Сравнительная оценка осмотической и противовоспалительной активности мягких лекарственных форм препаратов пиримидинового ряда на гидрофильных основах в эксперименте

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Несмотря на постоянный поиск новых медикаментозных средств для местной профилактики хирургической инфекции, проблема гнойно-воспалительных осложнений со стороны послеоперационных ран мягких тканей остаётся актуальной до настоящего времени [1, 2].

Расширяется количество методов и лекарственных препаратов, направленных на стимуляцию заживления, быстрое и оптимальное рубцевание, скорейшее очищение раны от гнойно-некротических тканей и ускорение процессов репаративной регенерации [3–6]. В числе наиболее часто используемых средств, применяемых для стимуляции процессов заживления ран, представители пиримидинового ряда — диоксометилтетрагидропиримидин (метилурацил) и пентоксил.

Один из этих препаратов (метилурацил) входит в состав мази на водорастворимой основе диоксометилтетрагидропиримидин + хлорамфеникол (левомеколь), которая относится к категории универсальных мазей и оказывает многонаправленное действие на все звенья раневого процесса. Однако местное применение метилурацила в составе мази левомеколь малоэффективно ввиду его слабых (приравнивается к плацебо) регенеративного и противовоспалительного эффектов, отсутствия антибактериальных свойств [7].

Одно из основных требований к фармакологическим средствам для местного лечения ран — их хорошая растворимость, позволяющая создать высокую лечебную концентрацию препарата и тем самым обеспечить оптимальный терапевтический эффект [8, 9].

В процессе развития данного направления учёными В.С. Резником и Н.Г. Пашкуровым в 1964 г. (Институт органической и физической химии им. акад. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук) был создан более эффективный препарат пиримидинового ряда — гидроксиэтилдиметилдигидропиримидин (ксимедон) [10]. Описанные фармакологические эффекты ксимедона обусловили большой интерес к его использованию, а отсутствие токсичности, терапевтическая широта, крайне узкие противопоказания делают возможным применение препарата во многих областях медицины. Также ксимедон интересен для дальнейшего изучения и местного использования в виде различных лекарственных форм.

Разные местные формы, в виде композиций разрабатываются проф. С.Г. Измайловым и соавт. [11–14]. Всё это и послужило предметом наших экспериментальных исследований.

Цель исследования — изучить в эксперименте осмотическую активность и противовоспалительные свойства разработанной ксимедон-содержащей мазевой композиции левоксиколь и известной мази левомеколь.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Первым исследуемым материалом послужила известная мазь левомеколь — официнальный препарат, разрешённый к клиническому применению в Российской Федерации. Мазь содержит в масс.%: левомицетин — 0,75, метилурацил — 4,0, полиэтиленоксид 1500 — 19,05, полиэтиленоксид 400 — 76,2. Вторым препаратом была разработанная нами мазь левоксиколь — сокращённое название, сочетание начальных букв основных действующих ингредиентов мази [14]. Данная лечебная композиция имеет следующее содержание компонентов в мас.%: левомицетин — 0,75; ксимедон — 4,0; полиэтиленоксид 1500 — 19,05; полиэтиленоксид 400 — 76,2 [13].

Оценку осмотической активности экспериментальной мазевой композиции левоксиколь в сравнении с известным лекарственным средством проводили в эксперименте in vitro по методике Ю.К. Абаева (2005) [11]. Исследуемую мазевую композицию в количестве 40 г подогревали в термостате до жидкой консистенции — температура мази 35–36 °С. В изучаемую жидкую мазевую форму помещали марлевую полоску шириной 35 мм и длиной 700 мм и пропитывали в течение 30 мин.

После проведённой экспозиции исследуемые материалы фиксировали с помощью хирургической нити к лабораторному штативу на равную высоту от его основания (рис. 1).

 

Рис. 1. а. Общий вид лабораторных материалов, используемых в эксперименте по оценке осмотической активности мазевых композиций. Марлевые полоски фиксированы к штативу на равной высоте. Объяснения в тексте. b. Эксперимент по оценке осмотической активности мазевых композиций. Край марлевой полоски погружён в контрастное вещество 0,3% K₂Сr₂О₇; 1 — сухая салфетка; 2 — гипертонический раствор NaCl; 3 — мазь левомеколь; 4 — мазь левоксиколь. Объяснения в тексте

