Lymphocyte apoptosis in patients with coronavirus infection COVID-19

Khalit S. Khaertynov; Хаертынов Халит Саубанович; Sergey V. Boichuk; Бойчук Сергей Васильевич; Vladimir A. Anokhin; Анохин Владимир Алексеевич; Aigul R. Galembikova; Галембикова Айгуль Рафиковна; Arina E. Evdokimova; Евдокимова Арина Эдуардовна

doi:10.17816/KMJ633257

Апоптоз лимфоцитов у пациентов с коронавирусной инфекцией COVID-19

Авторы: Хаертынов Х.С.¹, Бойчук С.В.¹, Анохин В.А.¹, Галембикова А.Р.¹, Евдокимова А.Э.¹
Учреждения:
1. Казанский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 105, № 6 (2024)
Страницы: 926-935
Раздел: Теоретическая и клиническая медицина
Статья получена: 06.06.2024
Статья одобрена: 27.08.2024
Статья опубликована: 27.11.2024
URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/633257
DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ633257
ID: 633257

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. Лимфопения у пациентов с коронавирусной инфекцией COVID-19 ассоциируются с риском развития тяжёлых форм и неблагоприятного исхода. Одна из причин развития лимфопении — апоптоз.

Цель. Оценка выраженности апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов со среднетяжёлым и тяжёлым течением COVID-19.

Материал и методы. Обследованы 42 пациента с COVID-19 в возрасте от 37 до 90 лет, госпитализированных в ГАУЗ «Республиканская клиническая инфекционная больница имени профессора А.Ф. Агафонова», г. Казань, в период с 24 октября 2021 г. по 1 марта 2022 г. У 13 пациентов объём поражения лёгких составил от 10 до 25% (КТ-1), у 20 — от 25 до 50% (КТ-2), у 9 — от 50 до 75% (КТ-3). Рибонуклеиновая кислота вируса SARS-CoV-2 из носоглотки была выделена у 35 (83%) пациентов. У 14 больных было среднетяжёлое течение COVID-19, у 28 — тяжёлое. Контрольную группу составили 10 условно здоровых людей аналогичного возраста. Оценку апоптоза лимфоцитов осуществляли на основании количественного определения гиподиплоидных клеток по изменению интенсивности их окраски пропидия йодидом с помощью проточной цитометрии. Для определения достоверности различий показателей между сравниваемыми группами применяли U-критерий Манна–Уитни, при сравнении процентных долей — критерий χ². Достоверность различий устанавливали при р <0,05.

Результаты. Выявлено, что у пациентов с COVID-19 достоверно более высокая активность апоптоза лимфоцитов по сравнению с контрольной группой. Медиана изучаемого показателя у больных COVID-19 составила 39,3%, тогда как в контрольной группе — 15,1% (р <0,001). Выраженность апоптоза лимфоцитов коррелировала с тяжестью заболевания: наиболее высокие показатели зарегистрированы у пациентов с тяжёлым течением COVID-19 (р=0,02). При этом апоптоз лимфоцитов >55% ассоциировался с риском летального исхода (р=0,03). Была установлена умеренно выраженная корреляционная связь между показателями апоптоза лимфоцитов и уровнем в крови ферритина (коэффициент Спирмена р=0,39, p <0,05).

Вывод. Коронавирусная инфекция COVID-19 сопровождается повышением активности апоптоза лимфоцитов периферической крови; наиболее высокие показатели апоптоза зарегистрированы у пациентов с тяжёлым течением COVID-19.

Ключевые слова

коронавирусная инфекция COVID-19, лимфоциты, апоптоз

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Дисрегуляция иммунной системы играет ведущую роль в патогенезе тяжёлых форм COVID-19 (от англ. COronaVIrusDisease 2019 — коронавирусная инфекция 2019 г.) [1]. Известно, что поражение лёгких при COVID-19 обусловлено гипервоспалительной реакцией, характеризующейся повышением в крови провоспалительных цитокинов, С-реактивного белка и ферритина [2]. С другой стороны, характерным лабораторным признаком тяжёлых форм COVID-19 бывает выраженная лимфопения [1], с которой ассоциируется риск летального исхода [3].

