Epidermis of amputated limbs in patients with diabetes mellitus - immunohistochemical study

Full Text

Лечение сахарного диабета (СД) - одна из социально значимых задач медицинской науки и здравоохранения в целом. Тяжёлые метаболические нарушения, лежащие в основе патогенеза СД, приводят к патологическим изменениям почти во всех органах и тканях организма, в том числе и в коже. Этиология кожных поражений при СД, безусловно, связана с нарушением углеводного обмена и накоплением соответствующих продуктов нарушенного метаболизма, что приводит к структурным изменениям в дерме и эпидермисе [5]. Осложнения этого грозного заболевания приводят к ранней инвалидизации и летальности, причём повсеместно отмечают тенденцию к росту количества больных с синдромом диабетической стопы (СДС), доля которых составляет в России 4-10% больных СД [1, 2, 4]. Визуальные границы повреждения тканей в области стопы при СД, как правило, не соответствуют истинному распространению патологического процесса, достаточно часто существует клинически скрытый участок некроза, поэтому неадекватный объём оперативного вмешательства часто не даёт ожидаемого результата. У больных с СДС часто обнаруживают реактивный отёк голени на поражённой конечности, захватывающий эпидермис и дерму. Отёк мягких тканей голени у таких больных приводит к региональному нарушению кровоснабжения, вызывает явления интоксикации и обусловливает риск прогрессирования воспалительного и некротического процессов, что приводит к необходимости повторных оперативных вмешательств. Следствием становятся высокие ампутации и значительная летальность [7]. Один из главных факторов в развитии ангиопатий при СД - гипергликемия. Накопление конечных продуктов гликозилирования в тканях сосудов, окислительный стресс, нарушение реологии крови (изменение вязкости, повышение проницаемости сосудистой стенки, нарушения гемодинамики и осмотического давления крови) приводят к разнообразным поражениям кожи [8]. В течение последних двух десятилетий накоплен большой клинический и научный опыт, позволивший с новых позиций осветить механизмы СДС и проводить патогенетически обоснованное лечение и профилактику этой патологии. Наиболее важный аспект, на который обращено внимание исследователей, - поражение микроциркуляторного русла кожи вследствие диабетической микроангиопатии [10]. Работ, посвящённых морфологическим изменениям кожи стопы при СД, сравнительно немного, в ряде других исследований изучали кожу живота, бедра, предплечья [12]. Вместе с тем при сравнении полученных данных оказывается, что при СД кожа различных областей претерпевает в целом сходные изменения, которые заключаются в повреждении базальной мембраны микроциркуляторного русла и гибели эндотелиальных клеток. При СДС избыточное давление может приводить к некрозу кожи в определённых участках (с гиперкератозом), однако эти изменения при всей тяжести поражения вызваны локальными причинами, и их следует отличать от диффузного поражения, вызванного хронической гипергликемией [9]. Хотя факт нарушения регуляции тонуса микрососудов при СД не вызывает сомнений, несмотря на многочисленные данные о корреляции между морфологическими изменениями эпидермиса и дермы и нарушениями функций капилляров, способность микроангиопатии самостоятельно приводить к некрозу тканей стопы не доказана [13]. В связи с тем, что морфологическая структура кожи при СД может отражать аналогичные изменения различных свойств и в других нижележащих тканях, а также ввиду относительной простоты биопсии кожи, перспективно её использование в научных и клинических целях для выявления маркёров осложнений СД, угрожающих внутренним органам [9]. Фундаментальными процессами, определяющими постоянство структурно-функциональной организации ткани, являются клеточное обновление, дифференцировка и клеточная гибель [6]. В качестве индикатора, отражающего специфические особенности регуляторных систем в коже при изменении её регенераторной способности, можно использовать показатели экспрессии маркёра пролиферации - ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA - от англ. Proliferating Cell Nuclear Antigen) [3, 11]. Для оценки устойчивости клеток эпидермиса к апоптозу при нарушенной микроциркуляции кожи в условиях диабетической ангиопатии приемлемо иммуногистохимическое исследование экспрессии белка Bcl-2. Вероятность вступления в апоптоз клеток, экспрессирующих Bcl-2, минимальна. В