов с COVID-19 в качестве ранних маркёров для прогнозирования тяжести COVID-19, в том числе возможного нового биомаркёра для оценки прокоагулянтной активности [12]. Было доказано, что МВ, выделяемые апоптозными стимулированными клетками клеточных линий различного происхождения (тромбоцитарные, лейкоцитарные, макрофагальные и т.д.), могут служить надёжными маркёрами повреждения сосудов [13].

Guervilly и соавт. получили данные о высоких уровнях внеклеточных МВ, несущих тканевой фактор, при тяжёлом течении COVID-19 [14]. Для пациентов с этим заболеванием характерно присутствие во внеклеточном пуле тромбоцитарных и лейкоцитарных МВ. Снижение количества МВ, отделяющихся от эндотелиоцитов, обусловлено их связыванием с другими клетками крови. МВ рассматривают в роли маркёров активации гемостаза, в том числе как показатель риска развития тромбоэмболических осложнений при COVID-19, превышающих по чувствительности такой зарекомендовавший себя тест, как определение содержания D-димера. Общее количество внеклеточных МВ (CD9⁺) в группе пациентов с COVID-19 при госпитализации было сопоставимо в группе пациентов с венозной тромбоэмболией и с постэмболическими осложнениями [15].

Доказанное влияние МВ на свёртывающую систему при различных видах патологии даёт повод предположить, что при COVID-19 они активно задействованы. Именно поэтому изучение влияния МВ на свёртывающую систему у пациентов с COVID-19 так актуально на сегодняшний день.

Цель исследования — изучить плазменный гемостаз in vitro методами турбидиметрии, тромбоэластографии и роль микровезикул в процессе коагуляции у пациентов с новой коронавирусной инфекцией различной степени тяжести.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Данное исследование относится к ретроспективным клиническим, рандомизированным, «случай-контроль». По типу принимаемых значений исследуемые (регистрируемые) показатели (конечные точки) — количественные (количество МВ, показатели тромбоэластограммы, динамической турбидиметрии).

Для исследования использована кровь, взятая однократно в пробирки с цитратом натрия, объёмом 4,5 мл из локтевой вены у 213 пациентов временного инфекционного госпиталя на базе ГАУЗ «РКБ МЗ РТ» г. Казани в период с июня по август 2020 г. Диагноз «U07.1. Коронавирусная инфекция COVID-19» у пациентов, включённых в данное исследование, был подтверждён анализом содержимого носоглотки и ротоглотки методом полимеразной цепной реакции. Контрольная группа состояла из 20 здоровых добровольцев. Взятие образцов крови осуществляли на базе отделения переливания крови ГАУЗ «РКБ МЗ РТ» г. Казани параллельно со сбором материала для исследования.

Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол №2 от 16.02.2021), все пациенты подписали информированное согласие на участие в данной работе.

Пациенты разделены на две группы в зависимости от тяжести течения заболевания:

• первая группа — среднетяжёлое течение, КТ2–3¹, получали эноксапарин натрия подкожно 0,6 мг 2 раза в день;
• вторая группа — тяжёлое течение, КТ4, установлена гепариновая помпа 20 000 ЕД (гепарин натрия), пациенты отделения реанимации и интенсивной терапии.

Средний возраст пациентов первой группы составил 63±10,3 года (от 35 до 79 лет), второй группы — 66,3±12,1 года (от 32 до 87 лет; p=0,008), контрольной группы — 53,5±10,9 года (от 33 до 71 года). В первой группе 131 (94,9%) пациент имел в анамнезе сопутствующие заболевания, в том числе 128 (92,7%) — гипертоническую болезнь I–III степени, 99 (71,7%) — сахарный диабет 2-го типа. Во второй группе 75 (100%) пациентов имели в анамнезе сопутствующие заболевания, в том числе 74 (98,6%) — гипертоническую болезнь I–III степени, 56 (74,6%) — сахарный диабет 2-го типа. Все пациенты второй группы были подключены к искусственной вентиляции лёгких, 66 (88%) больных скончались. Различия сравниваемых групп по полу не имели статистической значимости (p=0,119).

Критерии включения в исследование: подтверждённый методом полимеразной цепной реакции диагноз COVID-19, согласие пациента или его представителя на участие в исследовании. Критерии исключения: отказ пациента или его представителя от участия в исследовании, неподтверждённый диагноз COVID-19.

Бестромбоцитарную плазму крови (БТП) получали путём двойного центрифугирования: при 1500 g 15 мин и далее в режиме 10 000 g 5 мин для выделения тромбоцитов и последующего очищения от них образцов плазмы крови. Надосадочную жидкость отбирали в чистые эппендорфы для дальнейшего исследования.

