Induction of apoptosis and autophagy in T-lymphocytes of patients with Systemic Lupus Erythematosus

Y V Skibo; Скибо Юлия Валерьевна; A R Fathullina; Фатхуллина Алия Ринатовна; B R Ibragimov; Ибрагимов Булат Рафисович; S N Abramov; Абрамов Сергей Николаевич; R R Ismagilova; Исмагилова Резида Ринатовна; E M Biktagirova; Биктагирова Эльнара Маулетовна; I A Andrianova; Андрианова Изабелла Александровна; A N Maksudova; Максудова Аделя Наилевна; Z I Abramova; Абрамова Зинаида Ивановна

doi:10.17816/KMJ2020-347

Индукция апоптоза и аутофагии в Т-лимфоцитах пациентов с системной красной волчанкой

Авторы: Скибо Ю.В.¹, Фатхуллина А.Р.¹, Ибрагимов Б.Р.¹, Абрамов С.Н.¹, Исмагилова Р.Р.², Биктагирова Э.М.¹, Андрианова И.А.¹, Максудова А.Н.², Абрамова З.И.¹
Учреждения:
1. Казанский (Приволжский) федеральный университет
2. Казанский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 101, № 3 (2020)
Страницы: 347-355
Тип: Теоретическая и клиническая медицина
Статья получена: 18.03.2020
Статья одобрена: 13.04.2020
Статья опубликована: 13.06.2020
URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/25798
DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2020-347
ID: 25798

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Анализ экспрессии ключевых белков регуляторов апоптоза (Bcl-2, каспазы-3) и аутофагии (Beclin 1, Vps34, p62 и LC3) в Т-лимфоцитах периферической крови больных системной красной волчанкой.

Методы. Объектом исследования были Т-лимфоциты периферической крови здоровых доноров и больных системной красной волчанкой. Для получения Т-клеток использовали метод иммуномагнитной сепарации. Для анализа экспрессии белков применяли метод вестерн-блот. Обработку результатов проводили в статистической среде R. Для представления данных использовали боксплоты. Группы сравнивали с использованием критерия Манна–Уитни.

Результаты. По результатам исследования апоптотических белков мы установили повышенное содержание каспазы-3 и отсутствие значимого изменения в содержании антиапоптотического белка Bcl-2 у больных системной красной волчанкой, что свидетельствует об активной апоптотической деятельности. Сравнительный анализ Beclin 1 и Vps34 показал их повышенное содержание в клетках больных, что указывает на активацию аутофагии. Проведённый анализ двух изоформ белка LC3 выявил их низкое содержание в группе больных. Поскольку разброс показателей сильно отличался от среднего значения, мы проанализировали эти показатели в зависимости от тяжести заболевания. В группе с острым течением выявлено высокое содержание белка LC3-I, содержание II формы было ниже. В группе с подострым течением количество обеих изоформ ниже, чем в других группах. В группе с хроническим течением установлено значительное повышение количества белка LC3-II и снижение соотношения LC3-I/LC3-II.

Вывод. Проведённое исследование показало, что в зависимости от характера течения системной красной волчанки меняется содержание изоформ белка LC3, что можно использовать для дифференциальной диагностики форм заболевания.

Ключевые слова

Bcl-2, каспаза-3, Beclin 1, Vps34, LC3, апоптоз, аутофагия, системная красная волчанка

Полный текст

Актуальность. Системная красная волчанка (СКВ) — системное аутоиммунное заболевание неизвестной этиологии. Клинические проявления, видимые в большинстве органов, инициируются синтезом аутоантител к ядерным антигенам, сывороточным белкам и белкам клеточной поверхности [1–3]. Одним из наиболее часто встречающихся патогенетических механизмов при СКВ бывает нарушение гомеостаза Т-лимфоцитов [4, 5]. Апоптоз регулирует и поддерживает гомеостаз периферических лимфоцитов. Следовательно, нарушения иммунитета, такие как иммунодефицит и аутоиммунитет, возникают из-за неправильной регуляции апоптоза лимфоцитов. Аберрантный апоптоз при СКВ, особенно повышенный апоптоз лимфоцитов, был доказан в ряде экспериментов [2, 6, 7]. Кроме того, хроническая лимфопения [2] и компартментализированное высвобождение аутоантигена [8] при СКВ могут быть результатом усиления апоптоза циркулирующих Т-клеток.

