Влияние рецепторного антагониста интерлейкина-1 на динамику показателей системы глутатиона, энергетического метаболизма и окислительной модификации белков при экспериментальной гипергликемии

Полный текст

В последние годы глобальной медико-социальной проблемой стал сахарный диабет (СД), который входит в число семи главных причин смертности населения в большинстве стран мира и занимает третье место среди непосредственных причин смерти после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [4, 14]. Доказано, что эффективный контроль СД может свести к минимуму развитие многих связанных с ним осложнений, в том числе неврологических, которые и определяют продолжительность жизни больного и его работоспособность (энцефалопатии, дистальные невропатии, инсульт) [15]. Высокая частота осложнений СД обусловлена нарушениями тканевого метаболизма с масштабным повреждением микроциркуляторного русла органов. При этом на фоне типичных нарушений микроциркуляции происходит постишемическое повреждение ткани мозга - развивается энергетический дефицит, формируется лактат-ацидоз, происходят развитие оксидативного стресса и гибель клеток путём некроза или апоптоза [2]. По современным представлениям, характер иммунного ответа и особенности развития патофизиологических изменений при ишемических/гипоксических тканевых расстройствах зависят преимущественно от активируемой субпопуляции Т-лимфоцитов, синтеза ими цитокинов с формированием «цитокинового каскада» и соотношения про- и противовоспалительных цитокинов [6]. Следовательно, эффективным перспективным звеном в комплексной терапии постишемических неврологических осложнений при СД может стать применение цитокиновых препаратов. Цель исследования - изучение динамики показателей системы глутатиона, энергетического метаболизма и окислительной модификации белков (ОМБ) в тканях головного мозга крыс с экспериментальным СД при использовании церебропротектора метаболического действия пирацетама + тиотриазолина (тиоцетама) и цитокинового препарата - рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-1 (РАИЛ-1). РАИЛ-1 получен в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов путём генной трансформации бактерий E. coli. Исследования проводили на 40 белых крысах линии Вистар с массой тела 250-300 г, содержащихся в стандартных условиях вивария и распределённых на четыре группы по 10 животных в каждой. Первая группа - интактные животные, вторая - животные с экспериментальным СД (группа СД, контроль), третья - животные с СД, которым вводили пирацетам + тиотриазолин (тиоцетам) в дозе 500 мг/кг внутримышечно 1 раз в сутки (группа СД + тиоцетам), четвёртая - животные с СД, которым вводили РАИЛ-1 в дозе 7,5 мг/кг внутримышечно 1 раз в сутки (группа СД + РАИЛ-1). Животным первой и второй групп на протяжении исследования в соответствующем объёме внутримышечно вводили стерильный изотонический раствор натрия хлорида. Экспериментальный СД моделировали с помощью однократного подкожного введения водного раствора аллоксана моногидрата («Sigma», США) в дозе 150 мг/кг в виде 5% раствора в ацетатном буфере, водородный показатель (рН) составлял 4,5. Введение данного вещества осуществляли после предварительной 24-часовой депривации пищи при сохранённом доступе к воде. С целью формирования полного и стабильного СД животных содержали на протяжении 11 сут на стандартной диете. Уровень глюкозы крови определяли на 11-е сутки после введения аллоксана с помощью глюкометра «Optium Omega» («Abbot Diabetes Care Inc.», США). Для последующих исследований использованы только животные с повышенным уровнем глюкозы (>11 ммоль/л). Материалом для биохимических исследований служили фрагменты ткани головного мозга, находящиеся в области