Использование атомно-силовой микроскопии в изучении плотных тканей орофациальной области

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Изучение возможности применения атомно-силовой микроскопии для морфологической диагностики патологии соединительной ткани по твёрдым тканям зубов и костной ткани. Методы. С помощью атомно-силовой микроскопии оценивали степень упаковки, размер и форму костных пластинок, эмалевых призм, а также размер межпризменных промежутков и их высоту в костной ткани и эмали зубов. Материалом служили 30 удалённых по клиническим показаниям (в связи с травмой тупым твёрдым предметом) зубов и образцов костной ткани пациентов с дисплазией соединительной ткани и 27 удалённых зубов и образцов костной ткани группы контроля. Результаты. Установлено, что аномальная компоновка коллагена при патологии соединительной ткани сопровождается увеличением промежутка между волокнами до 98 нм и снижением доли минерального матрикса в кости. В эмали зубов также выявлены нарушения формы и размеров эмалевых призм [(5,5±0,3)×(5,4±0,1) мкм] с увеличением расстояния между эмалевыми призмами до 1,5±0,1 мкм. При оценке костной ткани основным различием между группой контроля и пациентами с патологией соединительной ткани было наличие пустот во втором случае, что сопровождалось изменением структуры залегания минеральных элементов кости, нарушением формирования костных пластинок, а также изменением количества минеральных компонентов в единице объёма кости. У пациентов с патологией соединительной ткани при исследовании эмали зубов были обнаружены гипоминерализованная структура кристаллической решетки гидроксиапатитов, неправильная их пространственная ориентация, изменение залегания органического матрикса, нарушение формирования полноценной структуры эмали вследствие нарушения нормального взаимоотношения органического матрикса и минерального компонента, что не свойственно данному периоду созревания эмали зубов. Таким образом, у пациентов с патологией соединительной ткани были выявлены признаки нарушения минерализации и организации эмали зубов и костной ткани. Вывод. Использование атомно-силовой микроскопии позволяет изучать нативные клеточные культуры, в том числе твёрдые ткани зуба и костную ткань, что можно использовать в качестве основы для диагностики патологии соединительной ткани, а также для определения индивидуальных характеристик при идентификации личности.