Помимо апоптоза, в недавних исследованиях была показана роль аутофагии в поддержании гомеостаза лимфоцитов [9–11]. Аутофагия — катаболический процесс, опосредованный лизосомами, участвующий как в базальном обороте клеточных компонентов, так и в ответе на стрессовые состояния. Во время аутофагии часть цитоплазмы с повреждёнными белками или органеллами изолируется с помощью двухмембранных везикул (аутофагосом), которые деградируют после слияния с лизосомами для последующей рециркуляции [9–12]. Неблагоприятные условия окружающей среды, такие как истощение питательных веществ и окислительный стресс, могут вызвать аутофагию, активируя белки Atg, такие как микротрубочковый белок 1 LC3, гомолог млекопитающих дрожжей Atg8 [13–16].

Дисрегуляция аутофагии была обнаружена при ряде заболеваний, включая аутоиммунные расстройства [17, 18]. В генетических исследованиях выявлены мутации в регуляторах аутофагии [12, 19], а также в Т-клетках мышей, склонных к волчанке, и у пациентов с аномальной аутофагией при СКВ [18, 20].

Тем не менее, точная роль аутофагии в судьбе клеток остаётся противоречивой, отчасти из-за сложного функционального и молекулярного пересечения аутофагии и апоптоза. Взаимодействие молекулярных путей между аутофагией и апоптозом — сложный процесс, регуляторы апоптоза способны активировать аутофагию. К примеру, в цитоплазме белок HMGB1 взаимодействует с комплексом двух белков: Bcl-2–Beclin 1. HMGB1 связывается с белком Bcl-2, и комплекс распадается. Происходит это благодаря внутримолекулярному дисульфидному мостику между цистеином в положениях 23 и 45 (С23 и С45). После этого Bcl-2 блокирует апоптоз, а Beclin 1 запускает аутофагию [21–23]. Однако то, как эти взаимодействия влияют на клетки, остаётся спорным, и существует необходимость определения роли аутофагии и апоптоза в Т-лимфоцитах у пациентов с СКВ.

Цель. Целью проведённого исследования стал анализ экспрессии ключевых белков-регуляторов апоптоза и аутофагии в Т-лимфоцитах периферической крови больных СКВ. Эти результаты дают новое понимание патогенной роли аутофагии в нарушении регуляции гомеостаза Т-лимфоцитов при СКВ.

Материал и методы исследования. В качестве объекта исследования были использованы Т-лимфоциты периферической крови здоровых доноров и больных СКВ. Образцы периферической крови больных СКВ были получены у 10 пациентов с хроническим, острым и подострым течением заболевания, получающих иммуносупрессивную терапию: 2 мужчины и 8 женщин в возрасте от 22 до 55 лет (средний возраст 42±12,41 года). Длительность заболевания составила от 1 до 30 лет (в среднем 9,14±10,9 года). Степень активности СКВ была минимальной у 1 (10%) больного, умеренной — у 4 (40%), высокой — у 5 (50%) человек. Всем пациентам диагноз СКВ был установлен в соответствии с критериями Американской ревматологической ассоциации (1997). Клинические данные, включая возраст, пол, длительность заболевания, а также результаты иммунологического анализа, были получены при опросе пациентов и изучении медицинской документации.

Контрольную группу составили 10 практически здоровых человек: 3 (30%) мужчины и 7 (70%) женщин. Минимальный возраст в группе добровольцев составил 22 года, максимальный — 58 лет.

Критериями исключения были жалобы и объективные признаки острых заболеваний, хронические заболевания в фазе обострения, данные о ревматологических и аутоиммунных заболеваниях в семейном анамнезе.

Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет». От испытуемых было получено информированное согласие на участие в исследовании.

Т-лимфоциты выделяли по стандартной методике на градиенте плотности фиколл-урографин (ρ=1,077). Для получения популяции Т-лимфоцитов использовали метод иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Untouched Human T cells, Dynal, Invitrogen). Подсчёт клеток проводили в камере Горяева, окрашивали 0,1% раствором трипанового синего.

