The role of interfering RNA in immune response proliferative processes regulation in experimental model of endometrial cancer associated with thyroid disease

Full Text

В последние годы изучению применения коротких интерферирующих молекул рибонуклеиновой кислоты (siРНК - от англ. short interference) в лечении онкологических заболеваний уделяют большое внимание. Искусственная индукция siРНК может быть использована в терапевтических целях для выключения различных патологических генов. Тем не менее, механизмы регулирования действия siРНК изучены недостаточно [12]. Дефицит гормонов щитовидной железы (ЩЖ) приводит к снижению ангиогенеза путём блокирования экспрессии фактора роста эндотелия сосудов [4]. Тироксин способен ингибировать апоптоз [9]. Кроме способности прямой стимуляции онкогенов, некоторые авторы называют влияние гормонов ЩЖ на субпопуляции Т-хелперов и других иммунокомпетентных клеток [5]. Есть данные о присутствии рецепторов тиреотропного гормона и гормонов ЩЖ в лимфоцитах и дендритных клетках (ДК) - специализированных антиген-презентирующих клетках, способных активизировать Т-клетки и регулировать адаптивный иммунитет [8]. Влияние тиреоидных гормонов на дифференцировку и функционирование ДК [6, 13] предполагает их возможную роль в контролировании начала адаптивного Т-клеточного иммунного ответа. При изучении патогенеза различных онкологических заболеваний большое внимание уделяют механизмам пролиферации и апоптоза опухолевых клеток, ангиогенезу, противоопухолевому иммунитету, однако данных об эпигенетических модификациях опухолевого роста при дисфункции ЩЖ очень мало. Целью исследования была оценка степени выраженности экспрессии маркёра пролиферации Кi-67 и маркёров ДК (CD1a, CD40, CD83, CD86) в опухолевой ткани при трансфекции siРНК в условиях экспериментальной патологии ЩЖ. Опыты проводили на 60 белых лабораторных крысах-самках с массой тела 180±20 г, которых содержали на стандартной диете вивария. Животные были распределены на три группы: I - группа контроля (n=12), II - группа с экспериментальным гипотиреозом (n=24), III - группа с экспериментальным гипертиреозом (n=24). При этом группы II и III подразделялись на две подгруппы (А и Б). Животным групп I, IIA и IIIA трансплантировали карциному Герена путём подкожной инъекции в область спины между лопатками 0,5 мл суспензии опухолевых клеток (5-6×106 кл/мл), полученных от крыс-доноров (штамм опухоли был получен в Институте экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины). Животным групп IIБ и IIIБ вводили опухолевые клетки вместе с введённой методом трансфекции siРНК по такой же методике [10]. Гипотиреоидное состояние (подгруппы IIА и IIБ) у крыс моделировали путём блокирования секреции тиреоидных гормонов тиреоцитами под влиянием тиамазола (мерказолила, «Здоровье», Украина), который вводили 1 раз в сутки в дозе 5 мг на 100 г массы тела внутрижелудочно в течение 2 нед. Гипертиреоидное состояние (подгруппы IIIА и IIIБ) моделировали путём внутрижелудочного введения 1 раз в сутки левотироксина натрия (L-тироксина, «Берлин-Хеми», Германия) в дозе 50 мкг на 100 г массы тела в течение 2 нед. Для получения опухолевой взвеси проводили предварительное выделение отдельных клеток опухолевой ткани путём её инкубации с коллагеназой (в концентрации 1 мкл/мл) в течение 1 ч при температуре 37 °С, после чего проводили дополнительное расщепление опухолевых клеток с помощью автоматизированной системы для механической дезагрегации тканей «BD Medimachine» (Германия). Опухолевые клетки фильтровали с помощью шприца через насадку «Steri-Dual» («3M Health Care», Германия). Подсчитывали опухолевые клетки в камере Горяева. Затем добавляли к ним среду RPMI 1640 до концентрации 5-6×106 кл/мл. Отдельно готовили смесь трансфекции. В стерильную пробирку к 4 мкл реагента трансфекции «Turbofect R-0537» («Fermentas») добавляли 100 мкл среды DMEM с высоким содержанием глюкозы и