Полный текст

Исследования клеточных структур микроскопическими методами на сегодняшний день являются основополагающими для диагностики патологических процессов, и главным методом остаётся оптическая микроскопия [1, 4, 5]. Несмотря на то, что технология изготовления микропрепаратов костной ткани и твёрдых тканей зубов требует длительного периода фиксации и декальцинации, традиционное гистологическое исследование остаётся чуть ли не единственным способом оценки патологических изменений, даже учитывая некоторые неизбежные негативные эффекты (набухание коллагеновых структур, микроразрушения кристаллической решетки гидроксиапатитов) [2, 3, 9]. Помимо рутинных методов микроскопии, для изучения ультраструктур клетки и клеточных мембран в настоящее время используют электронную микроскопию и сканирующую, зондовую микроскопию. Метод электронной микроскопии известен давно, в то время как методы сканирующей микроскопии развиваются на протяжении не более двух десятилетий. Атомно-силовую микроскопию (АСМ) пока чрезвычайно редко применяют для исследования гистологических препаратов: стандартные способы подготовки образцов для АСМ позволяют исследовать поверхность образца, но не его внутреннюю структуру [4, 6, 10]. Сканирующая туннельная микроскопия и АСМ - наиболее перспективные представители сканирующей зондовой микроскопии, причём они не требуют обязательной электрической проводимости исследуемых образцов, то есть образцы не нуждаются в предварительной обработке [3, 7, 8]. Целью работы было изучение возможности применения АСМ для морфологической диагностики патологии соединительной ткани по твёрдым тканям зубов и костной ткани. Для исследования на базе Омского государственного технического университета (кафедра оборудования и технологии сварочного производства) использовали полировально-шлифовальный станок «Нейрис», шлифовальные круги «Hermes» и полировальные круги с алмазной суспензией «Akasel». Образцы изучали на оптическом микроскопе «Olympus jx 41» с 1000-кратным увеличением, оценивали микроскопическое строение костной ткани и эмали зубов нижней челюсти. Ультраструктурное строение образцов изучали на базе Омского государственного университета (кафедра прикладной и медицинской физики) с использованием сканирующего зондового микроскопа «Solver Pro» (NT-MPT, Россия). Анализ АСМ-изображения осуществляли с использованием программного модуля обработки изображения «Image Analysis NT-VDT». В исследовании был использован материал 57 пациентов в возрасте от 20 до 40 лет (49 мужчин и 8 женщин), у которых после удара тупым твёрдым предметом (при бытовых, дорожно-транспортных травмах) в области угла нижней челюсти по клиническим показаниям был удалён 8-й зуб из линии перелома. По результатам анкетирования и общеклинического обследования (по диагностическому алгоритму Нечаевой Г.И. и Яковлева В.М., с диагностическим коэффициентом выше порога «+17») было сформировано две группы пациентов: основная группа пациентов - с дисплазией соединительной ткани (30 человек, из них 25 мужчин и 5 женщин), контрольная группа - без дисплазии соединительной ткани (27 человек, из них 23 мужского пола и 4 женского). Морфологическое исследование выполнено на 57 зубах, которые были консервированы после удаления (в нейтральном 10% растворе формалина). По разработанной методике подготовки образцов для 8-го зуба нижней челюсти (зуб 38 по двузначной нумерации) были подготовлены шлифы путём обработки поверхности медиального щёчного бугра с помощью шлифовальных, полировальных кругов и травления ортофосфорной кислотой марки «Evicrol». Полученные образцы зубов помещали в поле зрения оптического микроскопа с последующей АСМ. В результате были получены цифровые снимки образцов зубов, по которым осуществляли анализ степени упаковки, формы и размера эмалевых призм, размера межпризменных промежутков и их высоты, размера оболочки эмалевых призм у группы контроля и пациентов с патологией соединительной ткани. Морфологическое исследование 57 костных объектов (нижняя челюсть) было выполнено с применением описанной выше методики. Плотное вещество состояло из тонких костных пластинок, границы которых на поперечных шлифах кости выступали весьма чётко, так как полости костных пластинок в плотном костном веществе располагались, как правило, между соседними пластинками. Местами костные пластинки соприкасались друг с другом, местами же между ними располагались вставочные пластинки. По качественным характеристикам эмалевых призм зуба у людей без патологии соединительной ткани было отмечено постоянство структуры в виде упорядоченных шестигранных и даже семигранных с аркообразными формами эмалевых призм. В группе с патологией соединительной ткани призмы были расположены хаотично, имели и пятигранную, и шестигранную структуру, отличались полиморфизмом и напоминали различные геометрические фигуры. При зондовой микроскопии эмали зубов нижней челюсти у пациентов с патологией соединительной ткани эмалевые призмы отличались меньшими размерами как в горизонтальной, так и в вертикальной плоскости. Также было выявлено уменьшение количества эмалевых призм на единицу объёма, что свидетельствует о менее плотной их упаковке. Достоверное увеличение расстояния между эмалевыми призмами, увеличение