Проводили вестерн-блот анализ белков. К клеточному осадку добавляли 50 мкл RIPA буфера с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз (Thermo Scientific). Полученные клеточные лизаты замораживали, хранили при температуре –20 °С и размораживали непосредственно перед электрофорезом.

Определение концентрации белка в образцах проводили с использованием набора BCA Protein Assay (Thermo Scientific). Перед нанесением на гель в образцы добавляли 0,5 мкл 1% бромфенолового синего. Образцы лизатов, содержащие ~20 мкг белка, были разделены в 4–12% градиенте SDS-PAAG. После окончания электрофореза гель помещали в трансфер-буфер (25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 20% метанол, рН=8,3) и переносили белки на PVDF мембрану (Merck Millipore) в течение 1 ч при напряжении 350 В.

После трансфера мембрану инкубировали последовательно с первичными и вторичными антителами и визуализировали с применением ECL-набора на основе хемилюминесцентного субстрата (Bio-Rad). Были использованы такие первичные антитела, как антитела мыши к Bcl-2 (Cell Signaling Technology), антитела кролика к LC3 (Cell Signaling Technology), антитела кролика к каспазе-3 (Invitrogen), антитела к p62 (Invitrogen), антитела кролика к VPS34, антитела мыши к Beclin 1 (Invitrogen), антитела к GAPDH (Invitrogen). В качестве вторичных были использованы антитела, конъюгированные с пероксидазой (Life Technologies). В качестве белкового маркёра применяли MagicMark XP (Invitrogen, Molecular Probes).

Математический анализ полученных результатов проведён на персональном компьютере с использованием пакета программ Excel (Microsoft office 2007). Поскольку медианы (Me) выборок отличались от их средних значений, это означало, что варьирование индивидуальных показателей не подчиняется закону нормального распределения. Это делает некорректным использование для характеристики выборки таких статистических параметров, как среднее и стандартное отклонение. Обработку результатов проводили в статистической среде R. Для представления данных использовали боксплоты. Для сравнения трёх групп применяли критерий Краскела–Уоллиса с последующими парными сравнениями с поправкой Бонферрони и Бенжамини–Хохберга. Две группы сравнивали с использованием критерия Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего p ˂0,05.

Результаты. На первом этапе исследования был проведён анализ двух основных белков-регуляторов апоптоза: Bcl-2 и каспазы-3. Биохимическим маркёром активации апоптоза в клетках служит протеолитическое расщепление прокаспазы-3 с образованием эффекторной каспазы-3. Активность фермента приводит к деградации хромосомной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), вызывая конденсацию хроматина [24]. Сравнительный анализ между группами показал достоверное повышение содержания белка в группе больных СКВ (p-value=0,03077), что свидетельствует об активации апоптоза и согласуется с результатами других исследований (рис. 1).

Рис. 1. Анализ содержания белков Bcl-2 (А) и каспазы-3 (Б) в лизатах Т-лимфоцитов, полученных от здоровых доноров, а также больных системной красной волчанкой (СКВ)

Белок Bcl-2 ингибирует множественные формы апоптоза и играет ключевую роль в его регуляции в разных типах клеток, включая T-лимфоциты. Экспрессия Bcl-2 строго регулируется в моноцитах, нейтрофилах и Т-клетках, что свидетельствует о критической роли этого белка в гибели клеток. В проведённом исследовании мы установили, что содержание Bcl-2 у здоровых доноров и пациентов с СКВ не имеет значимого различия (p-value=0,1016; см. рис. 1, А).

На следующем этапе исследования был проведён анализ содержания ключевых белков аутофагии (Beclin 1, Vps34, p62 и LC3) в Т-лимфоцитах больных СКВ и здоровых доноров (рис. 2). Ген Beclin 1 (Atg6) играет ключевую роль в процессе аутофагии. Белок, кодируемый этим геном, активно участвует в инициации аутофагии: присоединяясь к комплексу Vps34-PI3K-CIII, он даёт начало формированию аутофагосом. Он также тесно взаимодействует с другими белками аутофагии, такими как Ambra1, ULK1, Vps15. Мы показали, что содержание Beclin 1 достоверно значительно выше в Т-клетках больных СКВ по отношению к здоровым донорам (p-value=0,1930; см. рис. 2, Б).