Будучи клетками адаптивного иммунитета, лимфоциты играют ключевую роль в формировании специфического иммунного ответа и элиминации патогенных микроорганизмов. Лимфопения при COVID-19 может быть обусловлена несколькими причинами: гибелью лимфоцитов, чрезмерным образованием провоспалительных цитокинов, ингибированием лимфопоэза, миграцией лимфоцитов в органы дыхания [4].

Механизм гибели лимфоцитов при COVID-19 может реализоваться несколькими путями: апоптозом, пироптозом, аутофагией, вирус-специфической CD8⁺-Т-лимфоцит-зависимой цитотоксичностью и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью [4].

Учитывая важную роль лимфопении в формировании тяжёлых форм COVID-19, представляется актуальным изучение выраженности апоптоза лимфоцитов у пациентов с COVID-19, что позволит обосновать новые направления патогенетической терапии.

Цель исследования — оценка выраженности апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов со среднетяжёлым и тяжёлым течением COVID-19.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследованы 42 пациента с COVID-19 в возрасте от 37 до 90 лет, находившихся на стационарном лечении в ГАУЗ «Республиканская клиническая инфекционная больница имени профессора А.Ф. Агафонова» в период с 24 октября 2021 г. по 1 марта 2022 г. Средний возраст пациентов составил 67,3±13,7 года.

Критерием включения пациентов в исследование было развитие среднетяжёлого или тяжёлого течения COVID-19, критерием невключения — лёгкое течение заболевания.

Диагностику COVID-19 осуществляли в соответствии с временными методическими рекомендациями «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции COVID-19», версия 10 от 08.02.2021 [5]. У 14 пациентов было диагностировано среднетяжёлое течение COVID-19, у 28 — тяжёлое.

У всех пациентов при проведении компьютерной томографии (КТ) органов грудной клетки выявлены изменения в лёгких в виде «матового стекла». У 13 больных объём поражения лёгких составил от 10 до 25% (КТ-1), у 20 — от 25 до 50% (КТ-2), у 9 — от 50 до 75% (КТ-3). В 35 (83%) случаях диагноз COVID-19 был подтверждён выделением рибонуклеиновой кислоты (РНК) SARS-CoV-2 (от англ. Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus-2 — второй коронавирус тяжёлого острого респираторного синдрома) из носоглотки (код заболевания U07.1). В остальных 7 (17%) случаях диагноз заболевания был выставлен на основании клинической картины (лихорадка, кашель, признаки дыхательной недостаточности) и изменений в лёгких в виде «матового стекла», выявленных при проведении КТ органов грудной клетки (код заболевания U07.2).

У 33 (88%) из 42 пациентов установлены коморбидные заболевания, среди которых чаще регистрировали гипертоническую болезнь (71%), сахарный диабет (33%) и ожирение (28%). Абсолютная лимфопения (менее 1×10⁹/л) выявлена у 18 (43%) из 48 пациентов. Все больные нуждались в респираторной поддержке, 6 из них находились на искусственной вентиляции лёгких. В 6 случаях заболевание завершилось летальным исходом. Характеристика пациентов представлена в табл. 1. Контрольную группу составили 10 условно здоровых людей аналогичного возраста (р=0,1).