высоты межпризменных промежутков у пациентов основной группы свидетельствует об увеличении общей доли органического вещества в полностью прорезавшихся зубах. Величина оболочки эмалевой призмы у пациентов с патологией соединительной ткани отличалась большими размерами (табл. 1). При зондовой микроскопии костной ткани нижней челюсти в группе контроля молекулы коллагена не были связаны между собой «конец в конец», между ними присутствовали промежутки размером 35-40 нм. Предполагают, что в костной ткани эти промежутки играют роль центров минерализации, где откладываются кристаллы фосфата кальция. При АСМ фиксированные и контрастированные фибриллы коллагена выглядели поперечно исчерченными с периодом 67 нм (одна тёмная и одна светлая полоски) и диаметром в среднем 100 нм. Считают, что такое строение максимально повышает сопротивление ткани растягивающим нагрузкам. При этом у пациентов с патологией соединительной ткани длина и поперечник коллагеновых волокон значительно варьировали с увеличением промежутка между волокнами до 98 нм (в среднем 84,7±14,2 нм) и уменьшением поперечного размера волокон до 40 нм (в среднем 56,0±17,4 нм). При сопоставлении размеров минеральных пластин между коллагеновыми волокнами в костной ткани нижней челюсти у пациентов с патологией соединительной ткани и в группе сравнения статистически значимой разницы не выявлено (табл. 2). При оценке костной ткани основным различием между группой контроля и пациентами с патологией соединительной ткани было наличие пустот во втором случае, что сопровождалось изменением структуры залегания минеральных элементов кости, нарушением формирования костных пластинок, а также изменением количества минеральных компонентов в единице объёма кости. У пациентов с патологией соединительной ткани при исследовании эмали зубов выявлены гипоминерализованная структура кристаллической решетки гидроксиапатитов, неправильная их пространственная ориентация, изменение залегания органического матрикса, нарушение формирования полноценной структуры эмали вследствие нарушения нормального взаимоотношения органического матрикса и минерального компонента, что не свойственно данному периоду созревания эмали зубов. ВЫВОДЫ 1. По результатам исследования ультраструктуры и минерального состава можно говорить о нарушении минерализации и организации эмали зубов и костной ткани у пациентов с признаками патологии соединительной ткани. Это обусловлено недостаточно плотной упаковкой эмалевых призм, костных пластинок в единице объёма, их хаотичным расположением, недостаточно организованным и минерализованным органическим матриксом. 2. Достоинство атомно-силовой микроскопии - возможность изучения микрорельефа поверхности без предварительной обработки, деформирующей клеточные структуры. Исследования срезов при атомно-силовой микроскопии дают возможность получать изображения, сопоставимые с малым увеличением (менее ~25 000) просвечивающего электронного микроскопа. Дальнейшее развитие методик позволит использовать этот метод в качестве основного способа исследования тканей, применяемого в сочетании с другими видами микроскопии. 3. Полученные результаты демонстрируют возможность использования атомно-силовой микроскопии для изучения нативных клеточных культур, в том числе твёрдых тканей зуба и костной ткани, как в судебно-медицинской, так и в стоматологической практике, с возможностью определения индивидуальных характеристик. В клинике возможны диагностика патологических процессов и контроль качества лечения пациентов с патологией соединительной ткани с помощью атомно-силовой микроскопии. Вопрос об использовании этого метода для исследования особенностей костной ткани и твёрдых тканей зубов при диспластических процессах, таких как синдром Педжета, синдром Марфана, синдром Элерса-Данло и других, заслуживает дальнейшего изучения. Таблица 1 Количественные характеристики минерального матрикса эмали зубов у обследуемых пациентов (зондовая микроскопия) Группы пациентов Размер эмалевых призм в горизонтальной плоскости (dх), мкм Размер эмалевых призм в вертикальной плоскости (dу), мкм Количество эмалевых призм в единице объёма (10×10 мкм) Расстояние между эмалевыми призмами, мкм Величина оболочки призмы, мкм Высота межпризменного промежутка, мкм Пациенты без ДСТ (n=27) 6,3±0,2 6,25±0,3 6,2±0,2 0,32±0,02 0,19±0,03 19,8±2,5 Пациенты с ДСТ (n=30) 5,5±0,3* 5,4±0,1* 5,2±0,1* 1,5±0,1* 0,8±0,2* 84,5±2,9* Примечание: *коэффициент статистической значимости различий между основной (пациенты с дисплазией соединительной ткани - ДСТ) и контрольной группами р <0,05. Таблица 2 Количественные характеристики минерального матрикса костной ткани у обследуемых пациентов (зондовая микроскопия) Группы пациентов Размер коллагеновых волокон в горизонтальной плоскости (dх), нм Размер коллагеновых волокон в вертикальной плоскости (dу), нм Размер минеральных пластин в горизонтальной плоскости (dх), нм Размер минеральных пластин в вертикальной плоскости (dу), нм Пациенты без ДСТ (n=27) 61,4±8,5 98,7±23,3 61,4±9,5 5,4±1,3 Пациенты с ДСТ (n=30) 84,7±14,2* 56,0±17,4* 74,7±9,4* 9,0±2,3* Примечание: *коэффициент статистической значимости различий между основной (пациенты с дисплазией соединительной ткани - ДСТ) и контрольной группами р <0,05.
×

