Possible involvement of adenosine triphosphate in the mechanisms of protein sensibilization effect on the functional properties of the diaphragm and skeletal muscles

Full Text

Бронхиальная астма сопровождается изменением функционального состояния дыхательных мышц, в первую очередь диафрагмы. При изучении патогенеза аллергии часто применяют модель белковой сенсибилизации мышей [5, 6]. Ранее установлено, что при белковой сенсибилизации сократительные свойства полоски диафрагмы (состоящей из «быстрых» и «медленных» мышечных волокон) и «быстрой» скелетной мышцы голени мыши in vitro претерпевают разнонаправленные изменения, основную роль отводят холиноопосредованным процессам возбуждения постсинаптической мембраны [9]. Также была показана способность экзогенной аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) обратимо изменять сократительную функцию и величину неквантовой секреции ацетилхолина мышц несенсибилизированных мышей [1, 4]. В качестве кофактора синаптической передачи АТФ влияет на процессы возбуждения мышечного волокна. В литературе есть указания на участие АТФ в иммунном ответе [10]. Цель работы - изучение влияния экзогенной АТФ на сократительный ответ, вызываемый холиномиметиком карбахолом (карбахолином), и величину неквантовой секреции ацетилхолина в зоне концевой пластинки изолированных поперечнополосатых мышц: «медленной» камбаловидной, «смешанной» диафрагмальной и «быстрой» (длинного разгибателя пальцев) интактных и сенсибилизированных мышей. Эксперименты выполняли на белых мышах обоего пола c массой тела 17-22 г. Сенсибилизацию осуществляли яичным альбумином с гелем гидроксида алюминия («Sigma», США), контроль - по методике И.С. Гущина и соавт. Механомиографические исследования проводили на препарате изолированной мышцы в условиях изометрии, которой достигали растяжением скелетной мышцы в течение 20 мин с помощью подвешивания груза массой 0,5 г, при постоянной перфузии раствором Кребса и температурном режиме 20-21°С. Сокращение регистрировали фотоэлектрическим преобразователем. Карбахолин применяли в субмаксимальных концентрациях, которые составляли для камбаловидной мышцы 5×10-4М, для диафрагмальной мышцы - 2×10-4М, для длинного разгибателя пальцев - 7×10-4М. Оценивали силу (Рос) сокращения мышцы в ответ на карбахолин. Для изучения состояния постсинаптической мембраны мышечного волокна в области концевой пластинки с помощью стеклянных микроэлектродов (с сопротивлением 8-12 МОм, заполненных 2,5 М раствором калия хлорида) измеряли неквантовую секрецию ацетилхолина [3]. Предварительно этилнитрофенилэтилфосфонатом (армином, «Татхимфармпрепараты», Россия) устраняли действие ацетилхолинэстеразы, после чего на мышцу в течение 8-12 мин апплицировали блокатор Н-холинорецепторов d-тубокурарин (ТБК) в концентрации 10-5 М. Разность значений мембранного потенциала до и после аппликации ТБК соответствует величине неквантовой секреции ацетилхолина (Н-эффект). Влияние АТФ («Boehringer Mannheim Gmbh», Германия) оценивали путём сравнения показателей сокращения до и после 5-минутной перфузии 1×10-4 М раствором АТФ; время действия на мышцу определялось длительностью перфузии. Полученные результаты подвергали статистической обработке с помощью пакета статистических программ («Biostatistica», S.A. Glantz, McGraw Hill). У камбаловидной мышцы несенсибилизированной мыши инкубация с АТФ достоверно увеличивает Рос, та же тенденция отмечена при белковой сенсибилизации. Изучение неквантовой секреции ацетилхолина интактной мыши показало, что мембранный потенциал покоя, изначально составляющий -70,9±1,7 мВ (n=150), в присутствии ТБК возрастал до -75,9±1,3 мВ (n=150). После инкубации с АТФ мембранный потенциал покоя в присутствии ТБК возрастал, то есть инкубация с АТФ достоверно снижала Н-эффект. В условиях белковой сенсибилизации мембранный потенциал покоя, изначально составляющий -69,4±0,9 мВ (n=150), в присутствии ТБК возрастал до -72,5±1,0 мВ (n=150). После инкубации с АТФ мембранный потенциал покоя в присутствии ТБК возрастал, то есть при сенсибилизации инкубация с