ON THE PRACTICAL VALUE OF SOME METHODS OF VABORATORY DIAGNOSTICS OF DIPHTHERIA

Abstract

In connection with the task of the complete elimination of diphtheria, its bacteriological diagnosis becomes an especially important link in both medical work and preventive measures. A necessary condition for this is the reliability of any positive or negative answer. However, practical laboratories at hospitals still receive such a low incidence of diphtheria bacteria from patients with overt diphtheria that their answers can confirm the diagnosis in no more than 50-40 and even 20% of cases (Olshevskaya).

Full Text

В связи с задачей полной ликвидации дифтерии бактериологическая ее диагностика становится особенно важным звеном как в лечебной работе, так и в профилактических мероприятиях. Необходимым условием при этом является достоверность любого как положительного, так и отрицательного ответа. Однако, практические лаборатории при лечебных учреждениях все еще получают настолько низкую высеваемость дифтерийных бактерий от больных с явной дифтерией, что их ответы могут подтвердить диагноз не более чем в 50—40 и даже 20% случаев (Ольшевская). Не более достоверны и отрицательные их ответы. Причины этого в том, что применяемые в практических лабораториях методы (исследование материала путем посева на сывороточные среды и бактериоскопия мазков с получаемых культур) в настоящее время уже не отвечают ни запросам практики, ни достижениям науки, а имеющиеся инструкции по новым методикам не всегда доходят до практических работников и не используются.

Данная работа имеет своей задачей, на основе литературных данных и собственного опыта, охарактеризовать наиболее доступные для практики методы лабораторной диагностики дифтерии.

Взятие материала от больного должно производиться врачом или его специально обученным помощником. Не рекомендуется брать слизь из зева после еды и вскоре после полоскания его дезинфицирующими растворами, так как это ослабляет рост микробов при посеве.

Для взятия материала от больного может быть использован: — 1) навернутый на деревянный стерженек сухой ватный стерильный тампон; 2) сывороточный там­пон; 3) глицериновый, или 4) теллуритовый тампоны. На основании специальных исследований Т. Петрова и И. Берзон пришли к заключению, что дифтерийные бактерии выживают в течение одних суток на всех четырех тампонах. Но сывороточный тампон имеет преимущество, заключающееся в том, что на нем дифтерийные микробы могут не только сохраняться 10 суток и более, но и размножаться в условиях термостата.

Взятый на тампон материал должен быть отправлен в лабораторию не позднее 3—4 часов с момента взятия. При пересылке тампонов в лабораторию следует защищать от высыхания, света и замораживания.

Ускоренные методы диагностики

Известны три метода ускоренной диагностики дифтерии: 1) прямая бактериоскопия, 2) с помощью сывороточных тампонов, по Фольгеру и 3) теллуритовая проба (А. 3. Талайко-Калашниковой и Н. К. Белой).

Доставленный от больного материал на тампоне подвергается в лаборатории бактериоскопическому исследованию в двух окрасках: 1) по Граму (для определения микрофлоры, морфологии и расположения клеток в препарате) и 2) по Нейссеру или модифицированному методу В. Ю. Люблинского (для выявления волютиновых зерен, характерных для возбудителя дифтерии).

Такая бактериоскопия часто незаслуженно игнорируется, хотя она и позволяет опытному исследователю в 50% случаев выявлять палочку дифтерии.

Ряд исследователей рекомендует ускоренный метод диагностики дифтерии с по­мощью сывороточных тампонов, по Фольгеру, в модификации Аркавина и Дыниной. Взятый от больного на сывороточный тампон материал поме­щается в стерильную пробирку, где имеется физиологический раствор или марте­новский бульон (для создания влажной камеры) в количестве 1—2 мл. Через 4—6 часов инкубирования этих тампонов в термостате и, следовательно, роста на них бактерий производятся мазки с этих тампонов, окрашиваемые по Граму и по Нейссеру.