Определение кинетики полимеризации фибрина проводили с помощью метода динамической турбидиметрии. Для измерения оптической плотности использовали спектрофотометр СФ-2000 (ОКБ Спектр, г. Санкт-Петербург, Россия) с программным обеспечением «Кинетика». Для этого в кювете смешивали 400 мкл БТП и 400 мкл 0,025 М CaCl₂. Начало активации свёртывающей системы регистрировали сразу после рекальцификации плазмы (нулевой момент времени). Формирование сгустка определяли по увеличению оптической плотности образца вследствие образования нерастворимых фибриновых волокон из растворимого фибриногена. Регистрацию проводили при длине волны 340 нм в кювете с толщиной оптического слоя 10 мм в течение 60 мин. Исследования выполняли при температуре +24 °С.

При анализе турбодиметрической кривой определяли lag-период (Lag), соответствующий времени генерации тромбина и образования протофибрилл, скорость полимеризации (V) — повышение оптической плотности на отрезке её нарастания в единицу времени, которое характеризует скорость латеральной агрегации и формирования волокон фибрина, и максимальную оптическую плотность при данной длине волны (A_max), определяемой количеством полимеризованного белка и толщиной фибриновых волокон.

Для оценки гемостаза также применяли метод тромбоэластографии с использованием тромбоэластографа TEG 5000 (Haemonetics, США). Тромбоэластограмма, в отличие от классических клотинговых исследований, отображает кинетику всех стадий формирования тромба с учётом вклада как плазменных, так и клеточных (тромбоцитов, эритроцитов, лейкоцитов) участников гемостатических реакций, а также фибринолиз [16]. В нашем исследовании данный метод использован для оценки коагуляционного гемостаза в образцах БТП.

Подсчёт абсолютного количества МВ определяли методом проточной цитометрии на приборе FACS Calibur (Becton Dickinson, США) методом L.V. Iversen (2013) с некоторыми доработками. БТП смешивали с фосфатным буфером (водородный показатель pH=7,4) в соотношении 9:1.

Абсолютное количество МВ в 1 мкл определяли по светорассеянию за фиксированное время (60 с) с использованием программы CellQuest, регистрируя количество событий за единицу времени (60 с) с учётом скорости потока. Цитометрический анализ распределения частиц по размеру (FSC) и гранулярности (SSC) в логарифмических шкалах позволяет локализовать сигналы МВ в определённой зоне. Для калибровки прибора и ограничения области подсчёта МВ использовали стандартные синтетические сферические частицы с диаметром 1, 2, 3, 5, 6 и 10 мкм (BD Pharmingen, США).

Для изучения влияния МВ на процессы свёртывания крови методом тромбоэластографии БТП предварительно двукратно центрифугировали с забуференным изотоническим раствором натрия хлорида в режиме 10 000 g по 30 мин. Далее отбирали супернатант, в осаждённые МВ добавляли 200 мкл изотонического раствора натрия хлорида, получая взвесь. В исследуемые образцы добавляли 240 мкл опытного образца БТП, 20 мкл 0,2 М CaCl₂, 100 мкл МВ. Для исключения влияния гепаринотерапии на результаты исследование проводили в реакционных кюветах, содержащих гепариназу. В качестве контрольного образца использовали 340 мкл нативной БТП пациентов, активировав фибринообразование 20 мкл 0,2 М CaCl₂. Таким образом, сравнивали результаты тромбоэластограмм пациентов без участия МВ и после внесения их в образцы.

Параметр тромбоэластограммы, который мы использовали для оценки плазменного гемостаза, — R (reaction time), время активации коагуляции.

Обработку и графическое представление результатов турбидиметрии проводили с использованием программы OriginLab 2021 (OriginLab Corporation, США), статистический анализ результатов — с применением программы IBM SPSS Statistics 26.0. Количественные показатели оценивали на предмет нормальности распределения с помощью критерия Шапиро–Уилка. Значимость различий между группами данных, не подчиняющихся закону нормального распределения, определяли с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Статистическую обработку результатов исследования, подчиняющихся закону нормального распределения, выполняли с использованием t-критерия Стьюдента с расчётом среднего значения и стандартного отклонения.