то же время маркёр терминальной дифференцировки кератиноцитов цитокератин 1 позволяет судить о зрелости клеток: в эпидермисе экспрессия отсутствует в базальном слое, появляется в первых надбазальных слоях и увеличивается к гранулированному слою, что в свою очередь связано с созреванием кератиноцитов. Установлено, что у людей выраженное снижение пролиферативной активности клеток базального слоя эпидермиса нормальной кожи происходит лишь после 80 лет. Это обусловлено существенным снижением регенераторных возможностей организма в этом возрасте. Цель настоящего исследования - оценка морфологических изменений кожи в различных зонах ампутированной нижней конечности больных СД. В настоящем исследовании была определена группа из 6 больных с СДС в возрасте от 62 до 83 лет. Все пациенты страдали СД 2-го типа, длительность заболевания варьировала от 10 до 17 лет. Очаги поражения локализовались на дистальных участках нижних конечностей, в области голени. Все пациенты консультированы сосудистым хирургом, проведена ультразвуковая допплерография сосудов нижних конечностей. С добровольного согласия пациентов у них был произведён забор биоптатов кожи с ампутированных конечностей в ходе операции по поводу диабетической гангрены. Забор биоптатов производили с трёх зон: зоны ампутации, средней области между поражённой гангреной частью конечности и зоной операционного поля, с области гангрены (рис. 1). Контрольную группу составили 6 человек (3 женщины и 3 мужчины) в возрасте от 60 до 80 лет, у которых фрагменты кожи были получены при хирургических операциях из аналогичных зон в травматологических отделениях. Иммуногистохимические исследования образцов кожи осуществляли на парафиновых срезах по стандартной методике с применением проявляющей системы «Dako», Denmark, 3,3’-диаминобензидина. Для иммунофенотипирования использовали иммуногистохимическую панель из поликлональных антител к Bcl-2 (Santa Cruz), PCNA (Santa Cruz), моноклональных антител к цитокератину 1 (Novocastra). Исследование полученных препаратов кожи проводили с использованием светового микроскопа Leica DM1000. Все полученные результаты документировали, фотографируя цифровой камерой Leica DFC290. Иммуногистохимические препараты оценивали по проценту окрашенных ядер, экспрессировавших PCNA на 300 клеток, при просмотре трёх полей зрения при увеличении объектива ×20. Индекс пролиферации рассчитывали для всей толщи эпидермиса. Изображения срезов кожи, окрашенных с антителами к Bcl-2, подвергали анализу с помощью программного модуля «Colour Deconvolution» графического пакета ImageJ по методике, описанной Ruifrok и Johnston [14]. Данный программный модуль позволяет на основании встроенных алгоритмов произвести субстракцию цветов и выделить окрашивание, обусловленное окрашиванием только 3,3’-диаминобензидином (без влияния гематоксилина). Интенсивность окрашивания 3,3’-диаминобензидином далее рассчитывали с помощью анализа пакетом ImageJ и выражали в виде «средней интенсивности серого пикселя» (интегральная величина, суммирующая яркость окраски по трём основным цветам - красному, зелёному и синему - на основании формулы V=0,299R+0,587G+0,114B, где V - средняя интенсивность среднего пикселя, R, G и B - соответственно яркость свечения красного, зелёного и синего пикселей изображения). Обработку данных осуществляли с помощью программ Origin и Excel. Для статистической обработки полученных данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента. При иммуногистохимическом исследовании с использованием антител к PCNA отмечено снижение уровня пролиферации клеток в эпидермисе кожи ампутированной конечности больных по сравнению с контролем (рис. 2). В образцах кожи контрольной группы иммунопозитивные клетки локализовались как в базальных, так и в супрабазальных слоях эпидермиса. В коже области гангрены иммунопозитивные клетки к маркёру пролиферации присутствовали преимущественно в базальных слоях эпидермиса. В коже зоны операционного поля процентное содержание иммунопозитивных к PCNA клеток превышало показатели, полученные не только с области, поражённой гангреной, но и с кожи контрольной группы (рис. 3). Антиапоптотическую способность в эпидермисе у больных обеих групп определяли по показателю «средней интенсивности серого пикселя» (рис. 4). В образцах кожи, взятых с области зоны ампутации нижней конечности, средняя интенсивность серого пикселя была ниже