средней мозговой артерии и гомогенизированные в жидком азоте. Цитозольную фракцию выделяли методом дифференциального центрифугирования (15 000 g) при температуре +4 °C на 0,15-М фосфатном буфере (рН=7,8). Для изучения активности системы глутатиона в гомогенате головного мозга крыс определяли уровни окисленных и восстановленных форм глутатиона (флюорометрически [9]), активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы (спектрофотометрически [1]). Также в гомогенате мозга биохимическими методами определяли содержание продуктов окислительной модификации белка [по уровню альдегидных (альдегидфенилгидразонов) и карбоксильных (кетонфенилгидразонов) продуктов] [5] и состояние углеводно-энергетического обмена - по уровням адениловых нуклеотидов (аденозинтрифосфата, аденозиндифосфата и аденозинмонофосфата - АТФ, АДФ, АМФ), пирувата, лактата и малата [11]. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программы Statistica 6.0, сравнительный анализ в группах выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Статистически значимыми считали различия при р <0,05. В результате проведённых нами исследований при формировании аллоксанового СД было установлено нарушение системы глутатиона (табл. 1) - повышение относительно контрольных показателей содержания окисленных форм глутатиона в 2,7 раза (р <0,001) на фоне резкого снижения восстановленных форм глутатиона, что подтверждает формирование выраженных нарушений внутриклеточного пула глутатиона. В гомогенате мозга экспериментальных животных развитие СД сопровождалось также стабильным снижением активности энзимов тиол-дисульфидной системы - глутатионпероксидазы на 76% (р <0,001) и глутатионредуктазы на 79% (р <0,001) по сравнению с группой интактных животных (рис. 1). Ишемическое поражение ткани головного мозга крыс с аллоксан-индуцированным СД сопровождалось также увеличением в гомогенате мозга содержания маркёров ОМБ - альдегидфенилгидразонов и кетонфенилгидразонов в 2,2 и 2,3 раза соответственно (см. табл. 1). Развитие аллоксанового СД и формирование ангиопатий с постгипоксическими изменениями тканей привели к дисбалансу пула макроэргических фосфатов в ткани мозга контрольных животных (табл. 2) - отмечено значительное снижение уровней АТФ и АДФ (соответственно на 70 и 71%) на фоне существенного повышения содержания уровня АМФ (на 89%). Изучение показателей углеводного обмена (см. табл. 2) подтверждает в условиях аллоксан-индуцированного СД развитие декомпенсированного ацидоза в ткани мозга - повышение количества лактата в 2,8 раза на фоне снижения содержания малата и пирувата соответственно на 66 и 62%. На фоне введения пирацетама + тиотриазолина (тиоцетама) у крыс отмечено ингибирование образования окисленных форм глутатиона на 39% на фоне увеличения восстановленных форм глутатиона на 27% и повышения активности глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы на 32-37% относительно контроля. Применение пирацетама + тиотриазолина (тиоцетама) привело к снижению относительно контроля маркёров ОМБ, особенно кетонфенилгидразонов (на 36%), и стабилизации энергообеспечения тканей мозга экспериментальных животных - снизились показатели АМФ на 31%, повысились уровни АТФ и АДФ на 61 и 31% соответственно. Выраженность ацидоза в тканях мозга крыс с СД на фоне применения пирацетама + тиотриазолина (тиоцетама) также уменьшилась - отмечено статистически значимое повышение концентрации малата на 67% и снижение содержания лактата. Введение РАИЛ-1 животным с СД оказало наиболее выраженное влияние на состояние системы глутатиона - уровни окисленных форм глутатиона снизились в 2 раза по сравнению с контролем. При этом активно повышаются концентрации восстановленных форм глутатиона и