The metabolitic role of the iron porphyrin complex in the development of anemic syndrome in patients with minor form of β-thalassemia

Full Text

Малая форма β-талассемии - распространённая наследственная патология эритрона, основной симптом которой - гипохромная микроцитарная анемия [4, 6]. Установлено, что анемия у больных развивается в тех случаях, когда синтез гемоглобина (Hb) страдает в большей степени, чем образование эритроцитов. При β-талассемии развитию анемического синдрома могут способствовать изменения в структуре гема Hb [5, 8, 11]. Гем-регулятор, ответственный за данный процесс, синтезируется преимущественно эритробластами костного мозга, и на регуляцию его синтеза оказывает влияние присутствие в клетке незначительного количества протопорфирина и α-цепей. Наличие протопорфирина в клетке рассматривают как результат скопления промежуточных неиспользованных ингредиентов синтеза гема либо как побочное соединение, образующееся в этом процессе [3]. Регуляция синтеза гема в эритроидных клетках связана с доступностью железа и особенностями действия эритропоэтина на эритроидные клетки-предшественницы с различной степенью дифференцировки [1, 9]. Этот процесс оказывает влияние на метаболизм железопорфиринового комплекса, определяя развитие и исход заболевания [7, 10, 12]. В патогенезе анемии при малой форме β-талассемии большое внимание уделяют изменениям обмена железа и синтеза молекул глобина. Сообщений о метаболизме порфиринов при указанной патологии крайне мало, что ставит данное заболевание в разряд актуальных проблем. Цель исследования - изучение роли метаболизма порфиринов в развитии анемического синдрома у больных малой формой β-талассемии без сопутствующей недостаточности фермента глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г6ФД) и с его недостаточностью. Обследованы 208 больных с впервые выявленной малой формой β-талассемии, из них 150 без сопутствующей патологии (первая группа) и 58 с недостаточной активностью фермента Г6ФД (вторая группа). Группы состояли преимущественно из близких родственников больных гомозиготной и промежуточной формами β-талассемии (медиана возраста 25 лет), из них 139 женщин и 69 мужчин. При осмотре больных и ультразвуковом исследовании органов брюшной полости обнаружено увеличение размеров селезёнки, а у 38 больных второй группы - размеров печени (край органа ниже рёберной дуги на 2-4 и 1,5-4 см соответственно). При рентгенографии костей скелета у 98 больных обнаружено расширение губчатого слоя и истончение коркового слоя с признаками остеопороза в длинных трубчатых костях. Диагноз подтверждали при помощи электрофореза Hb, метода Marengo-Row (1965) (фетальный Hb 2,8-3,4%; HbA2 3,6-3,9%), выявления высокой осмотической резистентности эритроцитов. Активность Г6ФД определяли качественным способом по методу R.E. Bernstein (1962). Для получения нормальных показателей обмена железа и порфиринов выделена контрольная группа, состоящая из 30 здоровых лиц. При верификации диагноза использовали семейно-генетические исследования. Из-за точечной мутации в одном из генов, ответственных за синтез β-глобиновых цепей, у больных их синтез был незначительно снижен. При лечении больных применяли дефероксамин (десферал) из расчёта 25-30 мг/кг в сутки подкожно (7-10 дней в месяц). С целью контроля определяли показатели ферритина в сыворотке крови. По показаниям назначали гепатопротектор адеметионин (гептрал) по 400 мг внутривенно 2 раза в неделю (до 1,5 мес), а с целью купирования анемического синдрома - эпоэтин альфа (эпрекс) по 10 000 МЕ подкожно 3 раза в неделю. Для борьбы с