АТФ достоверно снижала Н-эффект. Инкубация с АТФ достоверно увеличивала Рос диафрагмальной мышцы как у несенсибилизированных мышей, так и у подвергшихся белковой сенсибилизации. Динамика неквантовой секреции ацетилхолина показала, что мембранный потенциал покоя, изначально составляющий -70,7±1,9 мВ (n=150), в присутствии ТБК возрастал. После инкубации с АТФ мембранный потенциал покоя в присутствии ТБК увеличивался до -71,5±0,5 мВ, таким образом, Н-эффект у диафрагмы несенсибилизированной мыши при инкубации с АТФ достоверно снижался. При белковой сенсибилизации мембранный потенциал покоя, изначально составляющий -70,0±1,5 мВ (n=150), в присутствии ТБК возрастал до -74,4±0,6 мВ (n=150). При инкубации с АТФ мембранный потенциал покоя в присутствии ТБК повышался до -71,5±0,6 мВ (n=150), то есть при белковой сенсибилизации инкубация с АТФ достоверно снижала Н-эффект. У длинного разгибателя пальцев несенсибилизированной мыши инкубация с АТФ достоверно снижала Рос. В условиях белковой сенсибилизации инкубация с АТФ приводила к достоверному снижению Рос. Изучение неквантовой секреции ацетилхолина несенсибилизированной мышцы показало, что мембранный потенциал покоя, изначально составляющий -72,3±0,6 мВ (n=150), в присутствии ТБК возрастал до -77,4±1,6 мВ (n=150). После инкубации с АТФ мембранный потенциал покоя в присутствии ТБК увеличивался до -77,3±1,1 мВ (n=150), то есть Н-эффект длинного разгибателя пальцев несенсибилизированной мыши при инкубации с АТФ практически не изменялся. Изучение неквантовой секреции ацетилхолина в условиях сенсибилизации показало, что мембранный потенциал покоя, изначально составляющий -73,9±0,5 мВ (n=150), в присутствии ТБК повышался до -79,7±1,7 мВ (n=150). После инкубации с АТФ мембранный потенциал покоя в присутствии ТБК возрастал до -79,3±1,4 мВ (n=150). Инкубация с АТФ в условиях белковой сенсибилизации практически не изменяла значения Н-эффекта. Обсуждая результаты исследования, хотелось бы указать на разный характер изменения сократительной функции всех трёх мышц («быстрой», «смешанной» и «медленной») мыши при сенсибилизации. Причины этого заключаются как в исходных различиях их морфофункционального статуса, так и в механизмах, обеспечивающих эти изменения в процессе аллергической перестройки организма. Необходимо отметить, что у мышей нет поперечнополосатых мышц, состоящих только из «медленных» мышечных волокон. Если длинный разгибатель пальцев на 97-100% состоит из «быстрых» мышечных волокон, камбаловидная содержит 50-60% «медленных», то диафрагма содержит 88,6% «быстрого» миозина, занимая промежуточное положение. При белковой сенсибилизации сила сокращения «быстрой» мышцы в ответ на карбахолин снижается, «смешанной» и «медленной» - возрастает. Обнаруженные различия, вероятно, отражают состояние поверхностной мембраны и холиноопосредованные процессы её возбуждения. Подтверждением этому служит корреляция динамики силы сокращения и уровня неквантовой секреции ацетилхолина в зоне концевой пластинки (Н-эффекта). Логично предположить, что у «смешанной» и «медленной» мышц увеличение силы сокращения в ответ на карбахолин - следствие повышения чувствительности постсинапса к холиномиметику, отражением чего является снижение Н-эффекта. Уменьшение неквантовой секреции ацетилхолина в зоне синапса вызывает снижение интенсивности механизмов десенситизации холинорецепторов постсинаптической мембраны. Соответственно, у «быстрой» мышцы наблюдается обратная картина. Снижение силы сокращения в ответ на карбахолин - следствие уменьшения чувствительности её постсинапса к холиномиметику, что проявляется в увеличении Н-эффекта. Причины обнаруженной вариабельности функциональных свойств изучаемых мышц при белковой сенсибилизации, возможно, заключаются в механизмах выделения кофакторов синаптической передачи. Исходя из данных Tsai T.L. и соавт. [10], показавших роль АТФ в иммунном ответе, мы предположили возможное участие пуринов в процессах изменения функционирования скелетных мышц при белковой сенсибилизации. Это привело нас к идее изучения (в рамках выбранных