DNA repair profile in gastrointestinal stromal tumors (gists) - novel perspectives for therapy
- Authors: Boichuk SV1,2, Ramazanov BR1, Galembikova AR1, Galeev OR1, Mustafin IG1, Duensing A2
-
Affiliations:
- Kazan State Medical University, Kazan, Russia
- University of Pittsburgh Cancer Institute, Pittsburgh, USA
- Issue: Vol 95, No 6 (2014)
- Pages: 888-891
- Section: Experimental medicine
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/1999
- DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ1999
- ID: 1999
Cite item
Full Text
Abstract
Keywords
Full Text
Очевидно, что дефекты в системе поддержания целостности клеточного генома и устранения (репарации) возникающих повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) - один из ключевых факторов, способствующих опухолевой трансформации. В то же время наличие в опухолевых клетках дефектов в системе репарации повреждений ДНК может определять восприимчивость опухолевых клеток к воздействию химиопрепаратов и ионизирующего излучения. Следовательно, наличие дефектов в различных путях репарации повреждений ДНК справедливо можно считать одним из главных факторов, определяющих эффективность химио- и радиотерапии, а следовательно, и прогноз больных с онкологическими заболеваниями. Гастроинтестинальные стромальные опухоли (ГИСО, GIST - от. англ. gastrointestinal stromal tumors) представляют собой наиболее распространённую группу мезенхимальных (стромальных или соединительнотканных) опухолей желудочно-кишечного тракта, наиболее часто выявляемых в желудке (60-70%) и тонкой кишке (20-35%). Одно из ведущих звеньев патогенеза данного заболевания - активирующая мутация в гене тирозинкиназного рецептора с-Kit (CD117), результатом чего становится бесконтрольная стимуляция митотической активности и пролиферации опухолевых клеток [6, 10]. Обнаружение описанной выше мутации явилось основанием для внедрения в клиническую практику таргетного препарата - специфического ингибитора тирозинкиназной активности иматиниба (гливек), показавшего свою эффективность в качестве препарата адъювантной терапии более чем у 80% больных с ГИСО [4]. Однако, несмотря на высокую эффективность иматиниба, стабилизация опухолевого процесса наблюдается лишь у каждого третьего больного, длительные ремиссии бывают чрезвычайно редкими, а более чем у 50% пациентов развивается резистентность к иматинибу через 2 года после начала таргетной терапии [11]. Разработка и внедрение в практическую онкологию препаратов второй и третьей линии - сунитиниба (сутент) [9] и регорафениба (стривага) [3], ингибирующих активность сразу нескольких типов тирозинкиназ (в том числе, с-Kit), а также рецепторов тромбоцитарного фактора роста и эндотелия сосудов, лишь частично решила проблему развивающейся резистентности, которая обусловлена развитием вторичных мутаций, способствующих прогрессированию заболевания [5]. Следовательно, поиск новых лекарственных препаратов, обладающих потенциальной эффективностью в отношении ГИСО, - актуальная научно-практическая задача. Важно подчеркнуть, что существовавшая долгое время точка зрения о резистентности ГИСО к большинству химиопрепаратов в настоящее время подвергается пересмотру. Основанием для этого стали результаты некоторых, в том числе наших, клинико-экспериментальных исследований последних лет, показавших высокую эффективность некоторых химиопрепаратов (например, ингибиторов топоизомераз) как in vitro, так и in vivo [1, 8]. Учитывая тот факт, что подавляющее большинство современных химиопрепаратов вызывает гибель клеток по механизму апоптоза за счёт невозможности репарации повреждений ДНК, анализ состояния репаративной системы в клетках ГИСО (в том числе резистентных к таргетным препаратам) важен с научно-практической точки зрения и может способствовать оптимизации терапии данной группы больных. Высокая частота и многообразие возникающих в клетках повреждений ДНК обусловливает наличие нескольких путей их репарации. К ним относятся гомологичная рекомбинация (homologous recombination - НR) и негомологичное связывание концов ДНК (non-homologous end-joining - NHEJ), репарация неспаренных оснований (mismatch repair - MMR), эксцизионная репарация оснований (base excision repair - BER), эксцизионная репарация ошибочно спаренных нуклеотидов (nucleotide excision repair - NER), прямая обратная репарация (direct reversal repair - DRR). Целью настоящего исследования было комплексное изучение уровня экспрессии белков-репарантов всех вышеуказанных путей репарации повреждений ДНК в клетках ГИСО, чувствительных (GIST882 и Т-1) и резистентных (GIST430, 48 и 48В) к таргетным препаратам (иматинибу). В качестве группы сравнения были выбраны фибробласты человека и клеточные линии лейомиосарком (SK-LMS и SK-UT-1), традиционно считающихся резистентными к химиотерапии. Клетки культивировали в соответствующих культуральных средах с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и антибиотиков («Lonza», MD, USA). Уровень экспрессии белков-репарантов повреждений ДНК оценивали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих антител, например BRCA1, BRCA2 («Calbiochem», San Diego, CA), DNA-PK, Ku70, Ku80, MGMT, MSH2, MSH6, Topoisomerase II («Cell Signaling», Beverly, MA), Mre11, Rad50 («Novus», Littleton, CO), Rad17, Rad51, Topoisomerase IIβ («Santa Cruz»). В качестве контроля использовали антитела к актину («Sigma»). Результаты исследований обрабатывали с помощью программы «Statistica 6.0» («StatSoft Inc.», США), для оценки статистической значимости различий изучаемых выборок использовали t-критерий Стьюдента. В результате проведённых исследований было выявлено снижение уровня экспрессии белка BRCA1 практически во всех исследованных клеточных линиях ГИСО, что свидетельствовало о возможных нарушениях в системе гомологичной рекомбинации, определяющей эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК, являющихся одним из наиболее опасных повреждений ДНК. Интересно, что в клетках ГИСО со сниженной экспрессией BRCA1 отмечалось компенсаторное увеличение уровня экспрессии рекомбиназы Rad51, взаимодействующей, как известно, с белками BRCA1 и 2. Уровень экспрессии всех остальных белков, участвующих в процессах гомологичной рекомбинации и негомологичного связывания концов ДНК (RAD17, RAD50, RAD51, MRE11, DNA-PK, KU70, KU80), не различался между клетками ГИСО и фибробластами, а также клетками лейомиосарком. Во всех клеточных линиях ГИСО нами было выявлено значительное увеличение уровня экспрессии ДНК-полимеразы b и XRCC1, участвующих в процессах эксцизионной репарации оснований (BER). В то же время уровень экспрессии ферментов ERCC1 и TFIIH, участвующих в вырезании повреждённых нуклеотидов (NER), варьировал между различными линиями ГИСО и не отличался от контроля (фибробласты) и лейомиосарком. Уровень экспрессии белков, участвующих в репарации ДНК путём вырезания ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR), варьировал между различными линиями ГИСО (рис. 1). Примечательно, что уровень экспрессии MSH6 был повышен практически во всех линиях ГИСО (за исключением GIST430), в то время как в клетках лейомиосарком он был сниженным. Данный факт представляет безусловный интерес, так как процесс вырезания ошибочно спаренных нуклеотидов традиционно считают одним из основных механизмов, препятствующих опухолевой трансформации клетки. В то же время обнаруженное нами в клетках ГИСО значительное повышение уровня экспрессии белков, участвующих в ММR, может указывать на обилие генетических дефектов данного характера и попытки ГИСО «справиться» с данными генетическими нарушениями. Наиболее значимым изменением уровня экспрессии белков-репарантов было обнаруженное нами увеличение уровня экспрессии в клетках ГИСО О6-метилгуанин ДНК-метилтрансферазы (MGMT), служащей ключевым ферментом процесса репарации повреждённой ДНК за счёт восстановления О6-алкилированных её повреждений. Данный феномен выявлялся во всех без исключения клеточных линиях ГИСО и не был типичен для нормальных фибробластов и лейомиосарком. Учитывая тот факт, что повышение уровня экспрессии MGMT в опухолевых клетках различного происхождения коррелирует с их устойчивостью к алкилирующим соединениям, можно предположить, что одним из молекулярных механизмов устойчивости ГИСО к таким препаратам будет повышение уровня экспрессии данного фермента. Интересно, что у большинства клеточных линий ГИСО было отмечено повышение уровня экспрессии топоизомераз IIα или β, что позволяет предположить их повышенную чувствительность к ингибиторам топоизомераз II типа. К примеру, было показано, что уровень экспрессии топоизомераз в опухолевых клетках коррелирует с их чувствительностью к ингибиторам