интоксикацией, устранения причины гемолиза и осложнений со стороны почек и сердца больным из второй группы назначали сеансы лечебного плазмафереза (до 3 процедур с интервалом 3-5 дней). Всем больным с малой формой β-талассемии в динамике до и после лечения проводили следующие лабораторные исследования: общий анализ крови с подсчётом тромбоцитов и ретикулоцитов (бинокулярный микроскоп «МС-50»), определение гематокрита и основных эритроцитарных показателей на автоматическом анализаторе «Pentra 120» (количество эритроцитов, средний объём эритроцита, среднее содержание Hb в эритроците, средняя концентрация Hb в эритроцитах). По общепринятым методам на биохимическом анализаторе оценивали содержание общего билирубина и его фракций в сыворотке крови, активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), b-глутамилтранспептидазы (ГГТ), щелочной фосфатазы (ЩФ). По методу R. Henry и соавт. (1958) на спектрофотометре «СФ4А» исследовали концентрацию сывороточного железа (СЖ, норма 18,9± ±0,79 мкмоль/л) и общую железосвязывающую способность сыворотки крови (ОЖСС, норма 58,6±1,3 мкмоль/л). С помощью аппарата «Organon teknika microwell system» иммуноферментным методом определяли уровень ферритина в сыворотке крови (норма 76±4,9 нг/мл). Наряду с этим, используя моноклональные антитела, иммуноферментным методом исследовали уровень растворимых трансферриновых рецепторов (норма 1,6-2,9 мкг/л), а флуориметрическим способом на аппарате «Proto Fluor Z.» в капиллярной крови определяли концентрацию цинкпротопорфирина (норма 27-68 мкмоль/моль). В костном мозге подсчитывали содержание сидеробластов и сидероцитов. В контрольной группе уровень сидеробластов составил 24,5±0,98%, сидероцитов 2,8±0,7%. Для выявления морфологических изменений в структуре печёночной ткани и определения в ней железа 30 больным из каждой группы была проведена пункционная биопсия печени (норма содержания железа в печёночной ткани до 1 мг/г сухого вещества печени). Наряду с этим исследовали порфириновый обмен с использованием качественных и количественных методов. Основные показатели метаболизма порфиринов в количественном эквиваленте получали на спектрофотометрах «СФ-4А» и «СФ-16». С помощью ионообменной хроматографии определяли начальные этапы синтеза порфиринов - количество аминолевулиновой кислоты и порфобилиногена в моче по D. Mauzerall и S. Granik (1956). Исследовали содержание свободных порфиринов в эритроцитах (уропорфирина, копропорфирина и протопорфирина) по методу T. Dressel и J. Falk (1956). Учитывая повышенную светочувствительность порфиринов и их нестойкость в растворах, мы внесли корректировку в применяемые методы: (1) работу проводили в затемнённом помещении; (2) сокращали все этапы исследования - продолжительность экстракции, разделения сред и последующего отмывания экстрактов; (3) для полноты выделения порфиринов из рабочей среды водоструйный насос заменили на стеклянный гомогенизатор с двумя фильтрами, что сократило время на проведение исследований и дало возможность достичь полноты выделения порфиринов из эритроцитов. В норме средняя концентрация уропорфирина составила 0,2±0,01 мкмоль/л, копропорфирина 0,55±0,04 мкмоль/л, протопорфирина 4,3±0,3 мкмоль/л, в моче содержание аминолевулиновой кислоты 8,6±0,7 мкмоль/сут и порфобилиногена 2,06±0,34 мкмоль/сут. Полученные результаты оценивали статистически, путём определения среднеарифметических величин (М) и ошибок (±m) методом вариационной статистики. При обработке данных использовали программы для электронной таблицы Мicrosoft Excel (Windows XP), а также пакет статистических программ «Statistica 