восстанавливается активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы (почти 4-кратное увеличение, р <0,001), что превышает эффект пирацетама + тиотриазолина (тиоцетама) практически в 3 раза. Курсовое введение РАИЛ-1 способствовало стабилизации ОМБ и снижению их маркёров в ткани головного мозга более чем в 2 раза (р <0,001), при этом показатель кетонфенилгидразонов практически достиг показателей интактных животных. Применение РАИЛ-1 при постишемическом повреждении ткани мозга при аллоксан-индуцированном СД на фоне выраженного снижения АМФ (на 53%) привело к стабильному повышению относительно контрольной группы уровней АТФ и АДФ в 3 раза. Очевидно, применение РАИЛ-1 привело к увеличению синтеза АТФ за счёт аэробного и анаэробного путей окисления, о чём свидетельствует повышение содержания малата и пирувата более чем в 2 раза, количество лактата при этом снижается на 58% по сравнению с уровнем контрольных животных. Влияние РАИЛ-1 на большинство показателей углеводно-энергетического обмена превышает активность пирацетама + тиотриазолина (тиоцетама). Таким образом, при ишемическом поражении ткани мозга на модели аллоксан-индуцированного СД сдвиг равновесия системы глутатиона (снижение активности глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы и уровней восстановленных форм глутатиона на фоне значительного роста концентрации окисленных форм) сопровождается дисбалансом энергетического метаболизма и выраженными процессами ОМБ. Подобные патобиохимические изменения приводят к существенным функциональным изменениям в клетках и часто бывают необратимыми. Основная причина метаболических изменений при СД - абсолютный или относительный недостаток инсулина, который в физиологических условиях обеспечивает метаболические внутри- и внеклеточные процессы. При СД дефицит инсулина приводит к нарушениям обмена углеводов, жиров и белков, провоцирует гипергликемию и энергодефицит, активацию синтеза активных форм кислорода и свободных радикалов. Чрезмерное образование активных форм кислорода (супероксид-радикала, гидроксил-радикала, NO-радикала, пероксинитрита) играет ключевую роль в развитии оксидативного и нитрозирующего стресса и вызывает повреждение макромолекул. Повышение содержания активных форм кислорода стимулирует синтез транскрипционного фактора, индуцируемого при гипоксии (HIF - от англ. Hypoxia-inducible Factor), активацию HIF-1-зависимых генов, синтез провоспалительных цитокинов (в том числе интерлейкина-1) и формирует порочный круг вторичных повреждений [3]. Метаболизм оксида азота (NO) служит важным процессом адаптации тканей головного мозга к гипоксии. При гипоксии мозга в течение нескольких секунд уровень NO резко повышается. Кроме того, синтезируемый в ответ на гипоксию интерлейкин-1 стимулирует экспрессию в глиальных клетках индуцибельной NO-синтазы, что ведёт к гиперпродукции NO и токсическим эффектам его избыточных количеств [12]. Образуется пероксинитрит, нитрозилирующий в митохондриях цитохром С, что приводит к изменению его функций и способствует открытию неселективной гигантской поры митохондрий и формированию митохондриальной дисфункции [13]. Митохондриальная дисфункция является базисным механизмом энергетических нарушений и коррелирует с фазными изменениями в содержании адениловых нуклеотидов (АТФ, АДФ и АМФ), что приводит к формированию постгипоксического метаболического дисбаланса и опережает изменения других функционально-метаболических показателей жизнедеятельности клетки [10]. В период стадии энергетических нарушений происходят нарушения углеводного обмена. Снижение при тканевой гипоксии образования АТФ в цикле Кребса приводит к компенсаторной активации альтернативных путей образования энергоёмких фосфатов (в том