перемешивали, тщательно встряхивая, после чего выдерживали разведённый реагент трансфекции при комнатной температуре 10-20 мин. К разбавленному реагенту трансфекции добавляли 1 мкл siРНК («Thermo scientific», USA), аккуратно перемешивая с помощью пипетки, и инкубировали при комнатной температуре 10-20 мин с целью формирования трансфекционных комплексов. Полученную смесь разводили 500 мкл культуральной среды RPMI 1640. Затем аспирировали питательную среду от опухолевых клеток и сразу же заменяли разведённой смесью трансфекции. Равномерно распределяли трансфецированные комплексы, осторожно покачивая тарелку. Через 20-30 мин опухолевые клетки с введёнными методом трансфекции siРНК перевивали самкам крыс групп IIБ и IIIБ подкожным введением в область спины между лопатками. Наблюдали за развитием опухоли у подопытных животных в течении 21 сут, после чего выводили их из эксперимента путём декапитации под лёгким хлороформным наркозом. Иммуногистохимическим методом определяли биомаркёры ДК (CD1a, CD40, CD83, CD86) с помощью стандартных наборов «Dako» (США) и маркёр пролиферации Кi-67 в опухолевой ткани, полученной от экспериментальных животных. Индекс пролиферации рассчитывали как процент позитивно окрашенных ядер опухолевых клеток в пределах пролиферативного компартамента в пяти случайно выбранных полях зрения (>500 клеток) [1, 3]. Статистическая обработка проведена с помощью программы «Statistica 6.15» («StatSoft Inc.», США) [2]. Трансфекция siРНК существенно повлияла на динамику опухолевого роста (табл. 1). Замедление роста опухоли в подгруппах с трансфекционно введённой siРНК наблюдали уже с 9-го дня эксперимента. К 12-му дню объём опухоли в группе IIБ был в 1,4 раза меньше, чем в группе IIА, а в группе IIIБ - в 1,2 раза меньше по сравнению с IIIА. Наибольшее замедление роста опухоли в группах IIБ и IIIБ отмечено на 15-й день эксперимента: объём опухоли в группе IIБ был в 1,9 раза меньше, чем в группе IIА, а в группе IIIБ - в 1,4 раза меньше по сравнению с IIIА. Затем разрыв в динамике роста опухоли начал уменьшаться, и к концу эксперимента объём опухоли в группе IIБ был в 1,3 раза меньше, чем в группе IIА, в то время как разница между объёмами опухолей в подгруппах с моделированным гипертиреозом (IIIА и IIIБ) была вообще несущественной. Анализируя данные иммуногистохимического исследования маркёров ДК в опухолевой ткани, которую получали после выведения животных из эксперимента, можно сделать заключение, что как при гипо-, так и при гипертиреоидном состоянии характерным было снижение активности зрелых ДК (CD83, CD86) (табл. 2). При этом популяция незрелых ДК была значительно беднее при экспериментальном гипотиреозе. После трансфекции siРНК уровень экспрессии как зрелых, так и незрелых ДК повысился, однако при гипотиреозе преобладали зрелые ДК (CD83), а при гипертиреозе - незрелые ДК (CD1a). Индекс пролиферации опухолевых клеток для самок-крыс в группе I (контрольной) был меньшим по сравнению с экспериментальным гипо- и гипертиреозом без трансфекции siРНК и составлял 9,8%. После трансфекции siРНК при гипотиреоидном состоянии этот индекс уменьшился в 1,3 раза и почти не отличался от подобного показателя при гипертиреоидном состоянии. Если сравнивать индекс пролиферации опухолевых клеток для гипо- и гипертиреоза без применения трансфекции siРНК и с ней, то нами отмечено, что в группе IIА (с моделированным гипотиреозом) он составлял 14,4%, тогда как в группе IIБ этот показатель был меньше в 2,5 раза и составлял всего 5,6%. В условиях экспериментального гипертиреоза после введения siРНК индекс пролиферации почти не изменился: в группе IIIА он составлял 10,3%, а в III Б - 9,6%. Учитывая тот факт, что дефицит гормонов ЩЖ угнетает ангиогенез [4], можно было предположить, что прогрессирование опухолевого роста на фоне гипотиреоза должно быть менее выраженным, чем при гипертиреозе. Однако в случае с раком эндометрия мы получили