6.0». Анемический синдром различной степени тяжести присутствовал у всех больных с изменениями эритроцитарных параметров, признаками гемолиза и у 38 пациентов с патологическими печёночными пробами. Анемия в сравниваемых группах была гипохромной микроцитарной, с анизо- и пойкилоцитозом, мишеневидными эритроцитами (табл. 1). В обеих группах больных эритроцитарные параметры (средний объём эритроцита и среднее содержание Hb в эритроците) были сниженными (р <0,01). У 29 больных второй группы, где малая форма β-талассемии сопровождалась нарушенной активностью фермента Г6ФД, был обнаружен гиперспленический синдром. Количество Hb, эритроцитов и гематокрит в первой группе до лечения было понижено (90±2,3 г/л, 4,9±0,3×1012/л и 29,5±1,3% соответственно). У больных второй группы эти показатели были ещё ниже (Hb 86±2,7 г/л, количество эритроцитов 4,6±0,6×1012/л), что обусловлено как основной патологией, так и гемолизом эритроцитов вследствие дефицита Г6ФД. Одновременно у больных второй группы зарегистрировано нарушение функционального состояния печени, подтверждённое положительными печёночными пробами (АЛТ, ГГТ, ЩФ), изменения которых нарастали при гемолитическом кризе, особенно при дефиците Г6ФД (табл. 2). Преимущественно у пациентов второй группы выявлено повышенное содержание общего билирубина в сыворотке крови за счёт непрямой фракции и высокая активность аминотрансфераз. ОЖСС была низкой, что свидетельствовало о нарушении белковосинтезирующей функции печени. Также выявлено нарушение гемобразования, о чём свидетельствовали изменения начальных этапов синтеза гема Hb (его предшественников) и перегрузка организма железом (см. табл. 2). Отмечено повышение содержания аминолевулиновой кислоты и порфобилиногена в моче (р <0,01), причём более отчётливое у больных второй группы, что отразилось на последующих этапах синтеза порфиринов (р <0,01). При малой форме β-талассемии выявлен дисбаланс в концентрации свободных форм порфиринов в эритроцитах, тяжесть которого связана с сопутствующей недостаточностью активности Г6ФД. В первой группе при малой форме β-талассемии количество свободного уропорфирина было нормальным, в то время как у больных второй группы - низким (р <0,01). Вместе с тем, у больных обеих групп в динамике не отмечено значимых различий в показаниях эритроцитарного копропорфирина, который в среднем несущественно отличался от нормы, что служит важным диагностическим признаком, характерным для малой формы β-талассемии. Следует отметить выявленные изменения в синтезе конечного продукта обмена порфиринов - протопорфирина, на содержание которого оказывала влияние тяжесть гемолиза в результате сопутствующего дефицита Г6ФД. В первой группе больных концентрация протопорфирина в эритроцитах до и после лечения не отличалась от нормы (3,9±0,3 и 4,3±0,3 мкмоль/л соответственно, р >0,5). В то же время во второй группе его количество было ниже нормы и данных в первой группе (2,5±0,16 и 2,8±0,24 мкмоль/л, р <0,01). Это важный диагностический признак при малой форме β-талассемии с сопутствующим дефицитом Г6ФД. Параллельно с нарушениями в порфириновом обмене у больных обнаружены изменения в метаболизме железа, которые преимущественно касались его запасов. У 132 из 208 больных отмечен дисбаланс между умеренно увеличенным содержанием СЖ и высокими общими запасами этого элемента в организме. У больных из второй группы количество СЖ существенно повышалось на высоте гемолитического криза (р <0,01), что коррелировало с повышенным содержанием растворимых трансферриновых рецепторов (r=0,06). В процессе проводимой терапии зарегистрировано отчётливое