числе анаэробного гликолиза) и развитию метаболического ацидоза. Внутриклеточный ацидоз оказывает непосредственное цитотоксическое действие - угнетает метаболические реакции и ионный транспорт, что приводит к дальнейшему углублению оксидативного стресса, синтезу чрезмерного количества NO и активации внутриклеточных ферментов. Кроме того, ацидоз изменяет свойства мембран, вызывает их «рыхлость». Это повышает проницаемость эндотелия и нейронов и приводит к повышению внутриклеточного осмотического давления, набуханию клеток и сдавлению ими окружающих тканей и микроциркуляторного русла, что также ухудшает состояние нейронов в зоне ишемии [12, 13]. В условиях гипергликемии накопление продуктов перекисного окисления способствует взаимодействию глюкозы с аминогруппами белков, усилению их гликозилирования и окисления, что приводит к снижению активности и даже полной инактивации ферментов антиоксидантной защиты. Ключевую роль в толерантности нейронов головного мозга к ишемии играет одна из ведущих антиоксидантных систем в организме - система глутатиона. Последний непосредственно либо путём ферментативных реакций эффективно защищает клетки от свободных радикалов и других реактивных разновидностей кислорода, например гидроксильного радикала, липид-пероксильного радикала, пероксинитрита и перекиси водорода. Также глутатион принимает участие в функционировании энзимов глутатионредуктазы/глутатионпероксидазы, играющих важную роль в поддержании внутриклеточного окислительно-восстановительного гомеостаза [7]. Конкурентно связываясь с NO, глутатион образует комплекс в виде S-нитрозоглутатиона, формирующий депо эндогенного NO. Это объясняет как взаимную регуляцию пула эндогенного оксида азота и внутриклеточного глутатиона, так и специфическое цитопротективное действие последнего - предотвращение связывания молекулы NO с супероксидом препятствует образованию пероксинитрита и блокирует его возможные нейротоксические эффекты. В то же время доказано, что дефицит внутриклеточной системы глутатиона способствует окислительному напряжению, которое играет ключевую роль при многих заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера1, болезнь Паркинсона, инсульт, инфаркт миокарда, СД и др. [8]. Снижение уровня восстановленных форм глутатиона в тканях мозга, обнаруженное нами у крыс с аллоксан-индуцированным СД, может быть следствием нарушения его синтеза, связанного с патологическим изменением тканевого дыхания, обусловленным гипоксией и СД. Это в свою очередь приводит к уменьшению уровня АТФ, необходимого для синтеза глутатиона. Кроме того, недостаток восстановленных форм глутатиона в условиях ишемии не способен блокировать взаимодействие NO с супероксид-анионом и последующим образованием пероксинитрита. Прерывание патогенетического постгипоксического каскада на ранних этапах, в том числе на этапе формирования дисфункции антиоксидантной системы глутатиона, позволит добиться максимального протективного эффекта при лечении СД. Стабилизация функционирования антиоксидантной системы глутатиона и глутатионпероксидазы/глутатионредуктазы позволит защитить ткани головного мозга от проявлений оксидативного и нитрозирующего стресса: предупредить формирование митохондриальной дисфункции, энергетического дисбаланса и иных последствий ишемии. ВЫВОДЫ 1. Постишемическое поражение ткани головного мозга крыс на модели аллоксанового диабета сопровождалось дискордантными сдвигами равновесия системы глутатиона (снижением активности глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы и содержания восстановленного глутатиона на фоне значительного роста количества его окисленных форм), пула макроэргических фосфатов (снижение уровня аденозинтрифосфата и аденозиндифосфата на фоне выраженного повышения показателей аденозинмонофосфата) и увеличением в гомогенате мозга концентрации маркёров окислительной модификации белков - альдегидфенилгидразонов и кетонфенилгидразонов. 