экспериментальных моделей) динамики функциональных свойств мышц сенсибилизированных и интактных мышей до и после их инкубации с АТФ. Наши исследования подтвердили, что при белковой сенсибилизации влияние АТФ на динамику функциональных свойств у всех мышц демонстрирует ту же направленность, что указывает на отсутствие принципиальных различий в механизмах влияния пуринов на поперечнополосатые мышцы интактных и сенсибилизированных мышей. Однако если АТФ увеличивала силу сокращения диафрагмальной мышцы интактных животных на 26,8%, то у сенсибилизированных - лишь на 15,1%. Н-эффект у этой мышцы несенсибилизированных мышей после влияния АТФ снижался до 28,8% исходного, у сенсибилизированных же - лишь до 54,5%. Менее выраженная динамика функциональных свойств диафрагмы, вызванная АТФ у сенсибилизированных мышей в сравнении с контролем, позволяет предполагать её участие в механизмах функциональных изменений дыхательных мышц при белковой сенсибилизации. Динамика функциональных свойств «медленной» мышцы имеет сходную картину. Сила сокращения камбаловидной мышцы интактных животных возрастала на 24,3%, у сенсибилизированных - лишь на 12,2%. Н-эффект у этой мышцы несенсибилизированных мышей после влияния АТФ снижался до 20% исходного значения, у сенсибилизированных - лишь до 67,7%. У длинного разгибателя пальцев интактных животных снижение силы сокращения после влияния АТФ (до 72,6%) практически не отличалось от таковой у сенсибилизированных (до 74,8%). Н-эффект после влияния АТФ достоверно не менялся ни у интактных, ни у сенсибилизированных мышей. Отсутствие различий в изменении силы сокращения и уровня неквантовой секреции ацетилхолина после влияния АТФ у обеих групп животных отвергает гипотезу о влиянии пуринов на сократительную функцию «быстрой» мышцы мыши в условиях сенсибилизации. Влияние АТФ в наших экспериментальных моделях включает прямое действие пуринов на сократительные структуры, секрецию медиатора, системы внутриклеточных посредников [1] и работу АТФ-зависимых калиевых каналов [10]. Оно осуществляется через P2-рецепторы, что подтверждается способностью сурамина устранять влияние АТФ во всех экспериментальных моделях. Кроме того, замена АТФ на аденозин, реализующий своё действие через аденозиновые Р1-рецепторы [2], не изменяет ни параметров вызванного карбахолином сокращения мышц, ни величины Н-эффекта. Различия в реакции на АТФ мышц интактных и сенсибилизированных мышей позволяют предположить её участие в иммунном ответе. В частности, в литературе показано, что АТФ, увеличивая синтез интерлейкина-1, может усиливать специфическое звено иммунитета [7]. Внеклеточная АТФ при генерации иммунного ответа помогает образованию активной каспазы-1, что в свою очередь обеспечивает секрецию биологически активных форм интерлейкина-1. Гиперэкспрессия рецептора Р2Х7 приводит к секреции зрелого интерлейкина-1β [8]. Таким образом, белковая сенсибилизация как экспериментальная модель позволила выявить некоторые механизмы изменения в дыхательной мышце при скрытой аллергизации организма. ВЫВОДЫ 1. Снижение функциональных свойств диафрагмы мыши при белковой сенсибилизации, вызванное экзогенной АТФ, свидетельствует о развитии ранней резистентности дыхательных мышц к внешним нагрузкам, которая появляется при обструктивных формах нарушения внешнего дыхания. 2. Отсутствие сходной динамики у «быстрой» мышцы (длинного разгибателя пальцев) мыши показывает, что обнаруженные компенсаторные механизмы у основной дыхательной мышцы при бронхиальной астме определяются «медленными» мышечными волокнами. В изменении сократительной функции «быстрой» мышцы при белковой сенсибилизации можно ожидать участия иных, не связанных с АТФ механизмов.

About the authors

A Yu Teplov

Kazan State Medical University

A M Farkhutdinov

Kazan State Medical University

Email: a.farkutdinov@gmail.com

S N Grishin

Kazan State Technical University named after A.N. Tupolev

M M Minnebaev

Kazan State Medical University

V I Torshin

Russian Peoples’ Friendship University, Moscow city

References

Supplementary files