снижение концентрации цинкпротопорфирина в эритроцитах (до лечения 25±0,9 мкмоль/моль гема, после терапии 14±0,06 мкмоль/моль гема). У больных первой группы без дефицита Г6ФД количество цинкпротопорфирина не менялось, что имело существенное значение в плане ранней диагностики малой формы β-талассемии. Гемолиз эритроцитов при дефиците Г6ФД способствовал повышению запасов железа, о чём свидетельствовал высокий уровень ферритина в сыворотке крови, концентрация которого в первой группе составляла 189±1,5 нг/мл, а во второй 356±2,7 нг/мл. Перегрузка железом организма больных малой формой β-талассемии без дефицита Г6ФД и с дефицитом подтверждалась высоким количеством сидеробластов (29±0,6%; 42±1,3%) и сидероцитов (5,1±0,3%; 8,5±0,4%) в костном мозге, а также результатами биопсии печени. В биоптате количество железа в несколько раз превышало норму. ВЫВОДЫ Показатели СЖ и ОЖСС не отражают истинного состояния метаболизма железа в организме больных малой формой β-талассемии, поэтому параллельное изучение содержания свободных форм порфиринов в эритроцитах оказывает своевременную помощь в дифференциальной диагностике анемического синдрома. Важными информативными критериями при малой форме β-талассемии с дефицитом Г6ФД служат высокая величина экскреции аминолевулиновой кислоты и порфобилиногена с мочой и низкое содержание уропорфирина и протопорфирина в эритроцитах. Сниженная активность Г6ФД способствует повышению запасов железа и влияет на синтез порфиринов, активизируя его начальные этапы. Исследование показателей растворимых трансферриновых рецепторов и цинкпротопорфирина - альтернатива определению содержания СЖ. Таблица 1 Основные гематологические и биохимические показатели при малой форме β-талассемии с учётом проводимой терапии (M±m) Форма болезни Период определения Средний объём эритроцита (80-94 фл) Среднее содержание Hb в эритроците (27-31 пг) Средняя концентрация Hb в эритроцитах (32-36 г/л) Ретикулоциты (0,5-1,2%) Общий билирубин (5,3-19 мкмоль/л) АЛТ (8-40 МЕ/л) ГГТ (25-30 ЕД/мг) Малая форма β-талассемии, n=150 До лечения 61±0,9* 19,3±0,6* 30,6±0,5 1,9±0,1* 25±0,15* 49±0,6* 34±0,4* После лечения 26± 0,1 32,2±0,6 1,5±0,1 22±0,1 45±0,2 30±0,5 Малая форма β-талассемии с дефицитом Г6ФД, n=58 До лечения 59±0,7* 18,6±0,3* 29,7±1,1 2,7±0,9* 34±1,4* 56±2,4* 42±1,8* После лечения 22±1,1 31,6±1,3 2,2±0,6 27±2,1** 53±2,1 35±1,4** Примечание. Достоверность различий: *р <0,01 - сравнение нормы с периодом поступления; **р <0,01 - сравнение периодов до и после лечения. Таблица 2 Основные показатели железопорфиринового комплекса при малой форме β-талассемии, с учетом проводимой терапии (M±m) Формы заболевания Период определения СЖ ОЖСС Аминолевулиновая кослота Порфобилиноген Уропорфирин Копропорфирин Fe в ткани печени, мг/г сухого вещества мкмоль/л мкмоль/сут мкмоль/л Малая форма β-талассемии, n=150 До лечения 27,5±0,4 50±0,5 13±0,1* 8,6±0,02* 0,2±0,01 0,48±0,02 2,7-6,5* После лечения 21,4±0,2 52±0,6 9,5±0,1 7,2±0,01 0,25±0,01 0,52±0,01 Малая форма β-талассеии с дефицитом Г6ФД, n=58 До лечения 68±2,8* 39±1,3* 23±0,9* 17±0,5* 0,1±0,01* 0,58±0,025 3,6-8,7* После лечения 53±2,4** 44±1,9 18±0,6 14±0,4 0,15±0,01 0,51±0,015 Примечание. Достоверность различий: *р <0,01 - сравнение нормы с периодом поступления; **р <0,01 - сравнение периодов до и после лечения.

About the authors

D A Baytaeva

Azerbaijan Research Institute of Hematology and Transfusiology named after B.A. Eyvazov, Baku

Email: retopop@yandex.ru

S S Bessmeltsev

Scientific Research Institute of Hematology and Transfusiology, St. Petersburg

References

Supplementary files