Fig. 1. а. General view of laboratory materials used in the experiment to assess the osmotic activity of ointment compositions. Gauze strips are fixed to the tripod at an equal height. Explanations in the text. b. Experiment to evaluate the osmotic activity of ointment compositions. The edge of the gauze strip is immersed in a contrast agent of 0.3% K₂Сr₂О₇; 1 — dry cloth; 2 — hypertonic NaCl solution; 3 — levosmekol ointment; 4 — levoxycol ointment. Explanations in the text

 

В качестве поглощаемой исследуемыми мазевыми формами жидкости использовали контрастное вещество (0,3% раствор K₂Сr₂О₇), которое в количестве 60 мл помещали в лабораторную посуду, равную числу изучаемых серий. Данное контрастное вещество имеет выраженную жёлтую окраску и хорошо растворяется в воде. Раствор соли K₂Сr₂О₇ не взаимодействует с компонентами мазевых композиций. При растворении K₂Сr₂О₇ диссоциирует образуя катионы (2K⁺ и Cr₂О₇^2–). Это способствует поляризации раствора и лучшему проникновению контраста в марлевую повязку, пропитанную мазевой композицией (см. рис. 1, b).

Свободный край мазевых полосок одновременно погружали в контраст на 0,5 см, и на протяжении 24 ч по скорости, интенсивности окрашивания мазевых полосок, а также количеству поглощённой жидкости оценивали осмотическую активность изучаемых мазевых композиций.

Изучение противовоспалительных свойств мазей проводили in vivo на 60 беспородных крысах-самцах линии Wistar. Отбор животных осуществляли по следующим критериям: самцы, масса тела 250–300 г, возраст 8–12 мес, отсутствие видимых повреждений, блестящие глаза, чистые кожные покровы, активные, с хорошим аппетитом.

Животные были распределены по группам в зависимости от решения поставленных задач.

Для оценки противовоспалительной активности мазей использовали модель каррагенин-индуцированного отёка лап крыс. Воспаление моделировали путём введения 1% водного раствора каррагенина в объёме 0,1 мл под плантарный апоневроз правой задней лапы. Через 30 мин после введения каррагенина крысам опытных групп накладывали повязки на заднюю конечность с исследуемыми мазями, каждый час выполняли измерения. Повязку снимали лишь для проведения измерения.

В контрольной группе животных использовали асептическую повязку без мази. В качестве контроля служила группа, в которой не применяли изучаемые мазевые формы.

В опыте животные были разделены на три группы, по 20 животных в каждой. Первая группа служила контролем. Во второй группе животных применяли мазь левомеколь, в третьей группе — левоксиколь [8].

Проверяли гипотезу о положительном воздействии мази левоксиколь в первые часы на течение воспалительного процесса в мягких тканях, а также на сроки выраженности воспаления.

Выраженность отёка оценивали при помощи плетизмометра фирмы Ugo Basile (Италия). Использовали плетизмометр со стандартной ёмкостью для воды (диаметр 1,8 см), в состав которого также входит ёмкость для крысиной лапки (диаметр 1,3 см). Отёк измеряли с точностью до 0,01 мл объёма вытесненной жидкости. Воспаление в данном эксперименте моделировали с помощью каррагенина.

При проведении экспериментальных исследований по изучению воздействия мазей левоксиколь и левомеколь на воспалительный процесс в мягких тканях производили расчёт по объёму вытесненной воды (мл): чем больше объём вытесненной воды, тем больше отёк тканей. Воспалительную реакцию оценивали по величине отёка лапки через 2, 3, 4 и 5 ч после введения раствора каррагенина.

Противовоспалительное действие исследуемых веществ оценивали по степени подавления отёка относительно показателей контрольной группы. В ходе эксперимента наблюдали за общим состоянием, изменением массы тела и выживаемостью животных. О противовоспалительной активности мазевых форм судили по уменьшению объёма вытесненной воды, выраженного в процентах к исходному объёму по сравнению с группой контроля.

Во время эксперимента у крыс прижизненно из кончика хвоста брали образцы крови до моделирования воспаления, через 2, 3, 4, 5 и 24 ч после моделирования воспаления. В каждой группе эксперимента проводили по 5 серий с целью выявления достоверных данных по таким показателям, как скорость оседания эритроцитов (СОЭ), С-реактивный белок, количество лейкоцитов и соотношение субпопуляций лейкоцитов (лимфоциты, моноциты, гранулоциты). СОЭ, число лейкоцитов и соотношение их субпопуляций определяли в цельной крови, образцы крови брали по традиционной методике.

Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Казанский ГМУ» Минздрава России по проведению научных исследований с участием в качестве объекта исследования человека и животных (протокол №4 от 24.04.2018).