2. Курсовое применение пирацетама + тиотриазолина (тиоцетама) и рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-1 способствовало восстановлению энергетического метаболизма и снижению активности реакций свободнорадикального окисления в тканях головного мозга крыс с сахарным диабетом. Активность рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-1 в отношении стабилизации системы глутатиона и ингибирования проявлений оксидативного и нитрозилирующего стресса превышает таковые пирацетама + тиотриазолина (тиоцетама). Таблица 1 Суммарные показатели окисленных (GSSG) и восстановленных (GSH) форм глутатиона и содержание альдегидных (АФГ) и карбоксильных (КФГ) продуктов в тканях головного мозга крыс с аллоксановым диабетом (М±m) Группа животных GSSG, мМ/г белка GSH, мМ/г белка АФГ, у.е./г белка КФГ, у.е./г белка Интактные (1) 0,27±0,05 4,49±0,91 1,49±0,16 1,01±0,09 СД (2) 0,75±0,15 0,56±0,1 3,44±0,49 2,26±0,15 СД + пирацетам + тиотриазолин (тиоцетам) (3) 0,46±0,14 0,71±0,11 2,48±0,22 1,44±0,23 СД + РАИЛ-1 (4) 0,33±0,04 3,17±0,29 1,67±0,22 0,98±0,18 р1-2 <0,001 р1-3 <0,001 р1-4 >0,05 р2-3 >0,05 р2-4 <0,001 р3-4 <0,001 р1-2 <0,001 р1-3 <0,001 р1-4 <0,001 р2-3 <0,001 р2-4 <0,001 р3-4 <0,01 р1-2 <0,001 р1-3 <0,001 р1-4 >0,05 р2-3 <0,001 р2-4 <0,001 р3-4 <0,001 р1-2 <0,001 р1-3 <0,001 р1-4 >0,05 р2-3 <0,001 р2-4 <0,001 р3-4 <0,001 Примечание: СД - сахарный диабет; РАИЛ-1 - рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-1. Рис. 1. Активность глутатионпероксидазы (ГП) и глутатионредуктазы (ГР) в тканях головного мозга крыс с сахарным диабетом (СД). Интакт - интактные крысы; РАИЛ-1 - рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-1. Статистически значимые отличия (р <0,05): И - относительно интактных крыс, К - относительно крыс с сахарным диабетом, Т - относительно крыс группы СД+Тиоцетам. Супрун_А.jpg Таблица 2 Показатели энергетического метаболизма (АТФ, АДФ, АМФ) и углеводного обмена (малат, лактат, пируват) в тканях головного мозга крыс с аллоксановым сахарным диабетом (М±m) Группа животных АТФ, мкмоль/г ткани АДФ, мкмоль/г ткани АМФ, мкмоль/г ткани Лактат, мкмоль/г ткани Малат, мкмоль/г ткани Пируват, мкмоль/г ткани Интактные (1) 3,62±0,17 0,43±0,01 0,10±0,02 2,42±0,09 0,75±0,08 0,19±0,06 СД (2) 1,09±0,15 0,13±0,05 0,19±0,06 6,86±1,02 0,26±0,07 0,07±0,02 СД + пирацетам + тиотриазолин (тиоцетам) (3) 1,77±0,31 0,16±0,07 0,13±0,02 6,19±0,42 0,43±0,09 0,09±0,01 СД + РАИЛ-1 (4) 3,25±0,39 0,37±,005 0,09±0,01 2,89±0,43 0,64±0,09 0,16±0,07 р1-2 <0,001 р1-3 <0,001 р1-4 <0,05 р2-3 <0,001 р2-4 <0,001 р3-4 <0,001 р1-2 <0,001 р1-3 <0,001 р1-4 <0,01 р2-3 >0,05 р2-4 <0,001 р3-4 <0,001 р1-2 <0,001 р1-3 <0,01 р1-4 >0,05 р2-3 <0,01 р2-4 <0,001 р3-4 <0,001 р1-2 <0,001 р1-3 <0,001 р1-4 >0,05 р2-3 <0,05 р2-4 <0,001 р3-4 <0,001 р1-2 <0,001 р1-3 <0,001 р1-4 <0,01 р2-3 <0,001 р2-4 <0,001 р3-4 <0,001 р1-2 <0,001 р1-3 <0,001 р1-4 >0,05 р2-3 >0,05 р2-4 <0,001 р3-4 <0,001 Примечание: АТФ - аденозинтрифосфат; АДФ - аденозиндифосфат; АМФ - аденозинмонофосфат; СД - сахарный диабет; РАИЛ-1 - рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-1. 1Примечание редакции. В русскоязычной литературе устоялось написание «Альцгеймер», однако речь о немецком враче Альцхаймере (Aloise Alzheimer, 1864-1915).

Об авторах

Алексей Сергеевич Супрун

Национальный фармацевтический университет, г. Харьков, Украина

Email: alexey_suprun@rambler.ru

Игорь Фёдорович Беленичев

Запорожский медицинский университет, Украина

Список литературы

Дополнительные файлы