показателя, полученного с образцов ткани кожи контрольной группы. При этом в образцах кожи, забор которых производили с поражённой гангреной области, отмечено значительное снижение экспрессии белка Bcl-2 по сравнению с показателями кожи как контрольной группы, так и зоны ампутации (рис. 5). Так, в образцах кожи, взятых с области зоны ампутации (n=6), средняя интенсивность серого пикселя достигала 83,76±6,5, что незначительно ниже показателя в контрольной группе (n=6) - 89,69±3,4, в то время как в поражённой гангреной области (n=6) средняя интенсивность серого пикселя составила 57,74±4,3 (p <0,005). Выявлено повышение уровня средней интенсивности серого пикселя до 98,36±8,8 (n=6, p <0,005) в зоне, занимающей среднюю область между поражённой гангреной частью конечности и зоной операционного поля. Анализ срезов кожи больных с СДС, окрашенных с антителами к Bcl-2, позволяет судить о снижении устойчивости к апоптозу тканей, подвергшихся деструктивным изменениям в условиях ангиопатии при СД. Минимальная толщина эпидермиса пациентов с диабетической гангреной нижних конечностей в коже сформированной культи составила 54,4±8 мкм (n=6, p <0,005), максимальная - 148,2±13 мкм (n=6, p <0,005); минимальная толщина эпидермиса в образцах кожи, забор которых производили с поражённой гангреной области, составила 139,2±23 мкм (n=6, p <0,005), а максимальная - 157,3±18,6 мкм (n=6, p <0,005). Толщина эпидермиса людей, не страдающих СД, составила от 35 до 92 мкм. Экспрессия маркёра терминальной дифференцировки кератиноцитов в коже контрольной группы была выражена во всех супрабазальных слоях эпидермиса, а при СД зарегистрирована негативная иммуногистохимическая реакция не только в базальном слое кератиноцитов, но и в вышележащих слоях эпидермиса (рис. 6). ВЫВОДЫ 1. Иммуногистохимическое изучение кожи ампутированной конечности больных сахарным диабетом показало, что в условиях ангиопатии у них происходит снижение пролиферативного потенциала эпидермиса, вследствие чего нарушается регенерация кожи. Так, в коже в зоне операционного поля процентное содержание иммунопозитивных на ядерный антиген пролиферирующих клеток составило 82,08±6,5%, в области гангрены - 58,74±4,8% (p <0,005), а в контрольной группе - 77,41±3% (p <0,005). 2. Тенденция к снижению экспрессии белка Bcl-2 кератиноцитами в коже ампутированной конечности может свидетельствовать о снижении устойчивости к апоптозу в эпидермисе в условиях диабетической ангиопатии. 3. Морфологический анализ кожи ампутированной конечности больных сахарным диабетом показал, что в условиях диабетической ангиопатии происходит утолщение эпидермиса. При этом кератиноциты супрабазальных слоёв имеют структурно-функциональные нарушения, о чём свидетельствует экспрессия цитокератина 1, что также вносит свой вклад в нарушение процессов регенерации. 4. Таким образом, на фоне сахарного диабета происходят снижение пролиферативной активности клеток эпидермиса, ослабление устойчивости клеток эпидермиса к апоптозу, снижение степени дифференцировки клеток супрабазальных слоёв эпидермиса по сравнению с контрольной группой. Проведённое нами исследование позволяет заключить, что суммарным эффектом вышеописанных изменений стеновится гибель кожи как органа. Рис. 1. Зоны забора материала. горш11.tif горш 2 а.tif Рис. 2. Эпидермис. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA): а - контрольная группа; б - при сахарном диабете. Иммунопероксидазная реакция (ув. об. 20, ок. 10). pис. 33_испр.tif горш 2 б.tif Рис. 3. Гистограмма распределения иммунопозитивных клеток в эпидермисе к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA). рис. 5_испр.tif горш 4 а.tif Рис. 4. Эпидермис. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к протеину Bcl-2 в кератиноцитах: а - здоровая кожа; б - кожа больного сахарным диабетом. Иммунопероксидазный метод (ув. об. 20, ок. 10). Рис. 5. Интенсивность иммуногистохимического окрашивания клеток эпидермиса антителами к маркёру Bcl-2. горш 6 а.tif Рис. 6. Эпидермис. Иммуногистохимическое окрашивание к цитокератину 1: а - контроль; б - при сахарном диабете. Иммунопероксидазная реакция (ув. об. 20, ок. 10).

About the authors

G N Gorshunova

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

R A Dzamukov

Republican Clinical Hospital, Kazan, Russia

V V Valiullin

Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Email: valvv@kcn.ru

References

Supplementary files