Рис. 2. Анализ содержания белков Vps34 и Beclin 1 в лизатах Т-лимфоцитов. А. Репрезентативный анализ вестерн-блот содержания белков Vps34 и Beclin 1 в лизатах Т-клеток. На иммунограммах представлены контрольные лизаты клеток, а также образцы лизатов, полученных из клеток больных системной красной волчанкой (СКВ). В качестве «загрузочного» контроля использован GAPDH. Б. Результаты статистического анализа данных экспрессии белка Beclin 1 (А) и Vps34 (Б) в Т-лимфоцитах, полученных от здоровых доноров, а также больных СКВ

На следующем этапе была поставлена задача оценить содержание белка Vps34 в обеих исследуемых группах. Результаты показали, что содержание данного белка, так же как и Beclin-1, выше в группе больных СКВ (p-value=0,2084; см. рис. 2).

Белок р62 служит центральным маркёром аутофагической деградации и играет роль в индукции аутофагии. Потеря Atg или факторов, необходимых для слияния аутофагосом с лизосомами, приводит к значительному увеличению p62-позитивных агрегатов. Наше исследование показало, что экспрессия p62 у больных СКВ выше, чем в контроле (p-value=0,0097; рис. 3). Поскольку содержание этого белка при нормальном течении процесса должно снижаться, это может свидетельствовать о блокировке нижестоящих членов семейства белков аутофагии. По этой причине на заключительном этапе исследования был проведён анализ содержания белка LC3 — его изоформ.

Рис. 3. Анализ содержания белка p62 в лизатах Т-лимфоцитов. А. Репрезентативный анализ вестерн-блот содержания белка p62 в лизатах Т-клеток. На иммунограммах представлены контрольные лизаты клеток, а также образцы лизатов, полученных из клеток больных системной красной волчанкой (СКВ). В качестве «загрузочного» контроля использован GAPDH. Б. Результаты статистического анализа данных экспрессии p62 в Т-лимфоцитах здоровых доноров, а также больных СКВ

Белок LC3 присутствует в цитозоле большинства типов клеток. При запуске аутофагии он протеолитически разрушается, образуя форму LC3-I. Отщеплённый белок LC3-I активируется и переносится к белку Atg3 до его конъюгации с фосфатидилэтаноламином и образования формы LC3-II. Белок LC3-II вовлекается в растущую фагофору и располагается на внутренней и внешней мембранах аутофагосомы, поэтому его количество хорошо коррелирует с числом аутофагосом. Эту характеристику преобразования LC3 можно использовать для мониторинга аутофагии.

В нашем исследовании мы обнаружили, что содержание изоформ белка LC3, а также их соотношение ниже в группе больных СКВ по сравнению с контрольной группой (рис. 4). Однако в группе больных заметно значительное отклонение от среднего значения. По этой причине мы провели анализ данных показателей в зависимости от характера течения заболевания — острого, подострого и хронического.

Рис. 4. Анализ содержания изоформ белка LC3 (I и II форм), а также их соотношения в лизатах Т-лимфоцитов здоровых доноров и больных системной красной волчанкой (СКВ)

Анализ показал, что есть различия в соотношении изоформ белка LC3 в зависимости от течения СКВ. В группе с острым течением наиболее высоким оказалось значение I формы белка по отношению к контролю. Содержание II формы также было выше по отношению к контролю, но ниже по отношению к I форме. В группе с подострым течением содержание I и II форм LC3 белка было практически одинаковым, и оно оказалось ниже по отношению к контролю. В группе с хроническим течением изменение в содержании двух форм белка LC3 было противоположно по отношению к группе с острым течением заболевания: содержание II формы оказалось значительно выше, чем I формы. То есть происходит нарастание содержания II формы белка, который локализован на мембране аутофагосом. Соотношение LC3-I/LC3-II при остром и подостром течении заболевания статистически не отличалось от контроля. И лишь в группе с хроническим течением было ниже, чем у здоровых доноров (рис. 5).