Такой метод позволяет обнаружить дифтерийные бактерии уже через 4—6 часов с не меньшей достоверностью, чем через 24 часа по методу Лёффлера (С. М. Вя- селева).

К, ускоренным методам диагностики дифтерии относится теллуритовая проба (Талайко-Калашникова и Белая), которая применяется непосредственно на больном, при подозрении на дифтерию зева, носа, кожи, гениталий и пр. При подозрении на дифтерию гортани или глаза теллуритовая проба на больном не ставится. В этих случаях она ставится только на отторгнувшихся (гортань) или осторожно снятых (глаз) пленках, которые исследуются на предметном стекле. Сущность теллуритовой пробы состоит в том, что при смазывании пораженной поверхности слизистой тампоном, увлажненным 2% раствором теллуристого калия, при дифтерийном поражении тканей наступает быстрое (через 10—20 muh')почернение налета, вследствие восстановления теллурита. Как указывают авторы, этим методом удается подтверждать диагноз дифтерии у 90% больных.

Недостаток этого метода заключается в том, что почернение налетов у больных может, наступить и при недифтеритическом поражении, например, при фузо-спиро-хетной ангине, грибковых поражениях, а изредка и при гноеродных ангинах, вызванных определенным штаммом стафилококка.

Слабой стороной перечисленных ускоренных методов диагностики надо признать то, что возбудитель дифтерии определяется ими по морфологическим признакам или по способности дифтерийных бактерий восстанавливать теллурит из его бесцветных соединений.

Сочетание этого метода с бактериологическим предлагают использовать Н. А. Пастернак и И. В. Равич (1958). Для этого рекомендуется брать материал от больного тампоном, пропитанным питательной средой следующего состава: 2% мартеновского агара, 2% манифестатора, 20% бычьей сыворотки и 0,02% теллурита калия. Через 4—6 часов инкубации в термостате такого тампона его ополаскивают минимальным количеством мартеновского бульона; из него берется толстая капля для бактериоскопии и делается высев на чашки со средой того же состава, что и для пропитывания тампона. Высев из бульона на чашку обеспечивает получение изолированных колоний дифтерийных бактерий через 18 часов, а через 48 часов позволяет дать биохимическую характеристику, и, в случае токсигенных культур, установить их способность к токсинообразованию.

Бактериологические методы диагностики

Для посева используются сывороточные среды Ру или Лёффлера с бычьей или лошадиной сывороткой.

Предлагаются заменители этих сред с яичным желтком (желточно-сывороточная, желточно-молочно-агаровая и желточно-агаровая), с которых снимается количество дифтерийных бактерий, не меньшее, чем со среды Лёффлера (Цимбалист и Иванов, 1957).

Но общий недостаток сывороточных и желточных сред заключается в том, что дифтерийные бактерии высеваются на них в смешанной культуре с другими видами микробов, что затрудняет выделение чистых культур дифтерийных бактерий, а, следовательно, и последующее изучение их биологических свойств.

Наиболее эффективными надо считать сывороточные и кровяные среды с теллуритом калия (Андерсона, Пергола, Клаубера и др.). Практически более удобна среда Клаубера (кровяно-глицериновый агар с теллуритом калия).

В 1952 г. нами было предпринято испытание сывороточных и кровяных питательных сред с применением теллурита натрия и проведено упрощение методики их приготовления.

Кровяно-теллуритовый агар готовится нами следующим образом: к 100 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до 56° (PH—7,6), добавляется 5% свежей дефибринированной крови кролика или барана и 0,04% теллурита натрия (или калия), предварительно расплавленного в дистиллированной воде при ее кипячении. Среда, разлитая в чашки Петри или пробирки, сохраняется на холоду до 7 суток. На одну чашку (по сегментам) можно посеять материал с 6—8 тампонов. Теллурит натрия, как и теллурит калия, может быть применен в 20% сывороточном агаре в той же дозировке.