Анализ данных проведён в среде для статистических вычислений R 3.4.4. Для анализа различий частоты изучаемых исходов в группах животных использовали U-критерий Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при p <0,05. Все данные представлены в виде средней величины ± стандартного отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе выполнения эксперимента установлено, что сухая салфетка (1) и салфетка, пропитанная гипертоническим раствором NaCl (2), сразу с момента погружения окрашивались контрастом с высокой скоростью насыщения, что указывало на ранние сроки активизация дренирующей функции. Площадь окрашивания сухой салфетки через 1 ч с момента погружения в контраст составила (Ме [Q₁; Q₃]) 12,7 (12,2; 13,1) см², а пропитанной гипертоническим раствором — 18,5 (17,9; 19,1) см².

В первые 3 ч наблюдения площадь окрашивания указанных марлевых салфеток заметно увеличивалась и составила 41,4 (40,8; 42,1) см² и 77,2 (76,7; 77,7) см² (р=0,001) соответственно.

Однако установлено, что при насыщении контрастом сухая марлевая салфетка к 4-му часу эксперимента теряла осмотические свойства, и увеличение площади окрашивания салфетки прекращалось. Высокая скорость насыщения контрастом салфетки, пропитанной гипертоническим раствором, также быстро снижалась и останавливалась через 6 ч от начала эксперимента. К 6 ч площадь окрашивания сухой салфетки составила (Ме [Q₁; Q₃]) 68,7 (68,1; 69,5) см², а пропитанной гипертоническим раствором — 91,1 (90,6; 91,7) см² (р=0,001). В последующее время наблюдения увеличения площади окрашивания сухой и пропитанной гипертоническим раствором салфеток не происходило.

При изучении марлевых салфеток, пропитанных мазевыми композициями, получены следующие результаты. Первые 3 ч наблюдения площадь окрашивания исследуемых материалов оставалась примерно равной, а скорость поглощения салфетками контраста низкой в сравнении с сухой и пропитанной гипертоническим раствором салфетками.

Так, через 1 ч от начала эксперимента площадь окрашивания контрастом составляла: левомеколь (3) — (Ме [Q₁; Q₃]) 3,2 (3,1; 3,3) см², левоксиколь (4) — 3,1 (2,9; 3,4) см². Через 3 ч от начала эксперимента наметилась значимая разница площади пропитывания мазевых салфеток: левомеколь — 5,4 (5,2; 5,8) см², левоксиколь — 5,7 (5,6; 5,9) см² (р=0,0039). В дальнейшем разница площади пропитывания мазевых салфеток со временем увеличивалась. Так после 6 ч эксперимента площадь пропитывания салфеток составляла: левомеколь — 11,9 (11,7; 12,2) см², левоксиколь — 13,6 (13,5; 13,8) см² (р_1–2=0,001).

К 12 ч от начала эксперимента отмечено снижение осмотической активности салфетки с мазью левомеколь, скорость окрашивания стала заметно ниже, и спустя 16 ч от начала эксперимента окрашивание салфетки контрастом прекратилось. Площадь окрашивания контрастом салфетки с мазью левомеколь составила 15,5 (14,3; 16,2) см². В последующее время наблюдения площадь пропитывания данной повязки не изменилась.

В противоположность этому, площадь окрашивания контрастом салфеток с мазевой формой левоксиколь увеличивалась в течение всего времени эксперимента. Через 12 ч от начала эксперимента (рис. 2) площадь пропитывания марлевой салфетки с исследуемой мазевой формой составляла 19,9 (19,8; 20,0) см² (р=0,001).

 

Рис. 2. Общий вид эксперимента по оценке осмотической активности мазевых композиций, диаграмма степени насыщения марлевых салфеток контрастом через 12 ч от начала эксперимента. Пропитывание контрастом полосок с мазями продолжается, однако скорость окрашивания полоски с мазью левомеколь заметно снизилась. Объяснения в тексте

Fig. 2. General view of the experiment to evaluate the osmotic activity of ointment compositions, a diagram of the saturation degree of gauze napkins with contrast 12 hours from the start of the experiment. Impregnation of strips with ointments with contrast continues, but the rate of staining of strips with levomekol ointment has noticeably decreased. Explanations in the text

 

К 18 ч произошло снижение осмотической активности салфетки с мазевой формой левоксиколь, однако площадь окрашивания контрастом продолжала увеличиваться и через 24 ч (рис. 3) составляла 28,4 (28,1; 29,2) см² (р=0,001).