топоизомераз II типа [7]. Низкий уровень экспрессии топоизомеразы II типа в опухолях коррелирует с их резистентностью к соответствующим ингибиторам, в то время как повышение уровня данного фермента в опухолях обусловливает их высокую чувствительность к данному классу противоопухолевых препаратов [2]. Более того, было установлено, что низкий уровень экспрессии топоизомеразы I типа в злокачественных новообразованиях также коррелирует с их повышенной чувствительностью к ингибиторам топоизомеразы II типа [2]. ВЫВОДЫ 1. Проведённые исследования выявили существенные изменения в уровне экспрессии ряда белков, участвующих в репарации повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), что позволяет их рассматривать в качестве перспективных средств терапии пациентов с гастроинтестинальными стромальными опухолями, особенно на фоне резистентности к таргетным препаратам. 2. Изучение молекулярных механизмов репарации повреждений ДНК - актуальная задача как с точки зрения изучения молекулярных механизмов, направленных на поддержание целостности клеточного генома, так и с точки зрения понимания механизмов чувствительности/резистентности злокачественных новообразований и определения наиболее эффективных схем нехирургической терапии пациентов с гастроинтестинальными стромальными опухолями. Работа финансировалась грантом Российского Научного Фонда (РНФ) № 14-15-00342 Рис. 1. Уровень экспрессии белков, участвующих в различных сигнальных путях репарации повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), а также актина (контроль) в фибробластах человека, клетках иматиниб-чувствительных и резистентных линий гастроинтестинальных стромальных опухолей, а также двух линий лейомиосарком (описание клеточных линий и репаративных путей ДНК см. выше).About the authors
S V Boichuk
Kazan State Medical University, Kazan, Russia; University of Pittsburgh Cancer Institute, Pittsburgh, USA
Email: boichuksergei@mail.ru
B R Ramazanov
Kazan State Medical University, Kazan, Russia
A R Galembikova
Kazan State Medical University, Kazan, Russia
O R Galeev
Kazan State Medical University, Kazan, Russia
I G Mustafin
Kazan State Medical University, Kazan, Russia
A Duensing
University of Pittsburgh Cancer Institute, Pittsburgh, USA
References
- Boichuk S., Lee D.J., Mehalek K.R. et al. An unbiased compound screen identifies unexpected drug sensitivities and novel treatment options for gastrointestinal stromal tumors (GISTs) // Cancer Res. - 2014. - Vol. 74, N 4. - P. 1200-1213.
- Burgess D.J., Doles J., Zender L. et al. Topoisomerase levels determine chemotherapy response in vitro and in vivo // Proc. Nat. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 105. - P. 9053-9058.
- Demetri G.D., Reichardt P., Kang Y.-K. et al. GRID study investigators, efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial // Lancet. - 2013. - Vol. 381. - P. 295-302.
- Demetri G.D., von Mehren M., Blanke C.D. et al. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors // N. Engl. J. Med. - 2002. - Vol. 347. - P. 472-480.
- Gramza A.W., Corless C.L., Heinrich M.C. Resistance to tyrosine kinase inhibitors in gastrointestinal stromal tumors // Clin. Cancer Res. - 2009. - Vol. 15. - P. 7510-7518.
- Hirota S., Isozaki K., Moriyama Y. et al. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors // Science. - 1998. - Vol. 279. - P. 577-580.
- Kellner U., Sehested M., Jensen P.B. et al. Culprit and victim - DNA topoisomerase II // Lancet Oncol. - 2002. - Vol. 3. - P. 235-243.
- Maurel J., Martins A.S., Poveda A. et al. Imatinib plus low-dose doxorubicin in patients with advanced gastrointestinal stromal tumors refractory to high-dose imatinib // Cancer. - 2010. - Vol. 116. - P. 3692-3701.
- Rock E.P., Goodman V., Jiang J.X. et al. Food and Drug Administration drug approval summary: Sunitinib malate for the treatment of gastrointestinal stromal tumor and advanced renal cell carcinoma // Oncologist. - 2007. - Vol. 12. - P. 107-113.
- Rubin B.P., Singer S., Tsao C. et al. KIT activation is a ubiquitous feature of gastrointestinal stromal tumors // Cancer Res. - 2001. - Vol. 61. - P. 8118-8121.
- Verweij J., Casali P.G., Zalcberg J. et al. Progression-free survival in gastrointestinal stromal tumours with high-dose imatinib: randomised trial // Lancet. - 2004. - Vol. 364. - P. 1127-1134.