В сравнительных опытах были испытаны кровяно-теллуритовый агар и сывороточно-теллуритовый. Эти исследования показали, что для практических целей лучше применять кровяно-теллуритовый агар, так как на этой среде дифтерийные микробыобразуют характерные колонии, чего нельзя достигнуть при посевах на сывороточно-теллуритовых средах. Дифтерийные бактерии на кровяно-теллуритовой среде высеваются через 24 часа в чистой культуре, рост сопутствующих микробов задерживается.

Высеваемость дифтерийных бактерий от одних и тех же больных с диагнозом дифтерии под вопросом (1958 г.) получалась у нас выше на кровяно-теллуритовои среде (88,9%), чем на среде Лёффлера (62,4%).

Такая кровяно-теллуритовая среда с успехом использовалась в нашей лаборатории при обследовании на бациллоносительство.

Пользуясь кровяно-теллуритовой средой, мы выработали следующий ускоренный метод, которым можно высевать дифтерийные бактерии из организма в течение 20—24 часов, а через 48 часов изучить их биохимические и токсигенные свойства.

Материал от больного забирается сухим стерильным ватным тампоном, лучше утром. Доставленный в лабораторию тампон увлажняется в 2 мл мясопептонного бульона (или мартеновского) и ставится в термостат.

Через 1—2 часа тампон ополаскивается бульоном в пробирке; из этого бульона петлей производится рассев на чашки с кровянотеллуритовой средой.

Через 20—24 часа инкубирования в термостате посевы просматриваются, готовится по 2 мазка с каждой среды и окрашиваются по Граму и Нейссеру. По наличию типичной морфологии и волютиновых зерен у палочек констатируется дифтерия, и может быть приступлено к изучению биологических свойств возбудителя.

Биохимические свойства изучаются на сывороточно-углеводных средах с индикатором. С теллуритовой среды петлей забирается выросшая культура коринобактерий и эмульгируется в 2 мл физиологического раствора поваренной соли. Приготовленная эмульсия рассевается по 0,2 мл в пробирки с сывороточно-углеводными средами (глюкоза, галактоза, мальтоза, сахароза, крахмал и мочевин­ный бульон). Результаты учитываются через 24—72 часа по изменению цвета среды и коагуляции белка; к мочевинному бульону через 24 часа приливается 2—3 капли фенолфталеина; при разложении мочевины среда окрашивается в. малиново-красный цвет, что характерно для ложно-дифтерийных бактерий.

18—24-часовая культура дифтерийных бактерий (с кровяно-теллуритовой среды) используется для определения их токсигенных свойств.

Наиболее доступным для практики методом определения токсигенных свойств дифтерийных бактерий является реакция флокуляции в твердых питательных средах, предложенная Эликом (1948) и Оучерлони (1949). Этот метод является простым, экономичным, чувствительным, не уступает биологическому методу и даже превосходит его по точности (А. Луговая и др.).

Для определения токсигенности мы применяли фосфатно-пептонный агар, предложенный Г. Романовым и А. Шнеерсон (Государственный контрольный институт сыворотки и вакцин имени Тарасевича).

Указанную среду разливали в чашки Петри с плоским дном, диаметром 10 см. В середине застывшего агара вырезали кусочек среды размером 1,5 X 6 см и удаляли его ланцетом. Затем с теллуровой среды (или Лёффлера) на поверхность агара вдоль канавки петлей засевали изучаемые культуры в виде бляшек по обе стороны канавки. Для контроля использовался заведомо токсигенный штамм. В канавку наливалась противодифтерийная сыворотка диаферм — 3 в количество 500 А. Е. (0,3 мл). Результаты отмечались через 4624—72 часа инкубирования чашек в термостате. Если штамм токси-генный, то на месте встречи диффундирующих токсина и антитоксина образуются белые линии преципитации (флокуляции) в виде дуги, расположенной между канавкой и бляшкой.