 

Рис. 3. Общий вид эксперимента по оценке осмотической активности мазевых композиций, диаграмма степени насыщения марлевых салфеток контрастом через 24 ч от начала эксперимента. Окончание эксперимента. Объяснения в тексте

Fig. 3. General view of the experiment to evaluate the osmotic activity of ointment compositions, a diagram of the saturation degree of gauze napkins with contrast 24 hours from the start of the experiment. End of the experiment. Explanations in the text

 

По окончании исследования произведён анализ количества впитанного контраста. Выявлено, что сухая салфетка впитала 55 мл контраста; салфетка, пропитанная гипертоническим раствором, впитала всю контрастную жидкость. Салфетки, пропитанные мазевыми формами, впитали следующее количество контраста: (Ме [Q₁; Q₃]) левомеколь — 28,2 (26,4; 31,3) мл, левоксиколь — 41,8 (39,5; 43,4) мл.

Таким образом, можно сделать вывод, что разработанная на полипропиленоксидной основе композиция левоксиколь, содержащая ксимедон, обладает более длительными как временными (до 24 ч), так и количественными дренирующими свойствами в сравнении с аналогом — мазью левомеколь (до 16 ч).

Прирост объёма вытесненной воды в контрольной группе относительно интактной составил в среднем 1,61±0,04 мл и был принят за 100%. Объём вытесненной воды до введения каррагенина считали исходным и принимали за 100%. Максимальное развитие отёка наблюдали у животных контрольной группы через 3 ч после введения каррагенина.

Воспалительная реакция проявлялась в виде покраснения, болезненности при пальпации и отёка. Проведённые исследования показали, что при измерении лапки у животных контрольной группы через 2 ч без применения мазевых форм объём вытесненной жидкости составил до 2,1 мл по сравнению с исходными значением (1,58±0,13 мл.). Полученный результат свидетельствует о развитии экссудативной фазы воспаления, основной признак которой — формирование отёка.

Объём вытесненной жидкости на различных сроках эксперимента представлен на рис. 4. В контрольной группе без применения мази, в группах с применением мази левомеколь и мази левоксиколь было отмечено увеличение объёма вытесненной жидкости на 2–3-й час после начала воспаления, а в последующем — в зависимости от применения мазевой формы.

 

Рис. 4.  Объём вытесненной жидкости на различных сроках воспаления (%)

Fig. 4. Volume of displaced fluid at different stages of inflammation (%)

 

Противовоспалительная активность мазевых форм проявлялась в виде подавления отёка лапок крыс на сроках 3 и 5 ч после инъекции каррагенина.

Во всех группах эксперимента объём вытесненной жидкости до введения каррагенина был одинаковый. При использовании мазевой формы левомеколь до введения каррагенина показатели вытесненной жидкости составили 1,65±0,14 мл, при введении каррагенина, начиная с 3 ч, количество составило 1,8±0,19 мл. При применении мазевой формы левоксиколь до введения каррагенина показатели вытесненной жидкости составили 1,62±0,13 мл, при введении каррагенина, начиная с 3 ч, — 1,57±0,16 мл (р=0,013).

На модели отёка лапки крыс установлено, что предварительное нанесение мазевой формы левоксиколь приводило к достоверному уменьшению отёка конечности, вызванного введением каррагенина. Проведённые исследования показали, что у мази левоксиколь объём вытесненной жидкости был значительно меньше по сравнению с контролем — на 30%, а у мази левомеколь — на 18%, из чего можно сделать вывод о противоотёчном и противовоспалительном действии разработанных мазевых форм.

Выявлено, что в контрольной группе без применения мазевых форм на 2-м и 3-м часу после моделирования воспаления возник пик изменения показателей СОЭ и С-реактивного белка. Если у всех интактных животных до начала опыта СОЭ составляла 0 мм/ч, а С-реактивный белок был (–), то на 2-м и 3-м часу СОЭ была повышена до 2±2,2 мм/ч, а содержание С-реактивного белка — до (+) и (++) соответственно. При этом до 4 ч наблюдения оба показателя не восстанавливались до исходных значений.

В обеих опытных группах с применением мазевых форм левомеколь и левоксиколь отмечали значимое восстановление СОЭ и количества С-реактивного белка до референсных значений. На 2-м часу величина СОЭ в обеих опытных группах была примерно одинаковой и составляла в среднем 0,8–1,5 и 0,5–1 мм/ч при применении мазей левомеколь и левоксиколь соответственно. Начиная с 3 ч, в группе, где применяли мазевую форму левоксиколь, СОЭ составляла 0 мм/ч и не отличалась от исходных значений. В группе, где применяли мазевую форму левомеколь, СОЭ была ниже, чем в контроле, на протяжении всего периода наблюдения, но достигала исходных значений (0 мм/ч) лишь на 5-м часу наблюдения.