Рис. 5. Анализ содержания изоформ белка LC3 (I и II формы), а также их соотношение в Т-лимфоцитах здоровых доноров и больных системной красной волчанкой с острым, подострым и хроническим течением заболевания

Обсуждение. Аутофагия — процесс, который отвечает за деградацию повреждённых либо подлежащих удалению белков. Если этот процесс неэффективен, происходит их накопление. Есть данные, подтверждающие взаимосвязь нарушения клиренса апоптотических белков с увеличением количества ядерных антигенов, представляемых к Т-клеткам [25], что сопровождается аутоиммунными реакциями, которые могут привести к развитию СКВ.

В представленной работе был проведён анализ содержания некоторых ключевых белков апоптотического и аутофагического путей в Т-лимфоцитах периферической крови больных СКВ. По результатам исследования двух основных апоптотических белков — Bcl-2 и каспазы-3 — мы установили повышенное содержание каспазы-3 (фермента, индуцирующего конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК), что свидетельствует об активной апоптотической деятельности. Кроме того, это подтверждает отсутствие значимого изменения в содержании антиапоптотического белка Bcl-2 у больных по сравнению со здоровыми донорами. Результат согласуется с ранее полученными данными в работе Rastin и соавт., в которой содержание этого белка также оставалось на уровне контроля [26]. Таким образом, мы установили, что в Т-лимфоцитах больных СКВ апоптоз более интенсивный, чем у здоровых доноров.

Существует значительное количество данных о том, что нарушение или задержка клиренса апоптотических тел при СКВ, приводящие к накоплению апоптотического «мусора», коррелирует с персистенцией аутоантигенов [27]. Свободный апоптотический дебрис, прикреплённый к дендритным клеткам, который представляет антигенные сигналы B-клеткам, способствует их дифференцировке в высокоаффинные плазматические клетки, секретирующие антитела. Эмбрионы Atg5–/— с дефицитом аутофагии имеют более выраженное воспаление в тканях, в которых нарушен клиренс апоптотических клеток [28]. Это свидетельствует о том, что отсутствие эффективного клиренса апоптотических клеток может преодолеть толерантность к аутоантигенам и привести к СКВ.

Опираясь на полученные в нашей работе данные, мы можем говорить о том, что нарушений в самом апоптотическом процессе не выявлено, и, вероятно, аутоиммунная отягощённость вызвана недостаточной деятельностью макрофагов.

Взаимосвязь апоптоза и аутофагии показана в ряде исследований. Установлено, что при нарушении в одном из них может активироваться другой путь, либо оба процесса могут параллельно протекать в одной клетке. По этой причине на следующем этапе нашей работы была проведена оценка аутофагии путём определения содержания её ключевых белков: Beclin 1, Vps34, p62 и LC3. Сравнительный анализ Beclin 1 и Vps34 показал повышенное содержание белков в Т-клетках больных СКВ. Ген Beclin 1 (Atg6) играет ключевую роль в процессе аутофагии у млекопитающих. Белок, кодируемый этим геном, активно участвует в инициации аутофагии: присоединяясь к комплексу Vps34-PI3K-CIII, он даёт начало формированию аутофагосом. Поскольку оба этих белка входят в состав комплекса Beclin 1-Vps34-Atg14-PI3P, ответственного за элонгацию преаутофагосомы, можно сделать вывод, что в Т-клетках больных СКВ активируется аутофагия.

Белок p62 взаимодействует с аутофагическими субстратами и доставляет их в аутофагосомы для деградации. При этом количество p62 само по себе снижается, и когда индуцируется аутофагия, происходит соответствующее снижение уровня p62. Анализ содержания данного белка в группах показал не снижение, а, наоборот, значительное увеличение количества p62 у больных СКВ.

Интересно, но сам p62 считают необязательным для канонической аутофагии. В отличие от почти всех основных белков ATG, потеря которых у мышей приводит к эмбриональной или неонатальной летальности, единственным неблагоприятным исходом, проявляющимся у мышей p62–/–, бывает ожирение зрелого возраста [29]. В ряде недавних публикаций было показано, что p62 представляет собой многофункциональный каркасный белок, который взаимодействует с разными белками для регуляции различных процессов, включая апоптоз и другие формы гибели клеток, таких как некроптоз. Было показано, что p62 взаимодействует с ERK1 для регуляции адипогенеза и с протеинкиназой C (PKC zeta) для регуляции передачи сигналов NF-κB [30]. По этой причине наряду с определением содержания p62 необходимо проводить мониторинг другого важного маркёрного белка аутофагии — LC3.