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика пациентов с COVID-19

Параметр	Пациенты с COVID-19, n=42	Контрольная группа, n=10	Значимость
Возраст, годы, М±SD	67,3±13,7	60,6±8,2	р=0,1
Женский пол, абс. (%)	25 (59,5)	6 (60)	χ²=0,02; р=0,8
День госпитализации, Ме [межквартильный размах]	7 [5–8]	—	—
Выделение РНК SARS-CoV-2, абс. (%)	35 (83)	—	—
Объём поражения лёгких, абс. (%): КТ-1; КТ-2; КТ-3	13 (31) 20 (48) 9 (21)	—	—
Сопутствующие заболевания, абс. (%): гипертоническая болезнь; сахарный диабет ожирение; нарушения ритма сердца; ХОБЛ; ХБП; онкологические заболевания	33 (78,5) 30 (71) 14 (33) 12 (28) 4 (9) 3 (7) 2 (4) 2 (4)	8 (80) 6 (60) — 2 (20) 1 (10) 1 (10) — —	χ²=0,12; р=0,7 χ²=2,6; р=0,1 — χ²=1,7; р=0,1 χ²=0,05; р=0,8 χ²=0,57; р=0,4 — —
Респираторная поддержка, абс. (%): НПО; ВПО; ИВЛ	31(74) 5 (12) 6 (14)	—	—
Лейкоциты (абс.), ×10⁹/л, Ме [межквартильный размах]	7,2 [5, 4–10, 2]	5,2 [4, 5–6, 3]	0,01
Лимфоциты (абс.), ×10⁹/л, Ме [межквартильный размах]	1,1 [0, 6–1, 5]	2,5 [2, 1–3, 4]	0,0002
Лимфоциты <10⁹/л, абс. (%)	18 (43)	—	—
С-реактивный белок, Ме [межквартильный размах]	37,9 [9, 1–70]	0	—
Ферритин, нг/мл, Ме [межквартильный размах]	472 [229, 8–855]	107,5 [86–121]	0,00003

Примечание: РНК — рибонуклеиновая кислота; SARS-CoV-2 — второй коронавирус тяжёлого острого респираторного синдрома; КТ — компьютерная томография; ХОБЛ — хроническая обструктивная болезнь лёгких; ХБП — хроническая болезнь почек; НПО — низкопоточная оксигенация; ВПО — высокопоточная оксигенация; ИВЛ — искусственная вентиляция лёгких.

Наиболее распространённой коморбидной патологией в данной группе, как и в основной, была гипертоническая болезнь — 60% случаев. Пациенты основной группы и представители контрольной были сравнимы по возрасту, полу и коморбидной патологии (см. табл. 1).

Дана оценка выраженности спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови в остром периоде COVID-19 по числу гиподиплоидных клеток и изменению интенсивности их окраски пропидия йодидом (Sigma Aldrich, CША) на проточной цитофлуориметрии (FACs Canto II, Becton Dickinson, США). Результаты оценивали через 96 ч культивирования лимфоцитов в плоскодонных 24-луночных планшетах (Corning, CША) в полной культуральной среде RPMI-1640 c добавлением L-глутамина, антибиотиков (стрептомицина и пенициллина) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (все реагенты ПАНЭКО, Москва, Россия). Забор крови для исследования проводили однократно, в первые 3 дня госпитализации и в среднем на 9-й день заболевания (95% доверительный интервал 8–10). Одновременно с изучением выраженности апопотоза лимфоцитов оценивали количество лимфоцитов периферической крови.

Исследование было обсервационным. Статистический анализ полученных результатов выполнен с использованием статистической программы Statistica for Windows 6.1 (Statsoft, Tulsa, OK, USA). Анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения проводили с помощью теста Шапиро–Уилка. Нулевую гипотезу отклоняли при пороговом уровне статистической значимости (р), равном 0,05. В случае невыполнения данного условия использовали непараметрические методы статистического анализа. При распределении признака, отличном от нормального, из мер центральной тенденции использовали медиану (Ме), из мер рассеяния — межквартильный размах (значения 25-го и 75-го процентилей). Для определения достоверности различий показателей между сравниваемыми группами использовали U-критерий Манна–Уитни, при сравнении процентных долей — критерий χ². Достоверность различий устанавливали при значении р <0,05.

Для оценки связи двух признаков (r) использовали непараметрический метод корреляционного анализа Спирмена. Используя таблицы сопряжённости, рассчитывали чувствительность (Se); специфичность (Sp); прогностическую ценность положительного результата теста (PV+); прогностическую ценность отрицательного результата теста (PV–); показатели отношения правдоподобия (LR) для положительного и отрицательного результатов; относительный риск.