Об авторах

Сергей Николаевич Московский

Омская государственная медицинская академия

Email: moscow-55@mail.ru

Андрей Сергеевич Коршунов

Омская государственная медицинская академия

Игорь Леонидович Шестель

Омская государственная медицинская академия

Владимир Павлович Конев

Омская государственная медицинская академия

Михаил Александрович Хамов

Омская государственная медицинская академия

Сергей Олегович Марковский

Городская клиническая больница №11, г. Омск

Список литературы

  1. Cadet E.R., Gafni R.I., McCarthy E.F. et al. Mechanisms responsible for longitudinal growth of the cortex: coalescence of trabecular bone into cortical bone // J. Bone Jt. Surg. Am. - 2003. - Vol. 85. - Р. 39-48.
  2. Chiego D.J. The early distribution and possible role of nerves during odontogenesis // Int. J. Develop. Biol. - 1995. - Vol. 39, N 1. - P. 191-194.
  3. Gao H.J., Ji B.H., Jager I.L. et al. Materials become insensitive to flaws at nanoscale: lessons from nature // PNAS. - 2003. - Vol. 100. - Р. 597-600.
  4. Gutsmann T., Fantner G.E., Venturoni M. et al. Evidence that collagen fibrils in tendons are inhomogeneously structured in a tubelike manner // Biophys. J. - 2003. - Vol. 84. - P. 93-103.
  5. Katz E.P., Li S. Structure and function of collagen fibrils // J. Mol. Biol. - 1973. - Vol. 80. - P. 1- 15.
  6. Lees S. Mineralization of type I collagen // Biophys. J. - 2003. - Vol. 85, N 20. - P. 4-7.
  7. Ng L., Grodzinsky A.J., Patwari P. et al. Individual cartilage aggrecan macromolecules and their constituent glycosaminoglycans visualized via atomic force microscopy // J. Struct. Biol. - 2003. - Vol. 143, N 2. - Р. 42-57.
  8. Roschger P., Gupta H.S., Berzanovich A. et al. Constant mineralization density distribution in cancellous human bone // Bone. - 2003. - Vol. 32, N 3. - Р. 16-23.
  9. Rubin M.A., Jasiuk L., Taylor J. et al. TEM analysis of the nanostructure of normal and osteoporotic human trabecular bone // Bone. - 2003. - Vol. 33, N 3. - Р. 270-282.
  10. Venturoni M., Gutsmann T., Fantner G.E. et al. Investigations into the polymorphism of rat tail tendon fibrils using atomic force microscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2003. - Vol. 30, N 50. - Р. 8-13.
  11. Tong W., Glimcher M.J., Katz J.L. et al. Size and shape of mineralites in young bovine bone measured by atomic force microscopy // Calcif. Tissue Int. - 2003. - Vol. 75, N 59. - Р. 2-8.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© 2012 Московский С.Н., Коршунов А.С., Шестель И.Л., Конев В.П., Хамов М.А., Марковский С.О.

Creative Commons License

Эта статья доступна по лицензии
Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ЭЛ № ФС 77 - 75008 от 01.02.2019.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах