Состояние системы репарации повреждений ДНК в гастроинтестинальных стромальных опухолях и перспективы их терапии

Полный текст

Очевидно, что дефекты в системе поддержания целостности клеточного генома и устранения (репарации) возникающих повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) - один из ключевых факторов, способствующих опухолевой трансформации. В то же время наличие в опухолевых клетках дефектов в системе репарации повреждений ДНК может определять восприимчивость опухолевых клеток к воздействию химиопрепаратов и ионизирующего излучения. Следовательно, наличие дефектов в различных путях репарации повреждений ДНК справедливо можно считать одним из главных факторов, определяющих эффективность химио- и радиотерапии, а следовательно, и прогноз больных с онкологическими заболеваниями. Гастроинтестинальные стромальные опухоли (ГИСО, GIST - от. англ. gastrointestinal stromal tumors) представляют собой наиболее распространённую группу мезенхимальных (стромальных или соединительнотканных) опухолей желудочно-кишечного тракта, наиболее часто выявляемых в желудке (60-70%) и тонкой кишке (20-35%). Одно из ведущих звеньев патогенеза данного заболевания - активирующая мутация в гене тирозинкиназного рецептора с-Kit (CD117), результатом чего становится бесконтрольная стимуляция митотической активности и пролиферации опухолевых клеток [6, 10]. Обнаружение описанной выше мутации явилось основанием для внедрения в клиническую практику таргетного препарата - специфического ингибитора тирозинкиназной активности иматиниба (гливек), показавшего свою эффективность в качестве препарата адъювантной терапии более чем у 80% больных с ГИСО [4]. Однако, несмотря на высокую эффективность иматиниба, стабилизация опухолевого процесса наблюдается лишь у каждого третьего больного, длительные ремиссии бывают чрезвычайно редкими, а более чем у 50% пациентов развивается резистентность к иматинибу через 2 года после начала таргетной терапии [11]. Разработка и внедрение в практическую онкологию препаратов второй и третьей линии - сунитиниба (сутент) [9] и регорафениба (стривага) [3], ингибирующих активность сразу нескольких типов тирозинкиназ (в том числе, с-Kit), а также рецепторов тромбоцитарного фактора роста и эндотелия сосудов, лишь частично решила проблему развивающейся резистентности, которая обусловлена развитием вторичных мутаций, способствующих прогрессированию заболевания [5]. Следовательно, поиск новых лекарственных препаратов, обладающих потенциальной эффективностью в отношении ГИСО, - актуальная научно-практическая задача. Важно подчеркнуть, что существовавшая долгое время точка зрения о резистентности ГИСО к большинству химиопрепаратов в настоящее время подвергается пересмотру. Основанием для этого стали результаты некоторых, в том числе наших, клинико-экспериментальных исследований последних лет, показавших высокую эффективность некоторых химиопрепаратов (например, ингибиторов топоизомераз) как in vitro, так и in vivo [1, 8]. Учитывая тот факт, что подавляющее большинство современных химиопрепаратов вызывает гибель клеток по механизму апоптоза за счёт невозможности репарации повреждений ДНК, анализ состояния репаративной системы в клетках ГИСО (в том числе резистентных к таргетным препаратам) важен с научно-практической точки зрения и может способствовать оптимизации терапии данной группы больных. Высокая частота и многообразие возникающих в клетках повреждений ДНК обусловливает наличие нескольких путей их репарации. К ним относятся гомологичная рекомбинация (homologous recombination - НR) и негомологичное связывание концов ДНК (non-homologous end-joining - NHEJ), репарация неспаренных оснований (mismatch repair - MMR), эксцизионная репарация оснований (base excision repair - BER), эксцизионная репарация ошибочно спаренных нуклеотидов (nucleotide excision repair - NER), прямая обратная репарация (direct reversal repair - DRR). Целью настоящего исследования было комплексное изучение уровня экспрессии белков-репарантов всех вышеуказанных путей репарации повреждений ДНК в клетках ГИСО, чувствительных (GIST882 и Т-1) и резистентных (GIST430, 48 и 48В) к таргетным препаратам (иматинибу). В качестве группы сравнения были выбраны фибробласты человека и клеточные линии лейомиосарком (SK-LMS и SK-UT-1), традиционно считающихся резистентными к химиотерапии. Клетки культивировали в соответствующих культуральных средах с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и антибиотиков («Lonza», MD, USA). Уровень экспрессии белков-репарантов повреждений ДНК оценивали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих антител, например BRCA1, BRCA2 («Calbiochem», San Diego, CA), DNA-PK, Ku70, Ku80, MGMT, MSH2, MSH6, Topoisomerase II («Cell Signaling», Beverly, MA), Mre11, Rad50 («Novus», Littleton, CO), Rad17, Rad51, Topoisomerase IIβ («Santa Cruz»). В качестве контроля использовали антитела к актину («Sigma»). Результаты исследований обрабатывали с помощью программы «Statistica 6.0» («StatSoft Inc.», США), для оценки статистической значимости различий изучаемых выборок использовали t-критерий Стьюдента. В результате проведённых исследований было выявлено снижение уровня экспрессии белка BRCA1 практически во всех исследованных клеточных линиях ГИСО, что свидетельствовало о возможных нарушениях в системе гомологичной рекомбинации, определяющей эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК, являющихся одним из наиболее опасных повреждений ДНК. Интересно, что в клетках ГИСО со сниженной экспрессией BRCA1 отмечалось компенсаторное увеличение уровня экспрессии рекомбиназы Rad51, взаимодействующей, как известно, с белками BRCA1 и 2. Уровень экспрессии всех остальных белков, участвующих в процессах гомологичной рекомбинации и негомологичного связывания концов ДНК (RAD17, RAD50, RAD51, MRE11, DNA-PK, KU70, KU80), не различался между клетками ГИСО и фибробластами, а также клетками лейомиосарком. Во всех клеточных линиях ГИСО нами было выявлено значительное увеличение уровня экспрессии ДНК-полимеразы b и XRCC1, участвующих в процессах эксцизионной репарации оснований (BER). В то же время уровень экспрессии ферментов ERCC1 и TFIIH, участвующих в вырезании повреждённых нуклеотидов (NER), варьировал между различными линиями ГИСО и не отличался от контроля (фибробласты) и лейомиосарком. Уровень экспрессии белков, участвующих в репарации ДНК путём вырезания ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR), варьировал между различными линиями ГИСО (рис. 1). Примечательно, что уровень экспрессии MSH6 был повышен практически во всех линиях ГИСО (за исключением GIST430), в то время как в клетках лейомиосарком он был сниженным. Данный факт представляет безусловный интерес, так как процесс вырезания ошибочно спаренных нуклеотидов традиционно считают одним из основных механизмов, препятствующих опухолевой трансформации клетки. В то же время обнаруженное нами в клетках ГИСО значительное повышение уровня экспрессии белков, участвующих в ММR, может указывать на обилие генетических дефектов данного характера и попытки ГИСО «справиться» с данными генетическими нарушениями. Наиболее значимым изменением уровня экспрессии белков-репарантов было обнаруженное нами увеличение уровня экспрессии в клетках ГИСО О6-метилгуанин ДНК-метилтрансферазы (MGMT), служащей ключевым ферментом процесса репарации повреждённой ДНК за счёт восстановления О6-алкилированных её повреждений. Данный феномен выявлялся во всех без исключения клеточных линиях ГИСО и не был типичен для нормальных фибробластов и лейомиосарком. Учитывая тот факт, что повышение уровня экспрессии MGMT в опухолевых клетках различного происхождения коррелирует с их устойчивостью к алкилирующим соединениям, можно предположить, что одним из молекулярных механизмов устойчивости ГИСО к таким препаратам будет повышение уровня экспрессии данного фермента. Интересно, что у большинства клеточных линий ГИСО было отмечено повышение уровня экспрессии топоизомераз IIα или β, что позволяет предположить их повышенную чувствительность к ингибиторам топоизомераз II типа. К примеру, было показано, что уровень экспрессии топоизомераз в опухолевых клетках коррелирует с их чувствительностью к ингибиторам топоизомераз II типа [7]. Низкий уровень экспрессии топоизомеразы II типа в опухолях коррелирует с их резистентностью к соответствующим ингибиторам, в то время как повышение уровня данного фермента в опухолях обусловливает их высокую чувствительность к данному классу противоопухолевых препаратов [2]. Более того, было установлено, что низкий уровень экспрессии топоизомеразы I типа в злокачественных новообразованиях также коррелирует с их повышенной чувствительностью к ингибиторам топоизомеразы II типа [2]. ВЫВОДЫ 1. Проведённые исследования выявили существенные изменения в уровне экспрессии ряда белков, участвующих в репарации повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), что позволяет их рассматривать в качестве перспективных средств терапии пациентов с гастроинтестинальными стромальными опухолями, особенно на фоне резистентности к таргетным препаратам. 2. Изучение молекулярных механизмов репарации повреждений ДНК - актуальная задача как с точки зрения изучения молекулярных механизмов, направленных на поддержание целостности клеточного генома, так и с точки зрения понимания механизмов чувствительности/резистентности злокачественных новообразований и определения наиболее эффективных схем нехирургической терапии пациентов с гастроинтестинальными стромальными опухолями. Работа финансировалась грантом Российского Научного Фонда (РНФ) № 14-15-00342 Рис. 1. Уровень экспрессии белков, участвующих в различных сигнальных путях репарации повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), а также актина (контроль) в фибробластах человека, клетках иматиниб-чувствительных и резистентных линий гастроинтестинальных стромальных опухолей, а также двух линий лейомиосарком (описание клеточных линий и репаративных путей ДНК см. выше).

Об авторах

Сергей Васильевич Бойчук

Казанский государственный медицинский университет; Раковый центр университета г. Питтсбурга, США

Email: boichuksergei@mail.ru

Булат Рашитович Рамазанов

Казанский государственный медицинский университет

Айгуль Рафиковна Галембикова

Казанский государственный медицинский университет

Оскар Рустемович Галеев

Казанский государственный медицинский университет

Ильшат Ганиевич Мустафин

Казанский государственный медицинский университет

Аннет Дусинг

Раковый центр университета г. Питтсбурга, США

Список литературы

Дополнительные файлы