Комитет по этике ГАУЗ «Республиканская клиническая инфекционная больница имени проф. А.Ф. Агафонова» одобрил это исследование (протокол №4/4 от 03.06.2021). Письменное информированное согласие было получено от пациентов в соответствии с руководящими принципами, утверждёнными в соответствии с этим протоколом (Федеральный закон «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21.11.2011 №323-ФЗ).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Было установлено, что COVID-19 протекает на фоне усиления активности апоптоза лимфоцитов периферической крови (рис. 1). Медиана изучаемого показателя у пациентов с COVID-19 составила 39,3%, тогда как в контрольной группе — 15,1% (р <0,001). При этом выраженность апоптоза лимфоцитов коррелировала с тяжестью заболевания: самые высокие показатели были у пациентов с тяжёлым течением COVID-19 (табл. 2). Абсолютное количество лимфоцитов в крови больных с тяжёлым течением COVID-19 было ниже по сравнению с пациентами, у которых заболевание протекало в среднетяжёлой форме, однако это различие не было статистически значимым (p=0,1).

Рис. 1. Апоптоз лимфоцитов крови у пациентов с COVID-19 и в группе контроля

Таблица 2. Показатели лимфоцитов крови у пациентов с COVID-19 (медиана [межквартильный размах])

Показатель	Среднетяжёлое течение COVID-19 (n=14)	Тяжёлое течение COVID-19 (n=28)	р
Лимфоциты, ×10⁹/л	1,43 [0, 97–1, 9]	0,93 [0, 58–1, 35]	0,1
Апоптоз лимфоцитов, %	28,8 [20, 6–42, 4]	40,8 [32, 4–49, 4]	0,02

Учитывая возможную связь воспалительной реакции с апоптозом лимфоцитов, нами был проведён корреляционный анализ выраженности апоптоза лимфоцитов с ключевыми маркёрами воспаления — С-реактивным белком и ферритином, значения которых у пациентов с COVID-19 были достоверно выше по сравнению с показателями контрольной группы (см. табл. 1). Установлена умеренно выраженная прямая корреляционная связь показателя апоптоза лимфоцитов с уровнем в крови ферритина (коэффициент Спирмена р=0,39, p <0,05). Связи степени апоптоза с уровнем С-реактивного белка не выявлено.

Оценка изучаемых показателей с учётом исхода заболевания показала, что в группе умерших пациентов количество лимфоцитов в крови было в 2,1 раза ниже по сравнению с выжившими (табл. 3). При этом активность апоптоза лимфоцитов хотя и была выше в группе умерших больных, однако это различие не было статистически значимым.

Таблица 3. Показатели лимфоцитов крови у выживших и умерших пациентов (медиана [межквартильный размах])

Показатели	Выжившие пациенты (n=36)	Умершие пациенты (n=6)	р
Лимфоциты, ×10⁹/л	1,23 [0, 8–1, 6]	0,58 [0, 48–0, 7]	0,007
Апоптоз лимфоцитов, %	37,6 [28, 8–43, 6]	47,9 [28–57, 8]	0,3

Далее проведена оценка операционных характеристик диагностического теста «апоптоз лимфоцитов» в оценке риска летального исхода. Данные представлены в табл. 4. Было установлено, что апоптоз лимфоцитов выше 55% у пациентов с COVID-19 ассоциируется с риском летального исхода (р=0,03). При этом положительный результат теста на апоптоз клеток был максимально правдоподобен (LR+=3,8), что позволяет рассматривать его как достаточно надёжный.

Таблица 4. Апоптоз лимфоцитов и риск летальности при COVID-19

Апоптоз лимфоцитов, %	Se	Sp	PPV	NPV	LR+	LR–	RR	p
Порог отсечения 55%	50	86	0,37	0,08	3,8	0,5	4,2 [1, 0–17, 2]	0,03

Примечание: Se — чувствительность теста; Sp — специфичность теста; PPV — прогностическое значение положительного результата теста; NPV — прогностическое значение отрицательного результата теста; LR+ — отношение правдоподобия положительного результата теста; LR– — отношение правдоподобия отрицательного результата теста; RR — относительный риск; р — уровень статистической значимости.