противоположную картину. По всей видимости, здесь необходимо учитывать наличие гиперэстрогенемии, которая может оказывать стимулирующее влияние на фактор роста эндотелия сосудов, активизировать пролиферацию опухолевых клеток и подавлять их апоптоз [7, 14]. Таким образом, эстрогены играют важную роль в патогенезе рака эндометрия при гипотиреозе. Существуют данные о том, что активированный фактор роста эндотелия сосудов угнетает иммунную систему в отношении противоопухолевой защиты, а это приводит к снижению экспрессии как зрелых, так и незрелых ДК [11]. В результате проведённых исследований нами выявлено, что как при гипо-, так и при гипертиреозе происходит снижение активности зрелых ДК (СD83, CD86) в опухолевой ткани, при этом угнетение популяции незрелых ДК (CD1a, CD40) при гипотиреоидном состоянии более выражено. На основании вышеизложенного можно сделать заключение о том, что нарушение функций ЩЖ приводит к снижению дифференцировки ДК при раке эндометрия, причём дефицит гормонов ЩЖ препятствует миграции незрелых ДК в опухолевую ткань, подавляя механизмы противоопухолевого иммунного надзора. Повышение уровня экспрессии как зрелых, так и незрелых ДК после трансфекции siРНК в опухолевую ткань на фоне гипо- и гипертиреоидного состояния можно связать с тем фактом, что siРНК способна подавлять активность фактора роста эндотелия сосудов [11]. Согласно полученным данным, применение трансфекции siРНК к концу эксперимента уменьшило рост опухоли у крыс с гипотиреоидным состоянием на 25,5%, тогда как рост опухоли при гипертиреоидном статусе уменьшился всего на 3,5%, что позволяет предположить наличие у гормонов ЩЖ способности блокировать ингибирующее влияние siРНК. Учитывая тот факт, что в результате трансфекции siРНК в опухолевую ткань индекс пролиферации опухолевых клеток при гипотиреозе уменьшился в 2,5 раза, а степень экспрессии маркёров ДК повысилась независимо от функционального состояния ЩЖ, можно говорить об антипролиферативном и иммуностимулирующем действии siРНК при раке эндометрия, что подтверждает ещё бóльшую перспективность применения siРНК в лечении онкологических больных. ВЫВОДЫ 1. В условиях экспериментальной модели рака эндометрия трансфекция siРНК приводит к повышению экспрессии зрелых дендритных клеток (СD83) в опухолевой ткани при гипотиреоидном состоянии и незрелых дендритных клеток (CD1a) при гипертиреоидном состоянии. 2. Трансфекция siРНК тормозит пролиферацию опухолевых клеток в большей степени при гипотиреозе, чем при гипертиреозе. Таблица 1 Динамика роста опухоли (см3) в экспериментальных группах (M±m) Группа Дни эксперимента 9-й 12-й 15-й 18-й 21-й IIА 2,38±0,15 7,76±0,37 15,82±0,55 18,77±0,61 21,39±0,41 IIБ 1,71±0,08 5,5±0,15 8,02±0,25 11,41±0,44 15,92±0,48 IIIА 2,6±0,13 6,22±0,25 12,92±0,45 17,35±0,39 19,22±0,74 IIIБ 1,62±0,14 5,18±0,17 9,5±0,31 14,83±0,64 18,53±0,72 Примечание: IIА - экспериментальный гипотиреоз; IIБ - экспериментальный гипотиреоз с трансфекцией siРНК; IIIА - экспериментальный гипертиреоз; IIIБ - экспериментальный гипертиреоз с трансфекцией siРНК. Таблица 2 Функциональное состояние антиген-презентирующих клеток в опухолевой ткани Маркёр Контроль Экспериментальный гипотиреоз Экспериментальный гипертиреоз I IIА IIБ IIIА IIIБ CD1a +/- - +/- +/- + CD40 + +/- +/- +/- +/- CD83 + +/- + +/- +/- CD86 +/- +/- +/- +/- +/- Примечание: I - группа контроля; IIА - экспериментальный гипотиреоз; IIБ - экспериментальный гипотиреоз с трансфекцией siРНК; IIIА - экспериментальный гипертиреоз; IIIБ - экспериментальный гипертиреоз с трансфекцией siРНК.

About the authors

V M Zaporozhan

Odessa National Medical University, Odessa, Ukraine

G S Maryniuk

Odessa National Medical University, Odessa, Ukraine

O L Kholodkova

Odessa National Medical University, Odessa, Ukraine

Email: kholodkova_l@rambler.ru

D U Andronov

Odessa National Medical University, Odessa, Ukraine

References

Supplementary files