C-реактивный белок в группе, где применили мазевую форму левоксиколь, уже на 2-м часу был (+) лишь у одного животного из 5, у остальных 4 — отрицательный. При использовании мазевой формы левомеколь C-реактивный белок у 3 животных из 5 был (+), у 2 из 5 (–) (p=0,5238).

В результате моделирования воспаления уже через 2 ч в контрольной группе зарегистрировано увеличение количества лейкоцитов в 3 раза, пик (15±1,3×10⁹/л) приходился на 5 ч (рис. 5). В группе, где применяли мазевую форму левомеколь, достоверное увеличение количества лейкоцитов происходило с задержкой по сравнению с контрольной группой примерно на 1 ч и начиналось с 3 ч. На 4-м часу показатели были выше, чем в контроле, а с 5 ч различий с контрольной группой не было. В группе, где применяли мазевую форму левоксиколь, на протяжении всего периода наблюдения количество лейкоцитов не поднималось >10–12×10⁹/л.

 

Рис. 5. Изменение количества лейкоцитов в крови крыс под влиянием воспаления и исследуемых мазевых форм

Fig. 5. Changes in the number of leukocytes in the blood of rats under the influence of inflammation and the studied ointment forms

 

Анализ соотношения субпопуляций лейкоцитов (лейкоцитарной формулы) показал, что на 2-м часу после моделирования воспаления в контрольной группе увеличилось количество гранулоцитов и моноцитов, но количество лимфоцитов не изменилось. Пик для числа гранулоцитов и моноцитов зарегистрирован на 5-м часу после моделирования воспаления. Через сутки число гранулоцитов полностью восстанавливалось до нормы, число моноцитов снижалось, но при этом оставалось выше исходных значений. Количество моноцитов в контрольной группе, наоборот, через сутки достигало максимальных значений, в 3 раза превышая исходные показатели.

ВЫВОДЫ

1. Эксперименты in vitro показали, что мазевая форма левоксиколь обладает более выраженной осмотической активностью (в течение 24 ч против 12 ч в контроле).
2. Экспериментальные данные in vivo свидетельствуют о том, что применение разработанной мазевой формы левоксиколь, в отличие от мазевой формы левомеколь, положительно влияет на течение воспалительных процессов в мягких тканях в первые 2–3 ч.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. А.Г.И. — исследование, создание черновика, визуализация; С.В.Д. — общее руководство, администрирование проекта, проверка, анализ; С.Г.И. — концептуализация, методология, создание черновика; Е.Е.Л. — программное обеспечение, исследование, обработка и управление результатами; А.Ю.Ж. — методология, ресурсы, обработка и управление результатами.
Источник финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. A.G.I. — investigation, writing — original draft, visualization; S.V.D. — supervision, project administration, validation, formal analysis; S.G.I. — conceptualization, methodology, writing — original draft; E.E.L. — software, investigation, data curation; A.Yu.Zh. — methodology, resources, data curation.
Funding source. The study had no sponsorship.
Competing interests. The authors declare that there is no conflict of interest in the presented article.

Об авторах

Александр Геннадьевич Измайлов

Казанский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: izmailov_alex@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9559-550X
SPIN-код: 1004-4454

д-р мед. наук, доц., каф. общей хирургии

Россия, г. Казань

Сергей Васильевич Доброквашин

Казанский государственный медицинский университет

Email: gsurgery1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9817-9816
SPIN-код: 3882-1906

д-р мед. наук, проф., зав. каф., каф. общей хирургии

Россия, г. Казань

Сергей Геннадьевич Измайлов

Городская клиническая больница №7 г. Нижнего Новгорода им. Е.Л. Берёзова

Email: izi28082009@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7998-9277
SPIN-код: 3984-2070

д-р мед. наук, проф., проф.-консультант

Россия, г. Нижний Новгород

Егор Евгеньевич Лукоянычев

Городская клиническая больница №7 г. Нижнего Новгорода им. Е.Л. Берёзова

Email: egor-lukoyanychev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6392-2692
SPIN-код: 7896-4581

канд. мед. наук, доц., консультант

Россия, г. Нижний Новгород

Андрей Юрьевич Жаринов

Городская клиническая больница №7 г. Нижнего Новгорода им. Е.Л. Берёзова

Email: zharinov78@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9894-8673
SPIN-код: 9904-6140

канд. мед. наук, консультант

Россия, г. Нижний Новгород

Список литературы

Дополнительные файлы