ОБСУЖДЕНИЕ

Лимфопения — один из ключевых лабораторных показателей, определяющих тяжесть состояния и прогноз у пациентов с COVID-19. Лимфопения развивается у 63% пациентов с COVID-19 [6]. В нашем исследовании количество лимфоцитов <1,0×10⁹/л зарегистрировано у 43% пациентов. При этом выраженность лимфопении была в 2,1 раза больше в группе умерших пациентов.

Наиболее вероятными причинами лимфопении при COVID-19 могут быть вирус-индуцированный апоптоз, чрезмерный синтез провоспалительных цитокинов и секвестрация лимфоцитов в лёгочной ткани [4, 7].

Предположение о вирус-индуцированной лимфопении при COVID-19 наиболее привлекательно, учитывая способность SARS-CoV-2 инфицировать лимфоциты. В исследовании X. Ren и соавт. было показано, что РНК SARS-CoV-2 присутствует в клетках иммунной системы — нейтрофилах, макрофагах и лимфоцитах (T-, B- и NK-клетки) [8].

При этом РНК-SARS-CoV-2-позитивные иммунные клетки не экспрессировали рецептор ангиотензин-превращающего фермента 2-го типа (АПФ2), который, как известно, является ключевым белком для проникновения вируса внутрь клеток [9]. Другими авторами установлена очень низкая экспрессия АПФ2 на лимфоцитах [10]. Таким образом, рецепторы АПФ2 не могут играть значимой роли для SARS-CoV-2 в инфицировании лимфоцитов, в отличие от эпителиальных клеток органов дыхания, пищеварительного тракта и других систем.

Тогда каковы реальные механизмы проникновения SARS-CoV-2 в лимфоциты? Ещё в начале пандемии COVID-19 рядом исследователей был доказан альтернативный, АПФ2-независимый путь инфицирования лимфоцитов, происходящий через гликопротеин CD147, экспрессирующийся на различных клетках, в том числе на Т-лимфоцитах [11]. Позднее в исследовании X.-R. Shen и соавт. (2022) было установлено, что для инфицирования лимфоцитов входной молекулой для SARS-CoV-2 может быть белок LFA-1 (от англ. Leukocyte function-associated antigen-1), экспрессирующийся исключительно на лейкоцитах, в том числе лимфоцитах [12].

Однако, несмотря на способность SARS-CoV-2 проникать в лимфоциты, доказательств репликации в них вируса нет. При этом различными исследователями был установлен факт SARS-CoV-2-индуцированного апоптоза лимфоцитов [3, 12, 13]. Апоптозу при COVID-19 наиболее подвержены CD4-лимфоциты [14]. Сообщают, что выраженность апоптоза Т-лимфоцитов при COVID-19 коррелировала с тяжестью заболевания [15].

В нашем исследовании медиана показателя апоптоза лимфоцитов у пациентов с COVID-19 была в 2,6 раза выше, чем в группе контроля (р <0,001) и статистически значимо выше у пациентов с тяжёлым течением заболевания (р=0,02). Причём апоптоз лимфоцитов более 55% у пациентов с COVID-19 ассоциировался с риском летального исхода, что указывает на высокую прогностическую ценность данного показателя.

Известно, активация апоптоза клеток может происходить как по внешнему пути (через экспрессию Fas-рецепторов плазматической мембраны), так и по внутреннему (путём снижения мембранного потенциала митохондрий) [14]. Внешний путь апоптоза опосредован каспазой-8, внутренний — каспазой-9. В завершающей стадии ключевая роль принадлежит каспазе-3, в активации которой участвуют как каспаза-8, так и каспаза-9 [16]. В исследовании Y. Ren и соавт. было показано, что при COVID-19 апоптоз клеток происходит по внешнему пути — с помощью индукции активации каспазы-8 белком ORF3a SARS-CoV-2 [17].