В таблицах данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (M±m), где n — объём выборки. Все данные, представленные в работе, статистически значимы (p <0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Показатели динамики фибринообразования, полученные методом турбидиметрии, между опытными группами достоверно различаются. Тяжёлое течение COVID-19 отличается выраженной гипокоагуляцией, снижением плотности фибринового сгустка, что свидетельствует о нарушении процесса фибринообразования. Среднетяжёлое течение заболевания, напротив, характеризуется признаками гиперкоагуляции и развитием тромботических осложнений (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние степени тяжести течения COVID-19 на кинетику фибринообразования

Показатель	Контроль, n=20	Первая группа (среднее течение), n=138	Вторая группа (тяжёлое течение), n=75
V (скорость полимеризации фибринового сгустка), ед. ОП/с	3,93±2,3	5,44±2,47 p=0,0013	1,12±0,71 р <0,0001
Lag-период, мин	6,2±1,2	3,8±1,1 p=0,0004	9,4±0,8 р <0,0001
Amax, ед. ОП	1,625±0,433	1,412±0,351 p=0,0007	0,576±0,17 р <0,0001

Примечание: ОП — оптическая плотность; A_max — максимальная оптическая плотность при данной длине волны; p — достоверность различий в сравнении c контролем.

 

Нами были выделены в группе с тяжёлым течением COVID-19 15 (19%) пациентов из 75, не получающих гепаринотерапию (поступивших в инфекционный госпиталь в тяжёлом состоянии) (группа 2Hep). У всех пациентов этой группы, как и у пациентов на гепаринотерапии, зарегистрирована гипокоагуляция по данным кинетики фибринообразования. На рис. 1 показаны «типичные» для каждой из исследованных групп кинетические кривые.

 

Рис. 1. Регистрация кинетики полимеризации фибрина методом динамической турбидиметрии. Определяемые параметры: лаг-период (Lag) — время до начала нарастания плотности; V — повышение оптической плотности на отрезке её нарастания в единицу времени; A_max — максимальная оптическая плотность при данной длине волны; контроль — группа здоровых доноров; группа 1 — среднетяжёлое течение; группа 2 — тяжёлое течение, пациенты отделения реанимации и интенсивной терапии; группа 2Нер — пациенты с тяжёлым течением, не получавшие гепаринотерапию

 

Результаты тромбоэластографии согласуются с полученными нами данными исследования БТП методом турбидиметрии. Исходя из результатов тромбоэластографии, у группы со средней степенью тяжести COVID-19 мы отметили гиперкоагуляцию (сокращение параметра R — времени активации коагуляции), а у группы с тяжёлым течением — гипокоагуляцию (удлинение параметра R). Данные результаты отображены в табл. 2.

 

Таблица 2. Отношение времени активации коагуляции нативного образца к времени активации коагуляции образца после введения микровезикул

Показатель	Контроль, n=20	Первая группа (среднее течение), n=138	Вторая группа (тяжёлое течение), n=75
R/RMV	0,3±0,06	2,12±0,32 p <0,0001	1,44±0,19 p <0,0001

Примечание: R — время активации коагуляции нативного образца; RМV — время активации коагуляции после внесения микровезикул в образец; p — достоверность различий в сравнении c контролем.

 

Из эксперимента, оценивающего влияние МВ на плазменный гемостаз, мы получили данные, которые подтверждают их значительную роль в формировании фибринового сгустка путём сокращения времени активации коагуляции. У пациентов со средним течением после внесения в пробы МВ данный параметр сократился в 2,1 раза (16,9±1,1 мин и 8±0,6 мин; p <0,0001), а у пациентов с тяжёлым течением — в 1,44 раза (10,8±0,9 мин и 7,5±0,5 мин; p <0,0001) (рис. 2). В контрольной группе достоверного влияния МВ на время активации коагуляции R не зарегистрировано (p=0,0917).

 

Рис. 2. Тромбоэластограммы, демонстрирующие влияние микровезикул на параметры коагуляции, «типичные» для каждой из исследуемых групп (группа 1 и группа 2); R — время активации коагуляции нативного образца; RМV — время активации коагуляции после внесения микровезикул в образец

 

Было отмечено, что чем выше значение параметра R (время активации коагуляции), тем влияние МВ более выраженное (например, по нативной БТП R=39,3 мин, после добавления отмытых МВ в опытный образец мы получили результат R=13,7 мин). И наоборот, если у пациента гиперкоагуляция, МВ также укорачивают время активации фибрина, но менее выражено (по нативной БТП у пациента R=9,4 мин, а после добавления МВ в опытный образец значение R=8,6 мин).