Проверка в нашей лаборатории описанной методики определения токсигенности 104 штаммов дифтерийных бактерий, выделенных от больных и носителей, показала, что большинство штаммов (95) оказалось токсигенными, что совпало с результатами их биологической проверки. Следовательно, этот метод определения токсигенности заслуживает внедрения в практику лабораторной диагностики дифтерии.

В тех же случаях, когда на кровяно-теллуритовой среде высеваются единичные колонии (как это бывает при атипичной дифтерии или обследовании на бактерионосительство), следует отсеять из них материал на среду Ру или Лёффлера, чтобы получить чистую культуру и затем изучить токсигенные свойства.

Реакции агглютинации.

Рядом авторов (Л. А. Делягина, Н. К. Шумакова, П. Н. Кравченко и др.) установлено, что при дифтерии положительная реакция агглютинации наблюдается у 84,5 -94,5% обследованных. Реакция агглютинации ставится (по типу Видаля) с типовыми культурами дифтерийных бактерий (I, II, III, IV и VI типы). Сыворотку больного, взятую на 2 и 10 день болезни, разводят 3% раствором поваренной соли в отношении от 1/50 до 1/1600. В качестве антигенов применяют суточные культуры дифтерийных бактерий, различных серотипов, на сывороточной среде. Контролем служит та же культура, эмульгированная в 3% растворе хлористого натрия. Реак­цию можно ставить на стекле. С помощью реакции агглютинации можно определить серотип дифтерийных бактерий. По нашим данным, за 1957/58 гг. в Казани чаще высевается IV серотип (65%), чем I, II, III (15%, вместе взятые).

Предложена и экспрессная кровяно-капельная методика определения агглютинации (Иванов, 1958). Из пальца больного берется несколько капель крови в узкую пробирку, в которую добавляют равное количество дистиллированной воды для приготовления лаковой крови. На предметное стекло наносится 5 капель лаковой крови, в каждую из них добавляют культуру соответствующего серотипа дифтерийных бактерий. Если микробная культура соответствует по типу сыворотке больного, то получаются заметное простым глазом агглютинирование (скопление) бактерий по периферии и связанное с этим просветление в центре капли уже через 2—3 мин при разведении 1/50 — 1/100. Кровь от лиц, практически здоровых, как и бактерионосителей, не дает агглютинации (отрицательная реакция). Кровяно-капельная реакция агглютинации при дифтерии практически перспективна, так как может быть поставлена с убитыми типовыми культурами там, где невозможно почему-либо организовать бактериологическую диагностику.

На основе своего опыта мы предлагаем следующую комплексную схему исследования:

1. Материал от больного должен забираться на сухой или сывороточный тампон утром до полоскания горла дезинфицирующими растворами или антибиотиками.
2. Доставленный в лабораторию тампон увлажняется в 1—2 мл мясопептонного бульона и ставится в термостат. Через 2 часа тампон обмывается в бульоне и производится бактериоскопия в 2 мазках, окрашенных по Граму и Нейссеру.
3. Из бульонной эмульсии делается рассев петлей по чашке с кровяно-теллуритовым агаром. Через 20—24 часа из отдельных черных или серо-черных колоний готовятся мазки для проверки морфологии и волютинообразования дифтерийных бактерий; одновременно производится определение токсигенных свойств в посевах микробной массы на чашки с фосфатно-пептонной средой (в реакции флокуляции). Таким образом, через 48 часов с момента взятия материала от больного можно дать заключение о свойствах дифтерийных бактерий, выделенных от больных, не только по морфологии, волютинообразованию, но и по токсигенным признакам, наиболее точно отличающим истинного возбудителя дифтерии от ложно дифтерийных бактерий.

Такая схема исследования на дифтерию не требует опытов на животных и позволяет дать ответ не только о наличии, но и свойствах дифтерийной палочки, определяющих выбор лечебных и профилактических мероприятий.