Клиническое значение апоптоза лимфоцитов при COVID-19, с одной стороны, ассоциируется с элиминацией вируса, с другой — развивающаяся апоптоз-индуцированная лимфопения может стать причиной формирования иммуносупрессии и прогрессирования заболевания. Это подтверждается результатами патоморфологических исследований умерших от COVID-19 пациентов, демонстрирующих истощение лимфоидной ткани [18, 19].

Активация апоптоза лимфоцитов и лимфопения при тяжёлых формах COVID-19 могут быть обусловлены избыточно выраженной воспалительной реакцией, характеризующейся повышением в крови концентрации различных провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухоли α, интерлейкинов-1, -6, -8) и других белков острой фазы воспаления (С-реактивного белка, ферритина и фибриногена) [6, 20].

Ещё в 2002 г. в эксперименте in vitro было показано, что фактор некроза опухоли α может индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов человека [21]. Кроме того, интерлейкины-1β и -6 могут способствовать активации проапоптотического Fas-рецептора [22]. Эти факты позволяют рассматривать «цитокиновый шторм» как одну из ключевых причин SARS-CoV-2-индуцированного апоптоза лимфоцитов.

Установлено, что у пациентов с COVID-19 существует обратная корреляционная связь между концентрацией интерлейкина-6 и абсолютным количеством лимфоцитов в крови [23]. В реальной клинической практике для оценки выраженности воспалительной реакции традиционно проводят определение в крови белков острой фазы воспаления — С-реактивного белка, ферритина, синтез которых, как известно, индуцируется интерлейкином-6 [24]. Было показано, что высокие значения этих маркёров воспаления коррелируют с тяжестью COVID-19 и плохим прогнозом [25].

Нами установлена умеренно выраженная прямая корреляционная связь выраженности апоптоза лимфоцитов с уровнем ферритина крови у пациентов с COVID-19 (коэффициент Спирмена р=0,39, p <0,05).

Данный факт указывает на значимость проведения противовоспалительной терапии как одного из возможных направлений подавления избыточного апоптоза лимфоцитов. В ряде исследований было показано, что введение тоцилизумаба сопровождается увеличением в крови количества лимфоцитов [23, 26].

Апоптозу при COVID-19 подвержены не только лимфоциты, но и эпителиальные клетки органов дыхания, а также эндотелиальные клетки [27]. При этом в тканях умерших от COVID-19 пациентов выявляют не только признаки апоптоза, но и пироптоза — формы клеточной гибели, сочетающей как признаки апоптоза, так и воспаления [28]. Эти патоморфологические изменения указывают на ключевую роль гипервоспаления в инициации гибели клеток и развитии органной дисфункции у пациентов с COVID-19, в частности острого респираторного дистресс-синдрома. По этой причине именно противовоспалительная терапия имеет решающее значение для купирования как COVID-19-ассоциированного «цитокинового шторма», так и лимфопении, что может улучшить прогноз заболевания.

ВЫВОДЫ

Коронавирусная инфекция COVID-19 характеризуется усилением активности апоптоза лимфоцитов периферической крови.
Выраженность апоптоза лимфоцитов коррелирует с тяжестью заболевания — наиболее высокие значения зарегистрированы у пациентов с тяжёлым течением COVID-19, а показатель апоптоза клеток >55% ассоциировался с летальным исходом.
Установленная прямая корреляционная связь между выраженностью апоптоза лимфоцитов и уровнем ферритина в крови служит основанием для проведения противовоспалительной терапии среднетяжёлых и тяжёлых форм COVID-19.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Х.С.Х. — концептуализация, анализ, редактирование рукописи, общее руководство; С.В.Б. — методология, валидация; В.А.А. — редактирование рукописи; А.Р.Г. — исследование, создание черновика; А.Э.Е. — исследование, создание черновика.
Источник финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта по представленной статье.