Методом проточной цитометрии нами было подсчитано абсолютное количество МВ в исследуемых образцах БТП, результаты представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Абсолютное количество микровезикул в образцах бестромбоцитарной плазмы у пациентов с COVID-19 различной степени тяжести, полученные методом проточной цитометрии

Группа	Абсолютное количество МВ в 1 мл
Контроль, n=20	14,4±1,9×106
Первая группа (среднее течение COVID-19), n=138	12,2±1,6×106, p=0,3967
Вторая группа (тяжёлое течение COVID-19), n=75	3,7±0,3×106, p <0,0001

Примечание: p — достоверность различий в сравнении c контролем; МВ — микровезикулы.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные нами результаты исследования кинетики фибринообразования методами турбидиметрии и тромбоэластографии у больных COVID-19 свидетельствуют о наличии особенностей в патогенетических процессах развития коагулопатии в зависимости от степени тяжести. По данным исследования фибринообразования у пациентов с тяжёлым течением COVID-19 отмечена гипокоагуляция, при среднем течении — гиперкоагуляция. При этом у пациентов с тяжёлым течением гипокоагуляция определена как в группе больных, получающих гепарин, так и в группе без антикоагулянтной терапии.

Многочисленные публикации свидетельствуют о важной роли МВ в процессе свёртывания крови. Отмечены прокоагулянтная роль МВ и участие их в формировании фибринового сгустка, что было показано ранее в наших исследованиях [17].

В настоящем исследовании нами получены весьма интересные результаты о значительном и достоверном снижении содержания МВ у пациентов с тяжёлым течением при наличии у них гипокоагуляции. В модельном эксперименте исследования влияния МВ на плазменный гемостаз нами показано достоверное изменение кинетики образования фибринового сгустка при добавлении к исследуемой плазме больных с тяжёлым течением COVID-19 БТП с высоким содержанием МВ. Это, безусловно, свидетельствует о прокоагулянтной роли МВ, и снижение их количества в периферической крови у пациентов, вероятно, связано с их активным участием в процессах коагуляции.

Увеличение времени активации коагуляции у пациентов с тяжёлым течением COVID-19, вероятно, следует считать маркёром синдрома диссеминированного сосудистого свёртывания (фазы потребления) и, как следствие, возможных геморрагических осложнений. Среднее течение заболевания характеризуется укорочением lag-периода, соответственно это свидетельствует о наличии гиперкоагуляции.

По показателям, полученным методом тромбоэластографии у данных пациентов, мы также отметили повышенную коагуляционную активность — уменьшение времени активации. Это состояние без корректной антикоагулянтной терапии с большой вероятностью приведёт к тромбозу (венозная тромбоэмболия, тромбоэмболия лёгочной артерии).

ВЫВОДЫ

1. Динамическая турбидиметрия и тромбоэластография служат объективными и наглядными методами исследования плазменного гемостаза пациентов с COVID-19, дополняющими рутинные методы. Они позволяют более подробно изучить изменения, происходящие в свёртывающей системе пациентов, и своевременно внести корректировки в тактику лечения.
2. Система плазменного гемостаза пациентов с COVID-19 меняется в сторону гипокоагуляции и гиперкоагуляции в зависимости от тяжести течения заболевания.
3. Абсолютное количество микровезикул в периферической крови достоверно ниже у пациентов с тяжёлым течением заболевания по сравнению с группами со средней степенью тяжести и контрольной.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Е.С.Г — концептуализация, анализ, редактирование рукописи, исследование; Р.Р.А — методология, валидация, создание черновика; И.Г.М. — редактирование рукописи, окончательное утверждение статьи; Д.И.А. — ресурсы, общее руководство.
Источник финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

 

---

¹ КТ — компьютерная томография.

Об авторах

Елена Сегреевна Грачева

Казанский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: Gracheva020688@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8543-6529
SPIN-код: 3290-5459

асп., асс., каф. биохимии и клинической лабораторной диагностики

Россия, г. Казань

Руфина Рустамовна Абдуллина

Казанский государственный медицинский университет

Email: rufina.abdullina.r@mail.ru
ORCID iD: 0009-0000-5975-4390
SPIN-код: 7099-8375

асс., каф. биохимии и клинической лабораторной диагностики

Россия, г. Казань

Ильшат Ганиевич Мустафин

Казанский государственный медицинский университет

Email: ilshat.mustafin@kazangmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-9683-3012
SPIN-код: 1588-6988

д-р мед. наук, проф., зав. каф., каф. биохимии и клинической лабораторной диагностики

Россия, г. Казань

Диана Ильдаровна Абдулганиева

Казанский государственный медицинский университет

Email: diana-s@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7069-2725
SPIN-код: 6676-4270

д-р мед. наук, проф., зав. каф., каф. госпитальной терапии

Россия, г. Казань

Список литературы

Дополнительные файлы