Проведённый анализ содержания двух изоформ белка LC3 показал низкое содержание как изоформ, так и соотношения LC3-I/LC3-II в группе с СКВ. Поскольку разброс показателей сильно отличался от среднего значения, мы решили проанализировать эти показатели в зависимости от характера течения заболевания.

В группе с острым течением было установлено высокое содержание I изоформы белка. Содержание II формы было ниже, но по сравнению с контрольной группой его значение было выше. Соотношение форм белка оставалось на уровне контроля. В группе с подострым течением содержание обеих изоформ ниже по сравнению с другими исследуемыми группами, но соотношение LC3-I/LC3-II находится на уровне контроля. В группе с хроническим течением установлено значительное повышение белка LC3-II по сравнению с I формой. При этом отмечено значительное снижение отношения LC3-I/LC3-II. LC3-II постоянно присутствует в аутофагосоме и считается самым надёжным маркёром аутофагии. Однако не менее значимо определение содержания изоформы LC3-I. Увеличение уровня LC3-I свидетельствует об увеличении активности процессов аутофагии, а нарастание соотношения LC3-I/LC3-II может указывать на высокий уровень инициации аутофагии при нормальном протекании дальнейших стадий этого процесса, таких как везикулярный транспорт, слияние с лизосомами и протеолитическая деградация содержимого аутолизосом.

Повышение уровня LC3-II, а также уменьшение отношения LC3-I/LC3-II могут свидетельствовать о нарушении слияния аутофагосом и лизосом и, следовательно, незавершённой аутофагии, приводящей к накоплению большого количества аутофагосом внутри клетки [31, 32]. При излишнем накоплении аутофагосом внутри клеток активируются процессы образования экзосом. В результате этого агрегаты белков, обладающих прионоподобной активностью, могут быть экскретированы в межклеточное пространство и захвачены здоровыми клетками, что способствует дальнейшему распространению патологического процесса и увеличивает скорость прогрессирования заболевания.

В нашей работе тенденция к увеличению уровня LC3-II и снижению показателя LC3-I/LC3-II отмечена у пациентов с хронической формой. На основании полученных данных в группе с острой формой заболевания можно говорить о высоком уровне инициации аутофагии. А в группе с подострым течением, поскольку значения I и II форм белка были низкими, аутофагия, вероятно, малоактивна.

Результаты проведённого нами исследования впервые выявили, что в Т-лимфоцитах пациентов с острой формой СКВ есть тенденция к более высокому уровню активности аутофагии, чем у здоровых людей. В группе с подострой формой заболевания, наоборот, степень активности аутофагии оказалась незначительной. В группе с хронической формой заболевания, несмотря на высокий уровень содержания белка LC3-II, вероятно, есть нарушения на стадии слияния аутофагосом с лизосомами. Для подтверждения этой гипотезы, необходимо проведение дальнейших исследований.

Вывод

Полученные данные позволяют предложить использовать мониторинг содержания изоформ белка LC3 для дифференциальной диагностики форм системной красной волчанки.

Участие авторов. Ю.В.С., З.И.А. разработали исследование, отвечали за общее руководство и планирование; Р.Р.И., Б.Р.И. и С.Н.А. — подбор доноров для включения в исследование, подготовка образцов, выделение Т-лимфоцитов из периферической крови; Ю.В.С., А.Р.Ф. — проведение экспериментов по определению содержания белков p62, LC3 методом Western blot, статистическая обработка результатов; Б.Р.И. и С.Н.А. — проведение экспериментов по определению содержания белков Beclin 1 и Vps34 методом Western blot, статистическая обработка результатов; Э.М.Б., И.А.А. — проведение экспериментов по определению содержания белков Bcl-2, каспазы-3 методом Western blot, статистическая обработка результатов; Ю.В.С., А.Н.М. и З.И.А. способствовали интерпретации результатов; Ю.В.С. подготовила рукопись с участием всех авторов. Все авторы предоставили критическую обратную связь и помогли сформировать исследование, анализ и рукопись.

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №18-34-00739.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.